茯神裂環羊毛甾烷型化學成分研究

鄧子怡，郁陽，4，李莉，楊財子，孫云鵬，4，王國凱，3，4，劉勁松，4*（.安徽中醫藥大學藥學院，合肥 300；.安徽中醫藥大學中西醫結合學院，合肥 300；3.中藥研究與開發安徽省重點實驗室，合肥 300；4.中藥功效物質組分校級重點實驗室，合肥 300）

茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos（Show.）Wolf的干燥菌核，是一種寄生在松樹根部的好氣性、喜干燥的腐生真菌[1-2]。茯神（Poria cum Pini Radix）為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos（Show.）Wolf菌核中抱有松根（即茯神木）的白色部分。茯神與茯苓雖均來源于茯苓菌核，但兩者功效卻有顯著差別。茯苓味甘淡，性平，具有利水滲濕、健脾等功效；茯神味甘淡，性平，具有安神寧心、利水等功效，多用于治療驚悸失眠、健忘、驚癇、小便不利等癥[3]。茯苓和茯神均具有較好的生物活性[4]，但茯神以寧心、安神見長，兩者的化學成分和含量差異可能是導致其功效不同的因素之一[5]。三萜類成分是茯神主要活性成分之一，大多以四環三萜的結構呈現[6]，主要分為羊毛甾烷三萜烯型和3，4-裂環-羊毛甾烷三萜烯型兩種類型[7]。為進一步探究茯神的化學成分，尋找其安神寧心的藥效物質基礎，本課題組利用中藥化學分離手段和現代波譜學鑒定技術對茯神化學成分進行研究，從中分離鑒定出11個裂環羊毛甾烷型單體化合物，分別為茯苓新酸B（1）、茯苓新酸A（2）、茯苓新酸DM（3）、16α，27-二羥基-3，4-裂環羊毛甾-4（28），8（9），24-三烯-3，21-二酸（4）、茯苓新酸ZC（5）、茯苓新酸ZM（6）、茯苓新酸E（7）、茯苓新酸D（8）、茯苓新酸ZG（9）、茯苓新酸M（10）、茯苓新酸L（11），結構式見圖1。

圖1 化合物1～11的化學結構Fig 1 Chemical structures of compounds 1～11

1 材料

1.1 儀器

Bruker AVⅢ-600（德國Bruker公司）；Agilent 1100分析型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Waters AutoSpec Premier P776質譜儀、Waters 1525半制備型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Agilent 5 HC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）分析柱；Waters Sunfire（250 mm×19 mm，5 μm）制備柱。

1.2 試藥

200～300目（50～71 μm）柱色譜硅膠（青島海洋化工有限公司）；45 mm Lichroprep RP-18反相柱色譜硅膠（日本Fuju Silysia化工有限公司）；Sephadex LH-20凝膠（美國CE公司）；色譜用甲醇、乙腈（英國歐普森公司）；氘代吡啶（美國Cambridge Isotope Laboratories公司）；其他試劑均為分析純。

樣品于2022年6月采集于安徽省金寨縣桃嶺鄉，由安徽中醫藥大學彭華勝教授鑒定其基原為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos（Show.）Wolf，為菌核中間抱有松根的白色部分。鑒定標本（LA20221001）存于安徽中醫藥大學中藥與天然藥物化學教研室。

2 提取與分離

取茯神干燥藥材55 kg，粉碎至20目，用3倍量100%甲醇室溫下冷浸6次，每次24 h。合并提取液，減壓濃縮至無甲醇味，得浸膏800 g。再經硅膠色譜柱二氯甲烷-甲醇（100∶0 ～0∶100）系統梯度洗脫，通過薄層色譜法（TLC）檢識，合并相似流分，得到9個流分段（A1 ～A9）。

流分段A8（4.5 g）經ODS RP-18柱（甲醇-水，20∶10 ～100∶1）梯度洗脫，得到33個亞流分，即A8-1 ～A8-33。流分A8-33經Sephadex LH-20凝膠柱（甲醇）分離，得到8個流分，即A8-33-1～A8-33-8；A8-33-8經半制備型HPLC（乙腈-0.01%甲酸水，65∶35 ～80∶20）分離純化得化合物1（12.57 mg，7.3 min）和化合物2（7.65 mg，8.8 min）。流分A8-32經Sephadex LH-20凝膠柱（甲醇）分離，得到5個流分，即A8-32-1～A8-32-5；A8-32-3經半制備型HPLC（乙腈-0.01%甲酸水，55∶45 ～70∶30，10.2 min）分離純化得化合物3（5.82 mg）。A8-32-5經半制備型HPLC（乙腈-0.01%甲酸水，55∶45 ～70 ∶30，6.6 min）分離純化得化合物4（9.44 mg）。流分A8-31經Sephadex LH-20凝膠柱（甲醇）分離，得到6個流分，即A8-31-1～A8-31-6；A8-31-6經半制備型HPLC（乙腈-0.01%甲酸水，50∶50 ～65∶35）分離純化得化合物5（3.63 mg，7.1 min）和化合物6（4 mg，7.5 min）。流分A8-30經Sephadex LH-20凝膠柱（甲醇）分離，得到6個流分，即A8-30-1 ～A8-30-6；A8-30-5經半制備型HPLC（乙腈-0.01%甲酸水，50∶50 ～65∶35）分離純化得化合物7（33.5 mg，7.0 min）和化合物8（9.6 mg，7.6 min）。A8-30-3經半制備型HPLC（乙腈-0.01%甲酸水，50∶50 ～65∶35，6.6 min）分離純化得化合物9（13.22 mg）。

流分段A7（6.3 g）經ODS RP-18柱（甲醇-水，20∶10 ～100∶1）梯度洗脫，得到31個亞流分，即A7-1 ～A7-31。流分A7-26經Sephadex LH-20凝膠柱（甲醇）分離，得到6個流分，即A7-26-1～A7-26-6；A7-26-3經半制備型HPLC（乙腈-0.01%甲酸水，40∶60 ～55∶45）分離純化得化合物10（14.1 mg，8.7 min）和化合物11（7.4 mg，9.8 min）。

3 結構解析

化合物1：黃色粉末。分子式C30H44O5。ESI-MSm/z：483 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.32 （d，J＝6.2 Hz，1H，H-11），5.27 （d，J＝4.0 Hz，1H，H-7），4.81 （d，J＝2.6 Hz，1H，H-28a），4.74 （1H，s，H-28b），4.50 （t，J＝7.2 Hz，1H，H-16），2.91 （d，J＝11.9 Hz，1H，H-20），2.83（dd，J＝11.2，5.9 Hz，1H，H-17），2.33 （t，J＝8.2 Hz，1H，H-5），1.71 （s，3H，H-29），1.59 （s，3H，H-26），1.57 （s，3H，H-27），1.47 （s，3H，H-30），1.07 （s，3H，H-18），1.01 （s，3H，H-19）。13C-NMR （150 MHz，C5D5N）數據見表1。以上波譜數據與文獻[8]報道基本一致，故鑒定化合物1為茯苓新酸B。

表1 化合物1～6的13C-NMR數據 (150 MHz，C5D5N)Tab 1 13C-NMR data for compounds 1～6 (150 MHz，C5D5N)

化合物2：白色無定形粉末。分子式C31H46O5。ESI-MSm/z：497 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.32 （d，J＝4.9 Hz，1H，H-11），5.27（s，1H，H-7），4.96 （s，1H，H-31a），4.83 （s，1H，H-31b），4.81 （s，1H，H-28a），4.75 （s，1H，H-28b），4.49 （q，J＝12.3，9.8 Hz，1H，H-16），2.93 （td，J＝11.3 Hz，1H，H-16），2.84 （t，J＝8.7 Hz，1H，H-17），2.32 （d，J＝7.6 Hz，1H，H-5），2.26 （t，J＝7.2 Hz，1H，H-25），1.72 （s，3H，H-29），1.47 （s，3H，H-30），1.08 （s，3H，H-18），1.01 （s，3H，H-19），0.97 （d，J＝3.9 Hz，3H，H-27），0.96 （d，J＝3.9 Hz，3H，H-26）。13C-NMR（150 MHz，C5D5N）數據見表1。以上波譜數據與文獻[9]報道基本一致，故鑒定化合物2為茯苓新酸A。

化合物3：白色無定形粉末。分子式C32H48O6。ESI-MSm/z：527 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.49 （s，1H，H-31a），5.29 （s，1H，H-11），5.27 （d，J＝3.9 Hz，1H，H-31b），5.17（s，1H，H-7），4.81 （d，J＝2.5 Hz，1H，H-28a），4.76 （m，1H，H-28b），4.54 （t，J＝7.2 Hz，1H，H-16），3.62 （s，3H，H-OMe），3.01 （s，1H，H-20），2.89 （dd，J＝11.2，5.9 Hz，1H，H-17），2.27 （d，J＝7.5 Hz，1H，H-5），1.71 （s，3H，H-29），1.55 （s，3H，H-26），1.55 （s，3H，H-27），1.43 （s，3H，H-30），1.07 （s，3H，H-18），0.96 （s，3H，H-19）。13C-NMR （150 MHz，C5D5N）數據見表1。以上波譜數據與文獻[10]報道基本一致，故鑒定化合物3為茯苓新酸DM。

化合物4：白色無定形粉末。分子式C30H46O6。ESI-MSm/z：501 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.49 （t，J＝6.9 Hz，1H，H-24），5.00（s，1H，H-28a），4.90 （s，1H，H-28b），4.53 （d，J＝12.2 Hz，1H，H-27a），4.48 （d，J＝7.3 Hz，1H，H-16），4.44 （d，J＝12.2 Hz，1H，H-27b），2.93 （t，J＝11.2 Hz，1H，H-20），2.79 （dd，J＝11.2，5.8 Hz，1H，H-17），2.32 （d，J＝12.9 Hz，1H，H-5），1.97 （s，3H，H-26），1.80 （s，3H，H-29），1.50 （s，3H，H-30），1.14 （s，3H，H-18），0.96 （s，3H，H-19）。13C-NMR （150 MHz，C5D5N）數據見表1。以上波譜數據與文獻[11]報道基本一致，故鑒定化合物4為16α，27-二羥基-3，4-裂環羊毛甾-4（28），8（9），24-三烯-3，21-二酸。

化合物5：白色無定形粉末。分子式C30H44O6。ESI-MSm/z：499 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.87 （d，J＝7.4 Hz，1H，H-28a），5.34（s，H，H-24），5.33 （s，H，H-11），5.28 （s，1H，H-7），5.23 （s，1H，H-28b），4.51 （t，J＝7.4 Hz，1H，H-16），4.26 （d，J＝3.4 Hz，2H，H-29），1.81（s，3H，H-26），1.74 （d，J＝3.5 Hz，3H，H-27），1.49 （s，3H，H-30），1.07 （d，J＝3.5 Hz，3H，H-18），1.03 （s，3H，H-19）。13C-NMR （150 MHz，C5D5N）數據見表1。以上波譜數據與文獻[10]報道基本一致，故鑒定化合物5為茯苓新酸ZC。

化合物6：白色無定形粉末。分子式C30H46O6。ESI-MSm/z：501 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.75 （s，1H，H-28a），5.35 （d，J＝8.6 Hz，1H，H-24），5.15 （s，1H，H-28b），4.48 （m，1H，H-16），1.62 （s，3H，H-27），1.60 （s，3H，H-26），1.48 （s，3H，H-30），1.17 （s，3H，H-18），1.05 （s，3H，H-19）。13C-NMR （150 MHz，C5D5N）數據見表1。以上波譜數據與文獻[10]報道基本一致，故鑒定化合物6為茯苓新酸ZM。

化合物7：白色無定形粉末。分子式C30H44O6。ESI-MSm/z：499 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.45 （d，J＝7.3 Hz，1H，H-24），5.30（d，J＝7.7 Hz，1H，H-11），5.26 （d，J＝8.8 Hz，1H，H-7），4.81 （s，1H，H-28a），4.75 （s，1H，H-28b），4.51 （d，J＝11.9 Hz，1H，H-27a），4.47 （m，3H，H-16），4.42 （d，J＝11.6 Hz，1H，H-27b），1.95 （s，3H，H-26），1.71 （s，3H，H-29），1.46 （s，3H，H-30），1.06 （s，3H，H-18），1.03 （s，3H，H-19）。13C-NMR （150 MHz，C5D5N）數據見表2。以上波譜數據與文獻[10]報道基本一致，故鑒定化合物7為茯苓新酸E。

表2 化合物7～11的13C-NMR數據 (150 MHz，C5D5N)Tab 2 13C-NMR data for compounds 7～11 (150 MHz，C5D5N)

化合物8：白色無定形粉末。分子式C31H46O6。ESI-MSm/z：513 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.48 （s，1H，H-11），5.33 （d，J＝5.1 Hz，1H，H-11），5.29 （d，J＝3.9 Hz，1H，H-7），5.16 （s，1H，H-31b），4.83 （d，J＝2.9 Hz，1H，H-28a），4.76 （d，J＝2.7 Hz，1H，H-28b），4.53（dd，J＝8.4，6.1 Hz，1H，H-16），3.01 （m，1H，H-20），2.89 （ddd，J＝10.8，6.0，2.7 Hz，1H，H-17），2.34 （d，J＝7.3 Hz，1H，H-5），1.73 （s，3H，H-29），1.55 （s，3H，H-27），1.54 （s，3H，H-26），1.49 （s，3H，H-30），1.09 （s，3H，H-18），1.03 （s，3H，H-19）。13C-NMR （150 MHz，C5D5N）數據見表2。以上波譜數據與文獻[10]報道基本一致，故鑒定化合物8為茯苓新酸D。

化合物9：白色無定形粉末。分子式C30H46O6。ESI-MSm/z：501 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.34 （s，1H，H-11），5.29 （m，1H，H-7），4.82 （s，1H，H-28a），4.76 （s，1H，H-28b），4.50 （t，J＝9.5 Hz，1H，H-16），1.75 （s，3H，H-29），1.49 （s，3H，H-30），1.36 （s，6H，H-26，27），1.09 （s，3H，H-18），1.03 （s，3H，H-19）。13C-NMR （150 MHz，C5D5N）數據見表2。以上波譜數據與文獻[10]報道基本一致，故鑒定化合物9為茯苓新酸ZG。

化合物10：白色無定形粉末。分子式C30H46O7。ESI-MSm/z：517 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.33 （brs，1H，H-11），5.27 （brs，1H，H-7），4.83 （s，1H，H-29a），4.77 （s，1H，H-29b），4.53 （m，1H，H-16），3.84 （m，1H，H-24），1.73 （s，3H，H-28），1.49 （s，6H，H-27，30），1.45 （s，3H，H-26），1.07 （s，3H，H-18），1.03 （s，3H，H-19）。13C-NMR （150 MHz，C5D5N）數據見表2。以上波譜數據與文獻[11]報道基本一致，故鑒定化合物10為茯苓新酸M。

化合物11：白色無定形粉末。分子式C31H46O7。[α]25D30.8 （c 0.7，CH3OH）；ESI-MSm/z：529 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.60 （s，1H，H-31a），5.33 （d，J＝4.6 Hz，1H，H-31b），5.32 （s，1H，H-11），5.28 （d，J＝3.8 Hz，1H，H-7），4.83 （s，1H，H-29a），4.77 （s，1H，H-29b），4.53 （t，J＝7.4 Hz，1H，H-16），1.74 （s，3H，H-28），1.66 （s，3H，H-27），1.49 （s，3H，H-30），1.08 （s，3H，H-18），1.03 （s，3H，H-19）。13C-NMR（150 MHz，C5D5N）數據見表2。以上波譜數據與文獻[11]報道基本一致，故鑒定化合物11為茯苓新酸L。同時針對C-25位立體構型確定，將化合物11與Mo2（OAc）4試劑以二甲基亞砜（DMSO）為溶劑混合后測定ICD圖譜（見圖2）。圖中314 nm處Cotton效應為負，根據Snatzke經驗規則[12]，該二醇體系的二面角扭角為逆時針方向，從而確定化合物中C-25位的絕對構型為25R。

圖2 化合物11與Mo2（OAc）4的配合物在DMSO中的CD圖譜Fig 2 CD spectra of in situ formed Mo2（OAc）4 complexes of 11 recorded in DMSO

4 討論

臨床用藥中的茯苓皮、茯苓和茯神均來源于茯苓菌核，但藥用部位不同，功效作用也不相同，茯神長于寧心益智從而安神，茯苓長于健脾滲濕，赤茯苓長于行水利濕、益心潤肺，茯苓皮長于利水消腫。茯苓的主要化學成分為多糖、三萜類、甾醇等。王宏俠[13]的研究表明茯苓皮、茯神、茯苓中總三萜含量依次升高，按植物形態學由內及外的順序，茯神、茯苓、赤茯苓、茯苓皮中3，4-裂環-羊毛甾茯苓三萜類化合物含量相對增高，而閉環羊毛甾茯苓三萜類化合物含量相對降低，通過主成分分析（PCA）法尋找的茯神、茯苓、茯苓皮差異化合物為茯苓新酸D、松苓酸，通過t-檢驗尋找的茯神與茯苓、茯苓皮的差異化合物為26-羥基茯苓新酸G、16-α-乙酰氧基-羊毛甾-8，24-二烯-21-酸、羊毛甾-7，9（11），24-三烯-21-酸[13]。

三萜類成分類型和含量可能為茯神功效區別于茯苓的重要物質基礎[14]。本研究從茯神中分離得到11個裂環羊毛甾烷類化合物，其中6個化合物為首次從茯苓的藥用部位茯神中得到，進一步豐富了茯神的化學成分種類，可為今后發掘茯神安神寧心的藥效物質基礎提供科學依據。