CCR8在卵巢癌浸潤性Treg上的表達與意義

陶子琦，茅曄鵬，劉書娜，婁鑒芳，付 鑫，張 磊，嚴麗娜，3，王 婷，王 芳*

1南京醫科大學第一附屬醫院檢驗學部，2國家醫學檢驗臨床醫學研究中心分中心，江蘇 南京 210029；3南京市婦幼保健院婦科，江蘇 南京 210004

卵巢癌是最致命的婦科惡性腫瘤，由于其發病隱匿，進展迅速，且缺乏有效的早期篩查手段，多數患者確診時已為晚期。雖然免疫治療是卵巢癌治療的一個有前途的新領域，多種有希望的免疫治療手段已被研發，但仍然需要克服免疫抑制性腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）以提高免疫治療的療效［1-3］。TME 中的免疫抑制是促進腫瘤生長與轉移最為重要的前提條件之一，是腫瘤免疫治療的主要障礙之一［4］。免疫抑制性細胞及抑制因子是腫瘤免疫抑制微環境的重要組成部分，調節性T 細胞（regulatory T cell，Treg）是其中的重要一員，通過不依賴于細胞接觸（分泌抑制性細胞因子）或依賴于細胞接觸（調節抗原呈遞細胞功能和介導靶細胞的溶解或凋亡）的機制發揮免疫抑制功能，阻礙腫瘤特異性免疫反應［5-7］。趨化因子-趨化因子受體（C-C motif chemokine receptor，CCR）信號介導的募集作用是腫瘤內Treg浸潤的主要機制。研究顯示有多個CCR 通過與趨化因子配體（chemokine ligand，CCL）的結合，如CCR4-CCL17/22、CCR5-CCL5、CCR8-CCL1/18 和CCR10-CCL28 等，參與招募Treg到TME［8-11］。與正常組織駐留及外周Treg 相比，人肺癌、乳腺癌及大腸癌等腫瘤浸潤性Treg上選擇性高表達CCR8［12］。而CCR8 在卵巢癌腫瘤浸潤性Treg 上是否高表達，CCR8+Treg 是否是卵巢癌腫瘤浸潤Treg 的主要類型，相關問題尚未明確。因此，本研究以小鼠卵巢上皮癌細胞ID8構建的卵巢癌荷瘤C57BL/6小鼠模型為對象，分析CCR8在卵巢癌腫瘤浸潤性Treg中的表達，及其對Treg分化的作用。

1 對象和方法

1.1 材料

C57BL/6小鼠卵巢上皮癌細胞ID8（深圳豪泰生物公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；青霉素-鏈霉素溶液、紅細胞裂解液和DMSO溶液（上海碧云天生物公司）；高濃度基質膠（南京優寧維生物公司）；RPMI 1640 培養基（Hyclone 公司，美國），X-Vivo 15培養基（Lonza 公司，瑞士）；小鼠初始CD4+T Cell 提取磁珠（Miltenyi 公司，德國）；AZ084（Med Chem Express 公司，美國）；CD3e 單抗、CD28 單抗（eBioscience 公司，美國）；重組鼠IL-2（Peprotech 公司，美國）；TGF-β（R&D 公司，美國）；PE/Cyanine7 標記的抗小鼠CD45、Brilliant Violet 510 標記的抗小鼠CD3、FITC 標記的抗小鼠CD4、PE 標記的抗小鼠Foxp3、Brilliant Violet 421 標記的抗小鼠CCR8、APC標記的抗小鼠細胞毒性T 淋巴細胞抗原4（cytotoxic T-lymphocyte antigen 4，CTLA-4）、APC 標記的抗小鼠程序性細胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD1）、APC標記的抗小鼠淋巴細胞激活基因3（lymphocyte-activation gene 3，LAG-3）、APC標記的抗小鼠可誘導的T 細胞共刺激分子（inducible T cell costimulator，ICOS）等流式抗體（Biolegend 公司，美國）；Ⅳ型膠原酶（Gibco 公司，美國）；Percoll 細胞分離液、透明質酸酶、DNA酶Ⅰ、谷氨酰胺（Sigma公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 TCGA數據庫、GTEx數據庫分析

下載426 例TCGA 數據庫中上皮性卵巢癌組織（https：//portal.gdc.cancer.gov）與88 例GTEx 數據庫中卵巢正常組織（http：//gepia.cancer-pku.cn/）的RNA-seq 數據，以|Log2TPM|>1 和P＜0.05 為顯著差異標準對趨化因子CCL1、CCL18 作差異分析，并基于R 包-GSVA［1.46.0］中提供的ssGSEA 算法，計算各類免疫細胞：Treg、中性粒細胞、B 細胞、肥大細胞、Th17 細胞、Tgd細胞的浸潤比例，使用Spearman統計方法分析基因CCR8［ENSG00000179934.7］與各免疫細胞的相關性，使用R包-ggplot2［3.3.6］對分析結果進行可視化。

1.2.2 小鼠皮下成瘤實驗

本動物實驗獲得南京醫科大學實驗動物福利倫理委員會批準（IACUC-2303001）。20 只C57BL/6小鼠購自南京集萃藥康生物科技公司。5×106個ID8細胞在復蘇后經過3次傳代培養，制備成100 μL細胞懸液，同時添加100 μL 20 mg/mL膠原蛋白的高濃度基質膠懸液，混勻后接種在小鼠腋下至側腹的皮下部位，接種之后，小鼠仍置于SPF環境繼續生長21 d后CO2窒息處死，取脾臟、腫瘤組織、外周血樣本。

1.2.3 小鼠樣本處理

將脾臟組織碾磨后制備成單細胞懸液，使用紅細胞裂解液分別分離出脾臟和外周血樣本中的單個核細胞。將新鮮的小鼠皮下卵巢腫瘤組織剪成1 mm3的小塊，在配制的原代組織消化液［RPMI-1640 培養基+膠原酶Ⅳ（1 μg/mL）+透明質酸酶（100 ng/mL）+DNA 酶Ⅰ（50 U/mL）+谷氨酰胺（1 mmol/L）+1%青霉素-鏈霉素溶液］中37 ℃消化1 h 后40 μm 濾器過濾，將過濾后細胞懸液使用70%Percoll、30%Percoll梯度離心，得到單個核細胞懸液。

1.2.4 流式檢測小鼠樣本中Treg細胞上CCR8以及免疫檢查點相關蛋白的比例

將小鼠脾臟、外周血、腫瘤組織的單個核細胞懸液鋪在流式管底，加入PE/Cyanine7標記的抗小鼠CD45、Brilliant Violet 510 標記的抗小鼠CD3、FITC標記的抗小鼠CD4、PE 標記的抗小鼠Foxp3、Brilliant Violet 421 標記的抗小鼠CCR8、APC 標記的抗小鼠CTLA-4、APC標記的抗小鼠PDI、APC標記的抗小鼠LAG-3、APC 標記的抗小鼠ICOS 等流式抗體，經孵育、破核、洗滌、固定后使用Beckman Cytoflex流式儀進行檢測。

1.2.5 體外誘導小鼠Treg細胞實驗

雌性C57BL/6 小鼠，6～8 周齡，體重18～20 g。2%戊巴比妥麻醉小鼠，無菌操作下取脾臟，碾磨勻漿分離脾臟細胞，裂解紅細胞后得到單個核細胞，以磁珠提取初始CD4+T 細胞。圓底96 孔板以4 μg/mL CD3 單抗4 ℃包被過夜后，加入15 ng/mL hTGF-β、30 U/mL鼠IL-2、2 μg/mL CD28單抗，將初始CD4+T細胞以X-Vivo 15培養基調至1×106個/mL鋪在圓底96孔板中，隔天半定量換液并傳代。AZ084是一種強效的CCR8 變構拮抗劑，其Ki 值為0.9 nmol/L，以DMSO作為溶劑溶解10 mg AZ084粉末，將其制備為AZ084儲存液（5 mmol/L）。依據不同處理方式分為AZ084組、DMSO組與MOCK組。AZ084組在誘導過程中每日加入5 μmol/L 的CCR8 變構拮抗劑AZ084，DMSO組在誘導過程中每日加入與AZ084組同體積的DMSO溶液，MOCK組為空白對照，只誘導分化不做其他任何處理。誘導培養3～5 d，流式檢測CD4+Foxp3+Treg細胞的比例。

1.3 統計學方法

所有數據使用SPSS 25.0 統計軟件進行數據分析，各組數據均以均值±標準差（±s）表示，兩組間的比較，符合正態分布的數據用獨立樣本t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，非正態性分布數據采用Mann-Whitney 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 趨化因子CCL18 在卵巢癌與癌旁組織中的表達存在顯著差異

利用TCGA 與GTEx 公共數據庫獲取上皮性卵巢癌組織以及卵巢正常組織的RNA-seq 數據，分析CCL1 mRNA 與CCL18 mRNA 在卵巢癌中的表達情況，發現CCL1基因在人類卵巢癌組織（n=426）與卵巢正常組織（n=88）中無明顯差異（圖1A），CCL18基因在人類卵巢癌組織中顯著上調（非配對樣本，P<0.05，圖1B）。同時對CCL1、CCL18 的受體CCR8 作免疫浸潤分析與Spearman相關性分析，繪制棒棒糖圖（圖2），結果顯示CCR8基因與卵巢癌浸潤的Treg細胞具有高相關性（R=0.592，P＜0.05）。

圖1 趨化因子CCL1 和CCL18 mRNA 在TCGA 上皮性卵巢癌組織數據集和GTEx卵巢正常組織數據集中的表達水平Figure 1 Chemokine mRNA expressions of CCL1 and CCL18 in epithelial ovarian cancer tissues of TCGA and normal ovarian tissues of GTEx

圖2 人卵巢癌免疫細胞與CCR8基因的Spearman 相關性分析Figure 2 Spearman correlation analysis between the CCR8 gene expression and immune cell infiltration in human ovarian cancer

2.2 CCR8 及免疫檢查點相關蛋白PD-1、CTLA-4、LAG-3、ICOS在卵巢癌小鼠模型的腫瘤組織、外周血及脾臟中Treg上的表達情況

采用CO2窒息法處死8 例C57BL/6 卵巢癌荷瘤小鼠，對其皮下瘤模型進行瘤體大小測量，根據公式V=1/2×a×b2（a為長軸，b為短軸）計算得出腫瘤體積為800～1 200 mm3（圖3）。采用流式細胞術（圖4）檢測8 例荷瘤小鼠的腫瘤組織（圖5）、外周血（圖6）、脾臟（圖7）的單個核細胞懸液中Treg 細胞上的CCR8表達，結果顯示小鼠腫瘤浸潤性的CCR8+Treg占總Treg的比例為（74.3±13.2）%，而在小鼠脾臟、外周血中分別為（44.0±8.5）%、（16.9±7.8）%，小鼠腫瘤中浸潤性CCR8+Treg 占總Treg 的比例顯著高于小鼠脾臟、外周血。小鼠外周血、脾臟、腫瘤中浸潤性CCR8+Treg 中PD-1+細胞亞群的比例分別為（16.4±8.8）%、（50.0±16.4）%、（80.0±12.4）%，LAG-3+細胞亞群的比例分別為（11.3±6.9）%、（19.6±11.7）%、（74.0±8.7）%，ICOS+細胞亞群的比例分別為（18.3±10.5）%、（20.9±7.5）%、（72.3±6.8）%，CTLA-4+細胞亞群的比例分別為（13.5±6.7）%、（26.1±16.9）%、（49.1±15.7）%。小鼠腫瘤浸潤性CCR8+Treg中PD-1+、LAG-3+、ICOS+、CTLA-4+細胞亞群的比例顯著高于脾臟和外周血（Mann-Whitney檢驗，P＜0.05，圖8）。

圖3 C57BL/6小鼠卵巢癌皮下瘤代表圖Figure 3 Representative images of subcutaneous tumors in C57BL/6 mice of ovarian cancer

圖4 小鼠模型來源樣本流式細胞術檢測方案Figure 4 A flow cytometry strategy for samples from the mouse model

圖5 小鼠卵巢癌腫瘤浸潤性CCR8+Treg細胞比例與表型流式檢測圖Figure 5 Proportion and phenotype of tumor infiltrating CCR8+Treg cells in mouse ovarian cancer tissues detected by flow cytometry analysis

圖6 小鼠外周血中CCR8+Treg細胞比例與表型流式檢測圖Figure 6 Proportion and phenotype of CCR8+Treg cells in mouse peripheral blood detected by flow cytometry analysis

圖7 小鼠脾臟中CCR8+Treg細胞比例與表型流式檢測圖Figure 7 Proportion and phenotype of CCR8+Treg cells in mouse spleens detected by flow cytometry analysis

圖8 小鼠腫瘤組織、脾臟、外周血中Treg細胞表型分析Figure 8 The phenotype analysis of Treg cells in mouse tumor tissues，spleens and peripheral blood

2.3 體外實驗中CCR8 拮抗劑抑制小鼠的初始CD4+ T細胞向Treg細胞的誘導分化

小鼠脾臟的初始CD4+T 細胞向Treg 細胞誘導分化，結果顯示AZ084 組、DMSO 組、MOCK 組的Treg 細胞分化比例分別為（29.1±8.8）%、（52.2±9.6）%、（70.6±16.7）%，AZ084 組與DMSO 組、MOCK組差異均有統計學意義（P＜0.05，圖9）。

圖9 比較AZ084、DMSO、MOCK組初始CD4+T細胞向Treg細胞分化的比例Figure 9 Comparisons in the proportion of naive CD4+T cells differentiating into Treg cells in AZ084，DMSO and MOCK groups

3 討論

卵巢癌是病死率最高的婦科惡性腫瘤，雖然治療方法不斷改進，但是卵巢癌患者的生存率并沒有明顯提高。近年來免疫治療逐漸顯示出巨大潛力。TME 的復雜性和多樣性對免疫治療的效果具有重要影響。深入闡明卵巢癌免疫抑制微環境的產生機制，探索提高免疫治療效果的新策略是卵巢癌治療的研究方向。卵巢癌免疫抑制微環境形成的主要機制之一是Treg 細胞抑制CD8+效應性T 細胞殺傷腫瘤的功能。腫瘤浸潤性Treg高度活化、增殖，具有很大的異質性［13］，而趨化因子和細胞因子依賴的募集是Treg 細胞向腫瘤浸潤的主要機制。如趨化因子CCL1和CCL18，由腫瘤細胞和TME內的樹突狀細胞分泌，與Treg細胞上的CCR8受體結合，引導它們向腫瘤部位移動［14-15］。細胞因子IL-2，通過與Treg 細胞表面上的CD25（IL-2 受體的α鏈）結合，能夠促進Treg 細胞的活性和增殖。在一些腸癌模型中，通過增加IL-2的濃度可以顯著增加Treg細胞在TME中的數量［16］。因此，在抗腫瘤免疫治療中，Treg細胞的調節和耗竭策略被認為是有效的方法。然而，由于缺乏對腫瘤浸潤性Treg群體的良好選擇性，這些策略往往導致嚴重的不良反應［17］。因此需要開發一種針對腫瘤浸潤性Treg 細胞的特異性靶向標志物。

本研究發現在小鼠模型中，CCR8 作為卵巢癌最穩定和差異表達的趨化因子受體，CCR8+Treg是卵巢癌浸潤性Treg 的主要類型，CCR8+Treg 中PD-1+、CTLA-4+、ICOS+、LAG-3+亞群也顯著高于脾臟和外周血液，提示CCR8+Treg 可能是卵巢癌主要的浸潤性Treg，在腫瘤免疫抑制微環境中發揮主導作用，其抑制性與共刺激性的亞群都比外周組織中更活躍，因此可能在卵巢癌免疫逃逸中發揮作用。同時，CCR8變構拮抗劑AZ084 明顯抑制初始CD4+T 細胞向Treg 細胞的誘導分化。最新研究也顯示，在人類乳腺癌、肺癌、結腸癌、肝癌以及小鼠黑色素瘤、非小細胞肺癌等模型中，腫瘤浸潤性Treg 細胞上的CCR8 表達增高［18］，與本研究的結論基本一致。因此靶向卵巢癌浸潤性CCR8+Treg，選擇性地清除CCR8+Treg 或抑制其功能，可控制或改善TME 的免疫抑制狀態，有利于提高卵巢癌免疫治療的療效。但目前研究暫不足以說明CCR8對腫瘤浸潤性Treg發揮功能具有必要性，后續將進一步研究直接敲除Treg上的CCR8基因對腫瘤浸潤性Treg 免疫表型與功能的影響以及CCR8+Treg 功能調控的分子機制，從而為卵巢癌的靶向免疫治療提供更精準的分子診斷依據。