基于電子鼻技術結合網絡藥理學分析半夏不同炮制品的氣味差異標志物

楊靖涵，高杰，孫立麗，劉亞男，任曉亮（天津中醫藥大學中藥學院，天津 301617）

半夏為天南星科植物半夏Pinelliaternata（Thunb.）Breit.的干燥塊莖，歸脾、胃、肺經?，F代研究表明，半夏的化學成分主要包括生物堿[1]、有機酸[2]、揮發油[3]、氨基酸[4]等，半夏具有臟器毒性、黏膜刺激性、生殖毒性等毒副作用，炮制可以減少生品的毒性，從而達到減毒增效、改變藥性的目的[5]。2020年版《中國藥典》收載的半夏的炮制品主要有半夏、姜半夏、法半夏、清半夏四種[6]。藥理學研究證實半夏具有鎮咳、祛痰、止嘔、抗炎、抗氧化的功效，而半夏的不同炮制品在臨床中均具有止咳的作用[7-8]。王銳等[9]采用“同時蒸餾-萃取”的方法提取了半夏的揮發油，并證明了半夏的揮發油具有一定的生理活性。也有研究表明，半夏揮發油具有止咳、抗炎、抗氧化等功效，這與半夏的藥理作用具有較好的相關性[1，10-11]。因此從半夏揮發油中篩選質量標志物是可行的思路。

半夏的炮制工藝多以復制法為主，經炮制后揮發性的成分種類差異較大，因此通過建立指紋圖譜探索共有的化學特征，進而確定其質量標志物是有效可行的思路[12-16]。Heracles Ⅱ超快速氣相電子鼻的分析原理與氣相色譜類似，物質中的揮發性成分不同，對色譜柱的吸附與解吸也存在較大差異，能夠實現混合氣體之間的分離與分析[17]，和氣相色譜相比，具有更短的色譜柱和更薄的填充材料，能夠極大縮短揮發性成分的分離時間，提高樣品分析效率[18]，其配備的Arochembase數據庫具有類似于GC-MS的成分定性功能。因此超快速氣相電子鼻具有操作簡單，檢測快捷，無需對樣品做過多處理等優點，能夠對中藥成分進行快速的分離、定性、分析[19]。目前已被廣泛用于中藥材基原[20]、炮制品[21]、摻偽品[22]、采收期和貯存期[23]等方面的研究中。本研究借助Heracles Ⅱ超快速氣相電子鼻技術獲得半夏及其炮制品的氣相色譜圖，建立半夏不同炮制品的超快速氣相電子鼻檢測方法，并分析了半夏不同炮制品之間的氣味成分及差異標志物，進一步結合網絡藥理學，預測不同炮制品的差異成分靶點和通路信息，旨在從揮發性成分的角度，解釋半夏不同炮制品的分子作用機制，為炮制品的質量控制研究提供新思路。

1 樣品、儀器與試藥

1.1 樣品

半夏收集于河北、四川、甘肅等地，具體樣品批次見表1，經天津中醫藥大學竇志英教授鑒定為天南星科植物半夏Pinelliaternate（Thunb.）Breit.的塊莖。所有樣品均按2020年版《中國藥典》[6]中半夏炮制方法自制4 種半夏炮制品。

表1 樣品來源信息Tab 1 Sample source information

1.1.1 半夏 取半夏藥材，除去雜質，即得樣品SBX-S1～S6。

1.1.2 姜半夏 選取直徑大小約為1 cm的凈制半夏，用水浸泡至內無干心時，取出；另取生姜片煎湯，加白礬與半夏共煮透，取出，晾干。即得樣品JBX-S1～JBX-S6。每100 g凈制半夏用生姜25 g，白礬12.5 g。

1.1.3 法半夏 選取直徑大小約為1 cm的凈制半夏，用水浸泡至內無干心。取適量甘草，加水煎煮，合并煎液，倒入適量的石灰液中，加入浸透的半夏，每日攪拌1～2 次，保持溶液pH 12以上，至剖面黃色均勻，口嘗微有麻舌感時取出，洗凈，晾干，即得樣品FBX-S1～FBX-S6。每100 g凈制半夏用甘草15 g，生石灰10 g。

1.1.4 清半夏 選取直徑大小約為1 cm的凈制半夏，用8%的白礬水浸泡至內無干心，口嘗微有麻舌感時取出，洗凈，晾干。即得樣品QBXS1～QBX-S6。每100 g凈制半夏用白礬20 g。

將以上4種炮制品分別打粉，過4號藥典篩，備用。精密稱取藥材粉末0.5 g，分別置于20 mL頂空進樣瓶中，加蓋密封，平行兩次進樣。半夏不同炮制品見圖1。

圖1 半夏及其不同炮制品Fig 1 Pinelliae Rhizoma and its processed products

1.2 儀器與試藥

HeraclesⅡ超快速氣相電子鼻（法國Alpha MOS公司）；FA2004型萬分之一天平，（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）。nC6-nC16正構烷烴標準溶液（批號：563121，美國RESTEK公司）。

2 方法與結果

2.1 Heracles Ⅱ超快速氣相電子鼻儀器條件

Heracles Ⅱ超快速氣相電子鼻配有兩根色譜柱：一根為非極性的MXT-5色譜柱，另一根為弱極性的MXT-1701色譜柱。待測樣品通過平行工作的兩根色譜柱進行分離后，使用氫火焰離子檢測器FID對分離出的物質進行檢測，從而得到半夏及其炮制品的有效氣味信息，具體分析條件參數如表2所示。

表2 Heracles Ⅱ超快速氣相電子鼻分析條件Tab 2 Analysis conditions of Heracles Ⅱultra-fast gas phase electronic nose

2.2 炮制品氣味成分定性分析

根據“2.1”項下條件，將所得圖譜信息導入Origin Pro 2022軟件得到半夏及其炮制品的色譜圖（如圖2所示），得半夏不同炮制品對照氣味峰指紋圖譜（如圖3所示）。利用正構烷烴標準溶液對各氣味信息進行定性，樣品保留時間校準為Kovats保留指數，利用Arochembase數據庫和Alphasoftv12.44軟件處理后，得到半夏及其炮制品的可能氣味信息如表3所示。

圖2 半夏不同炮制品氣味指紋圖譜Fig 2 Odor fingerprint of Pinelliae Rhizoma and its processed products

圖3 半夏及其炮制品對照氣味峰指紋圖譜比較Fig 3 Common mode of odor fingerprint of Pinelliae Rhizoma and its processed products

表3 半夏及其不同炮制品可能氣味信息Tab 3 Possible compounds information of Pinelliae Rhizoma and its processed products

結果表明，4種炮制品氣味之間的共有成分為正十三烷；半夏的特有氣味成分為2-甲基丙酸乙酯、正己醛、壬酸丙酯、丙戊酸、5-甲基十五烷、肉桂酸正丙酯；姜半夏的特有氣味成分為正己烷、3-戊酮、2-甲基-1-戊醇、苯甲酸、4-三癸醇；法半夏的特有氣味成分為甲酸甲酯、甲基丁香酚；清半夏的特有氣味成分為二乙基酮、正十六烷。由此可見半夏不同炮制品之間氣味存在差異，因此這些不同的氣味信息可能是鑒別半夏及其炮制品的物質基礎。

2.3 半夏不同炮制品氣味成分分析

利用電子鼻獲取半夏不同炮制品氣味信息，通過Kovats保留指數定性，采用峰面積歸一化法得到半夏不同炮制品的氣味成分相對含量。結果見表4。半夏不同炮制品中共鑒定出21種成分，包括酯類6種，烷烴類5種，醇類2種，酸類2種，醛類、酚類各1種，其他類4種。

表4 半夏及其不同炮制品氣味成分相對含量Tab 4 Relative content of odorant components in Pinelliae Rhizoma and its different processed products

結果表明，半夏不同炮制品中，共同存在的成分為酯類和烴類。半夏的氣味成分主要為酯類、烴類、酸類、醛類；姜半夏的氣味成分主要為酯類、烴類、醇類、酸類；法半夏的氣味成分主要為酯類、烴類、酚類等；清半夏的氣味成分主要為酯類、烴類。其中，姜半夏炮制過程中加入炮制輔料生姜，賦予了姜半夏辛辣的、香料的氣味；法半夏炮制過程中加入輔料甘草汁，賦予了法半夏甜的、水果的氣味，這表明不同的物料對半夏不同炮制品的影響不盡相同，因此炮制后的化學成分、藥效、作用機制也會有所改變[24]。

2.4 多元統計分析

2.4.1 主成分分析（PCA） 根據Heracles Ⅱ超快速氣相電子鼻得到半夏及其炮制品的色譜圖，以其色譜圖峰面積為變量進行PCA分析，結果如圖4所示。判別指數為70，主成分（PC1＝54.424%，PC2＝18.414%）的累計貢獻率為72.838%，表明所建立的模型能夠較好地反映樣品的氣味信息。四種炮制品能夠被良好地區分：半夏主要分布在第二、三象限，且樣品分布較為分散，說明樣品之間氣味差異較大；姜半夏、法半夏、清半夏主要分布在第一、四象限，與半夏分布距離較遠，且這三種炮制品之間也能較好地區分。以上結果表明半夏的不同炮制品之間存在氣味差異，PCA模型可以用于區分半夏及其炮制品，后續可以進一步使用有監督模型進一步分析。

圖4 PCA模型得分圖Fig 4 PCA model score chart

2.4.2 判別因子分析（DFA） DFA是在PCA模型的基礎上，擴大組間的差異，縮小組內的差異的一種分析方法[25-26]。DFA模型的得分圖如圖5所示，樣品按照不同的炮制方法分為4類。判別因子（DF1＝70.299%，DF2＝22.999%）的累計貢獻率為93.298%，DFA模型能較好地區分半夏不同炮制品。半夏沿著DF1的正半軸分布，沿著DF1方向姜半夏、法半夏、清半夏距離半夏生品的距離較遠，有著明顯的界限，說明半夏經炮制后氣味成分信息差異較大；各個炮制品中，姜半夏和法半夏主要分布在第三象限，清半夏則主要分布在第一象限，姜半夏和法半夏的距離相對較近，說明姜半夏和法半夏的氣味信息較為相似，而清半夏的氣味信息則與這兩種炮制品的氣味信息有較大的差異。半夏和不同炮制品之間距離有著明顯的界限，結果與PCA模型分析結果一致。

圖5 DFA模型得分圖Fig 5 DFA model score chart

2.4.3 偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA） 采用IBM SPSS Statistics對21個氣味色譜峰進行單因素方差分析，結果如表5所示，除正己烷外的其他20個峰均有顯著性差異（P＜0.05）；采用SIMCA14.1軟件對21個峰進行PLS-DA分析，生成的VIP圖如圖6所示。結果表明，模型解釋概率R2Y為0.967，模型預測率Q2為0.959，表明模型具有較好的解釋率和可靠性。選取VIP值大于1的變量作為潛在氣味差異標志物。其中甲基丁香酚、二乙基酮、正十六烷、辛酸庚酯、丙烯酸丙酯的VIP值大于1，推測這5個成分是影響半夏及其炮制品氣味的差異標志物。

圖6 半夏及其炮制品PLS-DA模型中21個色譜峰VIP值Fig 6 VIP values of 21 chromatographic peaks in PLS-DA models of Pinelliae Rhizoma and its processed products

表5 半夏及其炮制品組別間氣味成分方差分析Tab 5 Variance analysis of odor components among Pinelliae Rhizoma and its processed products

2.5 半夏不同炮制品氣味差異成分網絡藥理學分析

2.5.1 差異物靶點預測分析 在PubChem數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound）中檢索半夏炮制前后差異性氣味成分的丁香酚、二乙基酮、正十六烷、辛酸庚酯、丙烯酸丙酯的SIMILES號，導入Swiss Target Prediction數據庫（https：//www.swisstargetprediction.ch/），選擇Probability＞0.1進行篩選和靶點預測分析，利用Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org/）將靶點蛋白轉換成標準基因名，篩去重復的靶點，最終得到與其有作用的靶點共133個。

2.5.2 疾病基因靶點的獲取 在GeneCard和DisGeNET數據庫中檢索關鍵詞“Cough”，將所得數據合并，去除重復值，獲得疾病靶點的相關信息，共得到了1823個作用靶點，將藥物主要成分與疾病基因取交集，共得到48個共同靶點。

2.5.3 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡構建 將篩選的48個靶點導入STRING數據庫（https：//www.string-db.Org）構建PPI網絡，物種選擇為“Homo sapiens”，最低關聯度值選擇為＞0.4，得到差異性成分潛在作用靶點的PPI網絡圖。將其以TSV格式導入Cytoscape3.9.1中，進行可視化和拓撲分析。篩選出標準值＞2倍Degree的中位數值，1倍Betweenness和Closeness的中位數值，篩選出發揮活性的核心靶點，包括Toll樣受體4（TLR4）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、雌激素受體（ESR1）、糖原合酶激酶3（GSK3B）、絲裂原激活蛋白激酶14（MAPK14）等。

2.5.4 GO功能富集和KEGG通路富集分析 利用David數據庫（https：//www.david.ncifcrf.gov/tools.jsp）對篩選的核心靶點進行GO功能富集和KEGG通路富集分析。選擇生物屬性為“Homo sapiens”，標識符號為“OFFICIAL-GENE-SYMBOL”，列表選擇為“Gene List”。GO功能富集共得206個條目，其中BP通路（biological process）206條，CC通路（cellular component）45條，MF通路（molecular function）50條。取前10條繪制為條形圖，如圖7A所示。其中BP通路主要包括對脂多糖的反應、蛋白質磷酸化通路、腺苷酸環化酶抑制G蛋白偶聯受體信號傳導通路等；CC通路主要包括質膜、細胞質、高分子通路等；MF主要包括蛋白激酶信號通路、G蛋白耦聯腺苷受體信號通路、ATP結合受體通路等。共得KEGG富集的92條通路，取前20條通路，繪制KEGG氣泡圖，如圖7B所示，主要涉及的通路為PI3K-Akt信號通路、表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制通路、Coronavirus disease-COVID-19信號通路、乙型病毒型肝炎信號通路等。進一步利用Cytoscape 3.9.1繪制“成分-靶點-通路”圖，如圖8所示。

圖7 GO功能富集分析（A）和KEGG通路富集分析（B）Fig 7 GO functional enrichment analysis（A）and KEGG pathway enrichment analysis（B）

圖8 半夏揮發性成分-靶點-通路網絡Fig 8 Volatile component-target-pathway network of Pinelliae Rhizoma

3 討論與結論

目前已有大量實驗從半夏不同炮制品的非揮發性成分角度探究其止咳的機制，但尚未有從揮發性成分角度進行研究的報道。氣味是中藥較為重要的一個屬性，半夏不同炮制品之間氣味差異明顯，其內在的化學成分更是不同炮制品發揮藥效的重要依據。本研究運用了Heracles Ⅱ超快速氣相電子鼻技術，在預實驗考察了進樣量、震蕩時間、震蕩溫度等實驗條件后最終確立了最優實驗條件，實現了對半夏不同炮制品揮發性成分的快速檢測，獲取了相關的氣相色譜信息，并基于此建立了半夏不同炮制品的氣味指紋圖譜。電子鼻共定性出21種可能存在的氣味特征性成分，明確了炮制前后各炮制品氣味種類和相對含量的變化。半夏經炮制后醛類成分消失，增加了如2-甲基-1-戊醇、4-三癸醇、甲基丁香酚、乙基氯、二乙基酮等醇類、酚類和其他類的成分。姜半夏的炮制過程中加入生姜能夠緩和半夏的刺激性，半夏經炮制后揮發油的相對含量減少，揮發性成分的種類數增加，因此姜半夏炮制的減毒機制尚需進一步研究[24]；法半夏的炮制過程中引入了甘草汁，氣味研究結果表明炮制后法半夏新增甲基丁香酚這一物質，現代藥理學已證實甲基丁香酚能夠松弛氣道平滑肌，從而起到鎮咳、平喘的作用[25-26]，推測甘草的加入使得法半夏的止咳作用增強。利用PCA、DFA、PLS-DA等多元分析方法，篩選出了5種氣味差異性成分。

進一步利用網絡藥理學，基于篩選出的5種氣味差異性成分，探究半夏不同炮制品止咳的分子作用機制。繪制PPI網絡，共篩選出48個靶點蛋白，其中核心靶點蛋白包括Toll樣受體4（TLR4）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、雌激素受體（ESR1）、糖原合酶激酶3（GSK3B）、絲裂原激活蛋白激酶14（MAPK14）等。TLR4可有效殺傷T細胞及激活樹突狀細胞，在介導細胞因子、調控氣道炎性介質的釋放方面具有重要的調控作用[27-29]；CASP3與細胞凋亡關系密切，其位于兩條細胞凋亡通路的中心，活化后可參與切割細胞結構和功能蛋白，較好地反映凋亡過程[30-31]；ESR1與雌激素相關，可能在肺部疾病中起關鍵作用[32]；GSK3B參與調控糖原合成酶的活性，調節細胞的分化、增殖和凋亡等[33]，MAPK14主要參與細胞生長、分化、應激、炎癥反應等多種細胞活動[34-35]。此外，MAPK14的激活是一種氧化和觸發黏附蛋白的調節器，能夠磷酸化激活MAPKAP2來增強炎性因子的表達和分泌[36]。

KEGG富集分析主要涉及的通路為PI3K-Akt信號通路、表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制通路、乙型病毒型肝炎信號通路等。研究證明，PI3K/Akt信號通路的激活會使得氣道中的炎性因子遷移到炎性病灶中，同時PI3K/Akt信號通路在支氣管哮喘中也表現出有效的抗炎活性[33，37]。EGFR信號通路在維持上皮細胞穩定性、促進氣道上皮組織修復方面起著至關重要的作用[30，38]。乙型病毒性肝炎通路表現為直接或間接與免疫和炎癥相關，說明半夏不同炮制品在抗炎方面發揮著一定的作用[39]。

綜上所述，本實驗在比較研究半夏炮制前后成分變化的基礎上，聯合網絡藥理學初步探討了半夏炮制增效的原理，對“藥物-成分-靶點”關系網絡中關鍵成分分析，發現原料藥材與炮制輔料均在治療疾病的過程中發揮重要作用。根據網絡藥理學的結果推測，半夏不同的炮制品中的甲基丁香酚、二乙基酮、正十六烷等物質作為潛在的止咳有效成分，通過TLR4、CASP3、ESR1等關鍵靶點，調節PI3K-Akt、EGFR等信號通路的激活，從而抑制組織炎癥反應和氣道結構重塑，發揮止咳的作用。本研究從分子作用機制的角度闡釋半夏中揮發性成分的止咳作用機制，今后將通過相關生物學實驗，驗證半夏不同炮制品在藥性與臨床止咳作用之間的聯系與差別。