基于血清代謝組學分析人參化橘紅干預慢性阻塞性肺疾病的代謝機制

鐘鵬英，張玉超，張芳華，張喜利，劉文龍*（1.湖南中醫藥大學藥學院，長沙 410208；2.中藥成藥性與制劑制備湖南省重點實驗室，長沙 410208；.湖南省中醫藥研究院附屬醫院，長沙 410208）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種慢性肺部疾病，其特點是氣道氣流受限，并伴有炎癥和肺氣腫，COPD患者氣流受限的直接原因是氣道重塑，而肺氣腫則源于肺泡壁的廣泛破壞[1-2]。煙霧中含有各種有毒物質，容易吸引巨噬細胞和中性粒細胞，促進內源性物質的釋放，并加速氧化應激引起的肺組織損傷[3]?，F代醫學研究發現，到2030 年，COPD可能與高血壓和糖尿病一起成為全球三大死因，極大地阻礙醫療保健的發展，損害人類健康[4]。目前還沒有可逆轉或阻止疾病發展的治療方案，為此，迫切需要確定治療研究的新機制或新靶點。代謝組學（代謝物分析）是一種新興的方法，可用于鑒定代謝物的生物標志物和發現受干擾的代謝途徑，依據代謝途徑的變化從而發現不同疾病中的治療標志物[5-7]，在COPD疾病中發現其部分代謝表達也出現了紊亂[8]，選取關鍵代謝途徑進行治療，有可能成為治療新方式。

人參化橘紅復方含人參、甘草、化橘紅和陳皮，其中，藥材陳皮和化橘紅含有柚皮素、柚皮苷和陳皮苷，其抑制黏蛋白分泌和調節炎癥的作用已得到廣泛認可，具有祛痰和鎮咳作用，可用于治療慢性支氣管疾病[9]，人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg3和總人參皂苷早已被證明可通過調節輔助性T細胞1和T細胞2 的比例來平衡內環境。人參皂苷Rg1可介導上皮-間質轉化（EMT），進而抑制氣道重塑來增強COPD患者的肺功能和存活水平[10-11]。然而，對于其如何干預 COPD的作用機制并不清晰，本研究經血清代謝組學分析并驗證與COPD相關的生物標志物和代謝通路，為人參化橘紅治療COPD提供更加豐富的理論基礎。

1 材料

1.1 動物

24只雄性SPF級SD大鼠，（200±20）g [湖南晶達實驗動物有限公司，生產許可證號為：SYXK 2019-0009]。大鼠自由進食和飲水，飼養溫度為20～25℃，濕度為50%～70%。所有實驗均按照湖南中醫藥大學醫學倫理審查委員會批準的動物實驗方案和指南進行（倫理審查號：LL2022090602）。

1.2 試藥

人參化橘紅（西藏嘉唐保健品有限公司）；TBST、BCA蛋白濃度測定試劑盒，RIPA（強）組織細胞快速裂解液（賽文科技有限公司）；脂多糖（LPS，Sigma生物技術有限公司）；HE染色（武漢皮諾飛生物技術有限公司）；黃果樹香煙（中國，含焦油 10 mg，尼古丁 0.9 mg，一氧化碳 12 mg）；琥珀酸合成酶（ASS1）、激活激酶（P21）、磷脂酶（PLD1）抗體、山羊抗鼠IgG二抗（Affnity）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）和基質金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）ELISA試劑盒（上海撫生生物有限公司）；氨茶堿（太原集團有限公司）；水合氯醛（合肥博美生物科技有限責任公司）；氯化鈉注射液（湖南科倫制藥有限公司）；無水乙醇、甲醇和乙腈（上海安譜實驗有限公司）；超純水（屈臣氏集團有限公司），自制煙熏盒子（80 cm×40 cm×20 cm）。

1.3 儀器

Q1320583超聲儀（昆山禾創超聲儀器有限公司）；電泳儀和化學發光成像分析儀（美國Bio-Rad公司）；UPLC-Q-TOF/MS質譜儀、Heraeus Fresco17離心機、酶標儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）。

2 方法

2.1 COPD造模和給藥

大鼠適應性喂養3 d后，隨機分為對照組和模型組。對照組（6只）暴露于室內空氣中，模型組（18只）于自制箱子中熏二手煙，每次 1.5 h，每次9支煙，每日2次（間隔4 h），每周6 d，共45 d；第1日和第14日用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉大鼠，用脫毛膏清創咽喉部，暴露喉部，用靜脈注射針代替氣管插管，向氣管內注入0.2 mL質量濃度為1 mL·mg－1的LPS，然后將大鼠直立旋轉10～20 s，使LPS均勻分布在肺部，2 d內不接觸二手煙。人參化橘紅人體給藥每日3 g，氨茶堿每日1 g，大鼠按1 mL/100 g灌胃，人參化橘紅給藥質量濃度為0.027 g·mL－1，氨茶堿給藥質量濃度為0.009 g·mL－1。

2.2 樣品采集

末次給藥后，禁食12 h，各組大鼠經麻醉處理，腹主動脈取血；室溫下靜置30 min后，以4℃、3000 r·min－1（離心半徑9 cm）離心15 min，分離上層血清，－80℃保存。

2.3 組織病理學觀察

取大鼠右肺組織于4%多聚甲醛溶液中固定48 h后，嚴格按照試劑盒說明書步驟，HE染色觀察肺組織內炎癥情況。參考文獻報道分級[12]：0級，正常形態；1級，輕度肺間質充血和中性粒細胞浸潤；2級，血管周圍水腫形成，肺組織結構部分損壞，中度中性粒細胞浸潤；3級，肺組織結構損壞嚴重，高密度中性粒細胞浸潤。

2.4 ELISA法檢測血清TNF-α、IL-1β、MMP-9和TIMP-1水平

收集血清按照相關試劑盒說明書嚴格操作，檢測血清中TNF-α、IL-1β、MMP-9和TIMP-1水平。

2.5 血清代謝組學分析

移取100 μL樣品至EP管中，加入400 μL提取液（甲醇-乙腈＝1∶1，含同位素標記內標混合物），渦旋混勻30 s；超聲10 min（冰水?。?；－40℃靜置1 h；將樣品于4℃、12 000 r·min－1（半徑8.6 cm）離心15 min；取上清液及QC樣品（另取等量上清混合成）上機檢測。

2.6 檢測條件

色譜柱 Waters ACQUITY UPLC BEH Amide（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相A為含25 mmol·L－1乙酸銨和 25 mmol·L－1氨水，B為乙腈，采用梯度洗脫（0～0.5 min，95%B；0.5～7 min，95%～65%B；7～8 min，65%～40%B；8～9 min，40%B；9～9.1 min，40%～95%B；9.1～12 min，95%B）；流速0.5 mL·min－1，柱溫30℃，樣品盤溫度4℃，進樣量2 μL。

2.7 Western blot檢測

取大鼠左肺組織于－80℃保存。按照 BCA法蛋白質含量檢測試劑盒的說明測定蛋白質濃度。取50 mg右肺組織，用冷PBS沖洗 3 次，用RIPA 裂解液提取蛋白質，用 BCA 法檢測勻漿中的蛋白質濃度。將 5×SDS上樣緩沖液與100 μg蛋白按比例混合，煮沸5 min，然后用 10% SDSPAGE 凝膠電泳分離，電泳條件為120 V，1 h；用甲醇活化的 PVDF 轉膜，轉膜條件為 200 A，1 h。轉膜后，用 5%脫脂奶粉在 37℃下封閉2 h。按說明書用 P21、PLD1、ASS1和 GAPDH 一抗（1∶2200）在 4℃下孵育過夜，洗膜后加入稀釋的二抗。二抗稀釋后加入山羊抗兔 IgG 二抗（1∶7000）封閉，37℃室溫下輕輕振蕩孵育2 h。使用 BIO-Rad-ChemiDoc XRS 凝膠電泳，導出圖像，測定各目標條帶與 GAPDH 內參的灰度值，計算比值，得出預測蛋白的相對表達含量。

2.8 數據分析

使用SPSS 25軟件對結果進行統計分析，結果表示為平均值±標準差（mean±SD）。使用單因素方差分析（ANOVA）進行統計比較。P＜0.05表示差異有統計學意義。

原始數據經ProteoWizard軟件轉成mzXML格式后，使用自主編寫的R程序包（內核為XCMS）進行峰識別、峰提取、峰對齊和積分等處理，然后與BiotreeDB（V2.1）自建二級質譜數據庫匹配進行物質注釋，算法打分的Cutoff值設為0.3。采用Sigmca-17軟件對所得數據進行無監督模式的主成分分析（PCA）及有監督模式的正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），得到能夠反映組間貢獻率的代謝物變量重要性投影（VIP）值散點圖，利用HMDB數據庫（http：//hmdb.ca）與KEGG數據庫（http：//www.kegg.jp）對篩選得到的差異代謝物進行鑒定，辨別出潛在生物標志物，隨后使用MetaboAnalyst 5.0數據庫（http：//www.metaboanalyst.ca）對潛在生物標志物進行富集分析。

3 結果

3.1 病理切片結果

HE染色顯示，對照組大鼠肺組織有少許炎性細胞浸潤，支氣管壁基本完整，未見明顯黏膜水腫和肺泡破壞；模型組大鼠支氣管壁增厚，炎癥細胞浸潤，肺泡破裂，形成了大肺泡，肺泡壁增厚。與對照組比較，模型組大鼠肺組織病理評分升高（P＜0.01）；與模型組相比，人參化橘紅組炎性浸潤減少，肺泡破裂情況少見，病理評分降低（P＜0.01）。結果見圖1。

圖1 不同組別HE染色及評分圖（×200，n＝6）Fig 1 HE staining and scoring charts of different groups（×200，n＝6）

3.2 人參化橘紅對COPD大鼠血清內TNF-α、IL-1β、MMP-9和TIMP-1水平的影響

與對照組比較，模型組大鼠血清內TNF-α、IL-1β、MMP-9和TIMP-1顯著上升（P＜0.01）；與模型組比較，人參化橘紅組TNF-α、IL-1β、MMP-9和TIMP-1均出現不同程度下降（P＜0.05，P＜0.01），可知用藥后炎癥浸潤的效果明顯改善，且肺氣道內氣道壁增厚現象有所改善（見圖2）。

圖2 大鼠血清內TNF-α、IL-1β、MMP-9和TIMP-1水平比較（n＝6）Fig 2 TNF-α，IL-1β，MMP-9，and TIMP-1 levels in rat serum（n＝6）

3.3 多元統計分析

模型組大鼠和人參化橘紅組血清樣品能夠明顯分離，且無交叉重疊，表明COPD大鼠體內發生了明顯的代謝差異變化；PCA圖中橫坐標PC[1]和縱坐標PC[2]分別表示排名第一和第二的主成分的得分，每個散點代表一個樣本，散點的顏色和形狀表示不同的分組，樣本點分布越靠近，說明樣本中代謝物的種和含量越相似；反之，樣本越遠，其整體代謝水平差異越大，其結果可知樣本全部處于95%置信區間內。結果見圖3。

圖3 大鼠血清代謝物的多元統計分析Fig 3 Multivariate statistical analysis of rat serum metabolites

在圖3結果中，OPLS-DA模型中R2Y與Q2接近于1，則表明模型對Y變量的解釋性越好且模型的預測能力越好，同時采用200次置換測試驗證了OPLS-DA模型的可靠性，所有模擬值均小于真實值，且Q2的回歸線截距均小于 0.05。結果表明，OPLS-DA模型具有良好的擬合度和預測能力，其對血清樣品的差異具有良好的解釋性。

3.4 人參化橘紅生物標志物及KEGG富集分析

采用UPLC-Q-TOF/MS技術的代謝組學分析，根據設定的參數（VIP＞1且P＜0.05）篩選差異代謝物，將它們的二級質譜圖分別與HMDB數據庫、KEGG數據庫中代謝物的二級質譜圖進行匹配，反復比對，共得到33個潛在生物標志物，詳細見表1；將上述差異代謝物代入Metabo Analyst 5.0富集分析共發現15條代謝路徑，見圖4，其中涉及組氨酸代謝、精氨酸合成、花生四烯酸代謝、甘油磷脂代謝和膽堿代謝等，隨后通過相關文獻找到與COPD相關的通路（精氨酸合成[13]、花生四烯酸代謝[14]和甘油磷脂代謝[15]）及其對應的酶（ASS1、P21和PLD1）。

表1 人參化橘紅潛在生物標志物Tab 1 Potential biomarkers Ginseng-Chemotaxis

圖4 KEGG富集分析得出15條路徑Fig 4 15 paths yielded by KEGG enrichment analysis

3.5 代謝通路結果驗證

選擇上述涉及的酶，利用Western blot驗證，結果如圖5，與模型組相比，P21和ASS1的蛋白灰度值差異具有統計學意義，而PLD1無顯著差異，由此推測人參化橘紅可能通過促進ASS1和抑制P21，以促進精氨酸合成和抑制花生四烯酸代謝來干預COPD的發生發展。

4 討論

COPD是一種多種癥狀疊在一起的肺功能性疾病，其發病機制復雜，治愈難度大，臨床上對其治療多以延緩其發展，減輕患者癥狀為首要目標[16]。本研究以LPS和煙霧誘導大鼠COPD模型，經人參化橘紅干預一段時間，可明顯看出肺組織和血清內炎癥浸潤減少，MMP-9和TIMP-1的抑制對于氣道壁的增厚有所改善，提示該方對COPD的肺組織具有一定的保護作用，隨后為了探明其代謝機制，利用UPLC-Q-TOF/MS分析模型組和人參化橘紅組之間的血清，考察COPD相關生物標志物及其代謝通路。

精氨酸是必需氨基酸的一種，促進精氨酸的合成，對于抑制COPD發展是有積極意義的。有研究發現，COPD患者病情惡化時，精氨酸酶支氣管上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞和肺泡巨噬中參與調節炎癥和氣道重塑的關鍵成分[17]。隨著時間的推移，COPD患者肺動脈高壓和動脈壓呈現上升趨勢，應用精氨酸干預后，肺組織損傷減輕，肺功能得到改善[18-19]。

花生四烯酸代謝是構成炎癥的重要一環，通過抑制炎癥反應達到阻礙疾病進程是治療眾多疾病的基礎，經脂氧酶的代謝作用后，可活化NF-κB，肺泡灌洗液和肺組織內炎癥因子白細胞數量顯著增加，推測其可能增加氧化應激和蛋白酶的負荷，加重了COPD的發生發展[20]。其次其通過改變花生四烯酸代謝后，可阻礙血栓素B2和白三烯等炎癥因子的形成，降低肺組織內細胞凋亡指數，減少煙霧誘導累積的毒性效應[21]。甘油磷脂代謝作為COPD患者肺組織內代謝紊亂的重要標志物[22]，其前體物質植物鞘磷脂可代謝為脂肪酸，隨后并入甘油磷脂內，在細胞的凋亡、遷移和炎癥中均可表達，對于COPD的診斷具有重大價值[23]。但根據Western blot的檢測結果可知，人參化橘紅對抑制其表達無顯著性差異，可能對甘油磷脂代謝抑制無明顯作用。

綜上所述，本研究通過血清代謝組學探究人參化橘紅干預COPD的作用機制，發現人參化橘紅可通過促進精氨酸的合成和抑制花生四烯酸代謝，抑制肺組織的炎癥浸潤，保護肺功能。