XPO1基因突變的慢性淋巴細胞白血病臨床特征及預后研究

韓宜霏，許張娣，吳佳竹，孔祎琳，潘必慧，李 悅，梁金花，申浩睿，尹 華，王 莉，李建勇，徐 衛

南京醫科大學第一附屬醫院血液科，江蘇 南京 210029

慢性淋巴細胞白血?。╟hronic lymphocytic leukemia，CLL）是一種慢性B 淋巴細胞克隆增殖性疾病，表現為CD5+的成熟B淋巴細胞在外周血、骨髓、淋巴結和脾臟中聚集，具有顯著的遺傳和臨床異質性［1］。近年來，隨著分子靶向治療的飛速發展，如布魯頓酪氨酸蛋白激酶（Bruton tyrosine kinase，BTK）抑制劑、磷酸肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）抑制劑、BCL-2 抑制劑等，極大地改善了患者的預后，CLL 的治療由傳統免疫化療時代逐步進入無化療時代［2］，但仍有部分患者會出現治療耐藥，預后相對較差。而大規模的測序研究包括二代測序（next-generation sequencing，NGS）越來越多地應用于血液系統腫瘤研究，極大程度上增加了入們對CLL 基因組改變的認識，也逐步揭示了由克隆異質性導致的臨床異質性［3］。

目前CLL中多個再現突變的驅動基因已被報道，包括TP53、NOTCH1、SF3B1、BIRC3、MYD88、ATM、XPO1、FBXW7 和POT1 等，并確定克隆演變是驅動疾病進展的重要機制［4-6］。XPO1基因突變存在于多種血液系統腫瘤中，尤其是B細胞淋巴瘤和白血病，包括原發縱隔大B 細胞淋巴瘤（primary mediastinal large B-cell lymphoma，PMBCL）、經典型霍奇金淋巴瘤（classical Hodgkin lymphoma，cHL）、彌漫大B細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）和CLL［7］。在西方國家，XPO1 基因在CLL 中的突變頻率為2.4%～8%［8-9］，低于侵襲性B 細胞淋巴瘤。XPO1 基因位于2 號染色體長臂（2p15），其編碼的XPO1 蛋白是重要的核輸出蛋白，介導含有核輸出信號（nuclear export-signal，NES）結構的蛋白由細胞核向細胞質的轉運，對維持細胞穩態是必不可少的［10-11］。已知XPO1 常見的熱點突變為E571K 或E571G，處于NES 結構域相鄰位置［7］。多項研究表明XPO1 E571K 突變可能促進B 細胞淋巴瘤的發生發展［12-13］。鑒于XPO1 基因突變在CLL 致病及發生Richter 綜合征過程中具有重要地位，本研究對本中心攜帶XPO1 基因突變患者的資料進行回顧性分析，增加對我國攜帶XPO1基因突變的CLL的認識，以期為臨床診治提供幫助。

1 對象和方法

1.1 對象

本回顧性研究納入了2006 年11 月—2022 年3 月于南京醫科大學第一附屬醫院血液科確診CLL的543 例患者。納入標準：年齡≥18 歲；符合《中國慢性淋巴細胞白血病/小淋巴細胞淋巴瘤的診斷與治療指南（2018 年版）》［14］的診斷標準；同意參加本研究者。排除標準：樣本資料嚴重缺失。所有患者均進行外周血/骨髓形態檢測、骨髓病理免疫組織化學染色、流式細胞術免疫分型、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）、免疫球蛋白（immunoglobulin，IG）重鏈基因重排和CpG+白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）刺激的染色體核型分析等檢測。同時，采用PCR法檢測免疫球蛋白重鏈可變區基因（immunoglobulin heavy-chain variable region，IGHV）突變狀態和NGS 檢測相關基因突變狀態。CLL 診斷標準、分期、CLL 國際預后指數（CLL-international prognostic index，CLL-IPI）評分和療效評估均嚴格參照《中國慢性淋巴細胞白血病/小淋巴細胞淋巴瘤的診斷與治療指南（2018年版）》［14］。本研究已獲得南京醫科大學第一附屬醫院倫理委員會審核批準（倫理號：2023-SRFA-272）。所有患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 XPO1基因檢測方法

①樣本類型：所有患者均在獲得知情同意后抽取新鮮外周血或骨髓液標本。②檢測方法：提取單個核細胞，進行分選。采用PCR擴增法檢測。③檢測深度：1500*。④變異等位基因頻率（variation allele frequency，VAF）計算：VAF（%）=突變reads/（突變reads+野生reads）×100%。

1.2.2 隨訪及預后

本研究隨訪截止時間為2022 年6 月。隨訪方式主要為門診及住院病歷查閱和電話咨詢。至首次治療時間（time to first treatment，TTFT）定義為自明確診斷到開始接受治療的時間；無進展生存時間（progression-free survival，PFS）定義為自首次治療到疾病進展的時間或末次隨訪時間；總生存時間（overall survival，OS）定義為自明確診斷到任何原因導致死亡或隨訪終點的時間。

1.3 統計學方法

采用SPSS 27.0軟件進行統計學分析，計數資料用頻數和構成比［n（%）］表示。計量資料用中位數（四分位數）［M（P25，P75）］表示。計量資料的組間比較采用t檢驗分析。生存曲線由Kaplan-Meier 方法構建，各組患者生存曲線比較使用Log-rank 檢驗。Graphpad Prism 9.4 軟件進行生存曲線繪圖。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病例特征

在543例CLL患者中，根據NGS檢測時狀態，分為初診未治（treatment native，TN）患者368例，復發/難治（relapsed/refractory，R/R）患者175 例。15 例（2.8%）患者XPO1基因突變檢測陽性，TN、R/R患者的突變率分別為2.4%（9/368）及3.4%（6/175），其中1例患者TN和R/R時均進行了NGS檢測，且均檢測出XPO1 基因突變。在15 例XPO1 突變患者中，男性占66.7%（10/15），女性占33.3%（5/15）。TN和R/R患者的臨床特征見表1。結果顯示，無論TN 還是R/R 患者，男性比例均多于女性（TN：55.6%vs.44.4%；R/R：83.3%vs.16.7%），且疾病大多處于RaiⅢ/Ⅳ期，Binet B/C 組。TN 組中位外周血白細胞絕對計數為24.5（8.9，52.7）×109個/L、淋巴細胞絕對計數為17.4（5.6，44.0）×109個/L、血紅蛋白為86（76，116）g/L、血小板計數為191（118，200）×109個/L，中位β2-微球蛋白（β2-microglobulin，β2-MG）為3.0（2.9，4.2）mg/L和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）為294（198，329）U/L；R/R組中位外周血白細胞計數為28.4（20.2，56.2）×109個/L、淋巴細胞計數為24.1（13.2，52.0）×109個/L、血紅蛋白110（91，118）g/L、血小板計數為92（60，139）×109個/L，中位β2-MG 為4.8（3.5，7.6）mg/L和LDH為256（165，388）U/L。

2.2 XPO1突變位點及變異等位基因頻率（variation allele frequency，VAF）分析

15 例CLL 患者攜帶XPO1 突變基因，均為錯義突變，且存在熱點突變，中位VAF 為35.4%。66.7%的XPO1基因突變發生在外顯子15的E571位點，分別為E571K（50%）、E571G（30%）、E571Q（10%）和E571V（10%）（圖1A、B）。同時，本研究發現，R/R CLL組相較于TN CLL組，XPO1的VAF略高，但兩者差異并無統計學意義（圖1C）。此外，在CLL患者中XPO1突變并不是一個孤立的克隆性突變，XPO1突變常伴隨TP53、KMT2D、SF3B1、NOTCH1 和ATM 等基因突變同時發生。圖1D～H 展示了在XPO1 突變伴隨TP53、KMT2D、SF3B1、NOTCH1 和ATM 基因突變同時發生的患者中，XPO1 與伴隨突變基因VAF的比較。鑒于XPO1 基因編碼的XPO1 蛋白具有重要的核輸出功能，而p53 蛋白是其轉運的重要核輸出蛋白之一，因此，本研究進一步比較了XPO1基因突變與TP53 基因突變同時出現時的患者臨床特征。結果表明，TP53 與XPO1 基因突變同時發生多見于R/R 組（TN：11.1%；R/R：50.0%），在TP53 與XPO1基因突變同時發生的患者中，XPO1的VAF高于TP53 的VAF，但兩者差異并無統計學意義（圖1D）。1 例患者在R/R 時XPO1 VAF 水平相比TN 時升高，且出現了新的基因突變（ATM、KMT2D 和DDX3X突變）（圖1I）。

圖1 XPO1基因突變位點和基因突變的VAF Figure 1 XPO1 mutation locus and VAF of gene mutations

2.3 XPO1突變患者的分子和遺傳學特征

在15 例患者中，11 例（73.3%）患者IGHV 無突變，4 例（26.7%）患者IGHV 有突變，4 例（26.7%）患者染色體為復雜核型（≥3 個異常染色體）。發生XPO1 基因突變患者的分子和遺傳學特征見表2。在TN 組中，XPO1 基因突變常伴隨NOTCH1、SF3B1、KMT2D 和ARID1A 基因突變發生，25.0%的患者FISH 可見ATM 缺失、37.5%的患者可見13q 缺失，并無患者存在17p 缺失。而在R/R 組中，XPO1基因突變常伴隨TP53、KMT2D 和ATM 基因突變發生，且60.0%的患者FISH 可見ATM 缺失和13q 缺失，40.0%的患者可見17p 缺失。TN 組中位突變數目為4，R/R組中位突變數目為5（圖2）。

圖2 15例攜帶XPO1突變的CLL患者隊列中基因突變、分子和遺傳學特征分布Figure 2 Distribution of gene mutations，molecular and genetic characteristics in the cohort of 15 CLL patients with XPO1 mutations

表2 15例XPO1突變CLL患者遺傳學和分子特征Table 2 Genetic and molecular characteristics of 15 CLL patients with XPO1 mutations

2.4 XPO1突變對治療及預后的影響

在15 例XPO1 突變患者中，除3 例未達到治療指征，其余12例已經接受治療。對于9例TN患者，3例患者目前處于觀察等待期，3例患者已接受治療并獲得部分緩解（partial response，PR），2 例患者治療后獲得完全緩解（complete response，CR），1 例患者治療后轉為難治。而對于6 例R/R 患者，在疾病進展后，均進行BTK抑制劑（伊布替尼或澤布替尼）治療，4例患者獲得緩解；2例患者疾病控制不佳，其中1例患者在澤布替尼治療耐藥后出現中樞受累，另1 例患者則發生了Richter 綜合征，均已死亡（圖3A）。截至2022年6月，XPO1突變組患者中位TTFT為1.8個月，中位PFS為19.8個月，中位OS為40.0個月；XPO1 無突變組患者中位TTFT 為8.1 個月，中位PFS 為32.5 個月，中位OS 為49.8 個月。兩者TTFT（P=0.633）、PFS（P=0.394）和OS（P=0.799）差異均無統計學意義（圖3B～D）。TN 時XPO1 突變組和無突變組采用BTK 抑制劑化療的總反應率（overall response rate，ORR）為100.0%vs.80.5%（P=0.651）。R/R 時XPO1 突變組和無突變組采用BTK 抑制劑化療的ORR 為66.7%vs.56.0%（P=0.927）。另外，26.7%（4/15）的患者發生了Richter綜合征。

圖3 15例攜帶XPO1突變的CLL患者治療情況、療效評估、生存結局和預后等特征分布Figure 3 Distribution of treatment status，efficacy evaluation，survival outcome and prognosis of 15 CLL patients with XPO1 mutations

3 討論

XPO1 基因突變廣泛存在于各種實體瘤和血液系統腫瘤中，而重現性E571位點突變多發生在B細胞惡性腫瘤中。CLL是一種常見的B淋巴細胞克隆增殖性疾病。2011 年，Puente 等［9］通過全外顯子測序首次揭露了重現性XPO1基因突變在CLL中的致病作用。目前國外已有針對XPO1 基因突變與CLL患者臨床特征的相關性研究，但國內尚缺乏相關報道。國外研究顯示，XPO1 基因突變頻率為2.4%～8%［8-9］。在本中心數據中，XPO1突變也是一個低頻突變，突變率低于3%，略低于國外。此外，XPO1基因突變均為錯義突變，且中位VAF為35.4%。

目前越來越多的突變復雜性/腫瘤突變負荷（tumor mutation burden，TMB）評估將XPO1突變納入其中，通過評估TMB來預測CLL患者預后。如2018年Nadeu 等［15］將28 個CLL 相關驅動基因測序，并說明TMB 與CLL 患者較短的無治療生存（treatment-free survival，TFS）相關。2021年Chauzeix等［16］研究顯示ATM、SF3B1、NOTCH1、XPO1、MYD88、TNFAIP3 和TP53組成的基因模型可以較好預測較短的TFS，甚至對Binet A期的患者也能準確預測。由此可見XPO1基因突變在CLL患者預后評估中具有重要意義。

在CLL 患者中，XPO1 突變與高危預后指標相關。2015 年西班牙的一項2 493 例CLL 隊列中，XPO1突變和TP53突變一樣，存在于ATM缺失患者中，該類患者預后不佳［17］。Puente等［9］也發現XPO1突變主要存在于IGHV無突變的CLL患者。本研究結果與之一致，絕大多數XPO1 基因突變患者為IGHV無突變，其TTFT相比IGHV有突變患者更短，且60%的R/R患者存在ATM缺失。本研究還發現，R/R 患者一線治療采用傳統免疫化療，但均未獲得持續緩解。這部分患者末次治療選用BTK抑制劑，2/3 患者獲得緩解，未獲得緩解的2 例患者中1 例同時伴隨TP53 和BTK（C481S）突變。而TN 患者一線治療采用BTK 抑制劑聯合/不聯合化療的患者均獲得緩解，這也提示以BTK抑制劑為基礎的治療對攜帶XPO1基因突變的患者有效。

關于XPO1 基因突變的預后意義，目前尚有爭議。Jain等［8］認為XPO1基因突變是低頻突變，且對伊布替尼有效，可能并不是CLL 的不良預后因素。而2021年歐洲血液協會（European Hematology Association，EHA）會議報道了一項4 674 例CLL 隊列的回顧性研究，則認為XPO1 突變與TTFT 較短相關。2023年Moia等［18］最新研究顯示，在僅納入早期CLL患者的組中，XPO1 突變是TTFT 較短的預測因子。XPO1 突變的CLL 原代細胞的染色質可及性相比XPO1 野生型的CLL 原代細胞更高，可及性增加的染色質區域富含B 細胞受體（B cell receptor，BCR）信號通路中轉錄因子的結合位點，如NF-κB等。在轉錄層面上，XPO1 突變的CLL 原代細胞還存在MYB和MIR1HG等基因的過表達，這些基因會刺激BCR 的活性。在本研究中，CLL 患者中位TTFT 為5.2個月，相對較短，這與EHA會議報道和Moia最新研究一致。XPO1基因突變預后意義差異可能與以下4 個因素相關：①XPO1 突變率檢測差異；②樣本量的差異；③隨訪時間的差異；④納入CLL 患者的亞組選擇。截至隨訪結束，6 例R/R XPO1 突變CLL患者中有2例患者在疾病進展后采用BTK抑制劑治療后仍出現疾病進展，1 例患者發生了Richter 綜合癥（表2 中P13 患者：IGHV 無突變、β2-MG 升高，分期晚，NGS 可見XPO1、ATM、ARID1A、KMT2D 和FBXW7基因突變），采用BTK 抑制劑聯合RTX 并未取得緩解；另1 例患者采用澤布替尼治療耐藥（表2中P12 患者：TP53 異常、β2-MG 升高，分期晚，NGS可見XPO1、TP53、BTK、SF3B1 和MGA 基因突變），后出現中樞浸潤。2例患者均在短時間內死亡。因此盡管BTK 抑制劑對多數XPO1 突變患者有效，但仍有部分患者不能克服。此外，本研究注意到，15例CLL 患者中有4 例發生了Richter 綜合癥，3 例在TN時確診，其中2例分別采用BTK抑制劑/BCL-2抑制劑聯合化療并序貫自體造血干細胞移植，獲得完全緩解。另1 例患者即將啟動治療。1 例在R/R 時確診，采用BTK抑制劑聯合RTX并未取得緩解。

一些研究表明XPO1 是CLL 的有效靶標，且核輸出蛋白抑制劑塞利尼索可以延緩CLL 模型小鼠的疾病進展，增加總體生存率［19-20］。也有研究認為，XPO1 突變可能會增加腫瘤細胞對XPO1 抑制劑的敏感性，從而增加XPO1 抑制劑的細胞毒作用［7］。Hing 等［21］研究發現塞利尼索對伊布替尼耐藥和攜帶BTK C481S 位點突變的CLL 模型小鼠有效，同時可以和伊布替尼具有協同作用，可以增加小鼠的總體存活率。對于攜帶XPO1 突變的R/R 患者，如BTK 抑制劑單藥治療效果不佳，聯合XPO1 抑制劑或許是一種新型治療模式。

目前而言，XPO1 突變在CLL 中似乎并不能提示更差的預后，其為低頻突變，且常伴隨其他基因突變。在R/R 患者中，XPO1 突變發生率高于TN 患者。對于極其難治患者及發生Richter 綜合征的患者，XPO1抑制劑聯合靶向治療或許是治療的新選擇。