薔薇紅景天總黃酮提取物對Aβ25-35誘導PC12細胞損傷的保護作用及其活性部位篩選

劉忠毅，王啟文，阿孜古麗·阿里木，王曉梅，胡君萍，王新玲（新疆醫科大學藥學院，烏魯木齊 830011）

薔薇紅景天（RhodiolaroseaL.）為景天科（Crassulaceae）紅景天屬（Rhodiola）多年生草本植物，是新疆的重要植物資源之一，據《新疆藥用植物志》記載[1]，其主要分布于新疆天山山脈1600～2700米的高寒地區，藥用部位主要為根及根莖，具有清肺止咳、止血、止帶等功效，也用作滋補強壯藥[2]。近年研究表明薔薇紅景天還具有強壯機體、抗腦缺氧、抗疲勞、增強記憶、延緩衰老等作用[3]。

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種多發于老年人的由多種因素引起的中樞神經退行性疾病，臨床癥狀主要為患者記憶力喪失、認知功能障礙等，嚴重影響著老年人的身心健康，也加重了國家醫療體系負擔[4]。目前臨床治療以緩解癥狀為主，減輕或阻止疾病的進程并不理想。中藥在治療AD方面表現出獨特的優勢，也是藥物研發的重要來源?，F代藥理研究表明，黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎、神經保護以及增強認知功能等方面的作用[5-6]，可從多靶點改善AD模型動物的認知功能障礙，減輕AD樣病理癥狀，抑制AD的病理進程[7]。課題組前期從新疆薔薇紅景天中得到了山柰酚-7-O-α-L-鼠李糖苷及其苷元山柰酚、5，7，3'，5'-四羥基二氫黃酮及草質素-7-O-α-L-鼠李糖苷等黃酮類化合物[8]，并對總黃酮進行了提取和純化工藝研究，得到的提取物和純化物的總黃酮含量分別為56.97%和82.83%[9]，藥理作用結果表明，其總黃酮提取物具有較好的抗炎和對Aβ25-35誘導HT22細胞損傷的保護作用，且安全無毒[10]。鑒于前期所選純化工藝存在流速慢而耗時、收率低而不利于工業化生產等缺點，故本研究以薔薇紅景天總黃酮提取物（total flavonoids extract，TFE）為研究對象，經AB-8大孔吸附樹脂分離，得不同體積分數的乙醇洗脫物；測定不同洗脫物總黃酮含量同時，利用Aβ25-35誘導分化PC12細胞構建AD炎癥細胞模型，通過觀察PC12細胞形態、檢測PC12細胞活力及細胞培養液中炎癥因子包括白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、環氧合酶-2（COX-2）和白細胞介素-1β（IL-1β）的水平，探究不同體積分數的乙醇洗脫物對β-淀粉樣蛋白25-35（Aβ25-35）誘導細胞損傷的保護作用，篩選活性部位并闡明其中藥效物質基礎，為進一步研究開發和應用新疆薔薇紅景天提供理論依據。

1 材料

薔薇紅景天購于新疆伊犁，由新疆醫科大學藥學院叢媛媛教授鑒定為景天科紅景天屬植物薔薇紅景天（RhodiolaroseaL.）的干燥根莖，標本保存于新疆醫科大學藥學院天然藥物化學/生藥學教研室。薔薇紅景天總黃酮提取物（TFE，總黃酮含量56.97%）由新疆醫科大學藥學院天然藥物化學/生藥學教研室自制[9]。

胎牛血清（VivaCell，批號：2148389）；DMEM高糖培養基（Servicebio，貨號：G4511-500 mL）；磷酸緩沖液（PBS）、0.25%胰蛋白酶消化液、青霉素＋鏈霉素（VivaCell公司）；Aβ25-35（美國Sigma公司，HPLC≥97%，批號：A4559-1MG）；MTT（德國Biofroxx公司）；BCA總蛋白定量試劑盒（北京索萊寶公司，批號：20220311）；乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為20220706、20220705）；IL-6、TNF-α、COX-2、IL-1β酶聯免疫試劑盒（上海將來實業股份有限公司，批號分別為JL13202、JL20896、JL20884、JL21044）；鹽酸多奈哌齊片（植恩生物技術股份有限公司，批號：H20010723）；蘆?。兌龋?8%，中國食品藥品檢定研究院，批號：0080-9705）；PC12細胞（高分化，大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤，武漢普賽諾生命科技有限公司）。

UV2700紫外可見分光光度計（日本島津公司）；N-1001型旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司）；AB135-S型十萬分之一電子天平（Mettler Toledo公司），Heracell型CO2恒溫培養箱（美國賽默飛公司）；KS12型超凈工作臺、KS12型離心機（美國Thermo Scientific公司）；MLS-3750型高壓蒸汽滅菌鍋（日本三洋電機株式會社）；W-HL828型－80℃超低溫冰箱（中科美菱）；01562型熒光倒置顯微鏡（上海蔡司光學儀器）；Multiskan GO全波長酶標儀（Thermo Fisher公司）。

2 方法與結果

2.1 總黃酮含量測定

2.1.1 TFE不同體積分數乙醇洗脫物母液的制備 稱取薔薇紅景天TFE適量，采用AB-8大孔吸附樹脂柱色譜法分離，分別經3倍柱體積的蒸餾水及20%、40%、60%、80%及95%乙醇溶液進行梯度洗脫，得不同體積分數乙醇洗脫液，減壓濃縮、干燥，得干浸膏，計算收率。分別記為TFE-0%、TFE-20%、TFE-40%、TFE-60%、TFE-80%、TFE-95%。精密稱取不同體積分數乙醇洗脫物干浸膏10 mg，用70%乙醇溶解，定容于10 mL量瓶中，搖勻，即得1.0 mg·mL－1各洗脫物樣品溶液，4℃保存備用。

2.1.2 總黃酮含量測定方法 參考相關文獻[11]并對測定方法略加優化。在全波長掃描所確定的508 nm波長下測定吸光度（A），以蘆丁對照品溶液質量濃度（X）為橫坐標，A為縱坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程A＝11.631X＋0.008，r＝0.9999，線性范圍為0.016～0.080 mg·mL－1。

2.1.3 蘆丁對照品溶液的配制 精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品8.0 mg，置50 mL量瓶中，加70%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得0.16 mg·mL－1蘆丁對照品溶液，4℃保存備用。

2.1.4 標準曲線的繪制 精密量取蘆丁對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL量瓶中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min；再加入10%硝酸鋁溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min；再加入4% NaOH溶液4.0 mL，70%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置15 min；以70%乙醇溶劑為空白。

2.1.5 TFE不同體積分數乙醇洗脫物中總黃酮含量的測定 分別精密量取適量TFE不同體積分數乙醇洗脫物母液，按“2.1.2”項下方法分別測定吸光度，根據標準曲線計算相應的總黃酮含量。

2.2 TFE不同體積分數乙醇洗脫物對Aβ25-35誘導損傷的PC12細胞保護作用

2.2.1 細胞培養與分組 PC12細胞復蘇后，在含10%胎牛血清和青霉素100 U·mL－1＋鏈霉素100 U·mL－1的DMEM高糖培養基中37℃、5%CO2培養箱培養，1～2 d傳代1次，達到對數生長期后開始實驗。

PC12細胞損傷模型采用20 μmol·L－1Aβ25-35建立。分組如下：陰性組（只加完全培養液）、空白組（含細胞的完全培養液）、模型組（20μmol·L－1Aβ25-35）、TFE-0%組（TFE-0%＋20μmol·L－1Aβ25-35）、TFE-20%組（TFE-20%＋20 μmol·L－1Aβ25-35）、TFE-40%組（TFE-40%＋20 μmol·L－1Aβ25-35）、TFE-60%組（TFE-60%＋20 μmol·L－1Aβ25-35）、TFE-80%組（TFE-80%＋20 μmol·L－1Aβ25-35）、TFE-95%組（TFE-95%＋20 μmol·L－1Aβ25-35）、鹽酸多奈哌齊組（鹽酸多奈哌齊＋20 μmol·L－1Aβ25-35）。

2.2.2 溶液配制

① Aβ25-35溶液：將1 mg Aβ25-35溶解于940μL PBS溶液中，放入37℃培養箱孵育7 d，使其老化形成凝聚態，再分裝成每支100 μL放入－20℃冰箱保存，使用前取出，4℃保存備用。

② 藥物溶液：TFE不同體積分數乙醇洗脫物（TFE-0%、TFE-20%、TFE-40%、TFE-60%、TFE-80%、TFE-95%）與鹽酸多奈哌齊用二甲基亞砜（DMSO）溶解，加入完全培養基使DMSO終濃度為0.1% mmol·L－1，4℃保存備用。使用時用完全培養基對藥物溶液進行稀釋，得到所需的濃度。

2.2.3 MTT法檢測TFE不同體積分數乙醇洗脫物對PC12細胞存活率 取對數生長期的細胞進行消化，加入DMEM完全培養基重懸，計數，將濃度稀釋至5×104個·mL－1，接種于96孔板中，待細胞貼壁后，各組分別加入TFE-0%、TFE-20%、TFE-40%、TFE-60%、TFE-80%、TFE-95%及鹽酸多奈哌齊不同濃度與PC12細胞共同培養24 h，每組設置3個平行對照。MTT法檢測細胞活力，根據細胞存活率確定藥物的安全濃度。

2.2.4 MTT法檢測TFE不同體積分數乙醇洗脫物對Aβ25-35損傷的PC12細胞存活率的影響 將PC12細胞按5×104個·mL－1接種于96孔板中，待細胞貼壁后，按照“2.2.1”項下方法進行分組，除空白組和模型組外，其他各組分別加入TFE-0%、TFE-20%、TFE-40%、TFE-60%、TFE-80%、TFE-95%及鹽酸多奈哌齊進行干預4 h，再加入20μmol·L－1Aβ25-35共同培養24 h，每組設置3個平行對照，放入37℃、5% CO2培養箱中培養24 h后，MTT法檢測細胞活力。

2.2.5 細胞形態學觀察 將PC12細胞按5×104個·mL－1接種于12孔板中，待細胞貼壁后，按照“2.2.4”項下方法分組給藥，共同培養24 h后，在倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態并記錄。

2.2.6 PC12細胞中LDH漏出量和SOD水平的測定 細胞以每孔1 mL的體積接種于24孔細胞培養板中，培養24 h，待細胞貼壁生長后，棄去上清液。按照“2.2.1”項下方法分組，每組設置3個平行對照組，實驗組均每孔給藥500 μL，空白組加無血清培養液，培養4 h后，每孔加入500 μL 40 μmol·L－1Aβ25-35損傷（終濃度為20 μmol·L－1），共同培養24 h后，收集細胞和細胞培養液。嚴格按照試劑盒說明書在450 nm處測定吸光度值OD，按下列公式計算各組LDH漏出量和SOD活力。

LDH漏出量（IU·L－1）＝（OD測定孔－OD對照孔）/（OD標準孔－OD空白孔）×標準品濃度（0.2 μmol·mL－1）×1000

SOD活力（U·mgprot－1）＝SOD抑制率/50%×稀釋倍數/待測樣本蛋白濃度

2.2.7 ELISA法檢測細胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β、COX-2的分泌量 按照“2.2.6”項下方法干預細胞，收集細胞培養液，離心并收集上清液，嚴格按照IL-1β、COX-2、TNF-α及IL-6試劑盒說明書操作進行后續實驗。450 nm處酶標儀測定吸光度，然后計算細胞炎癥因子IL-1β、COX-2、TNF-α及IL-6的分泌水平。

2.3 統計學處理

所有實驗數據結果以均數±標準差（±s）表示，統計分析采用SPSS 21.0統計軟件，實驗數據采用單因素方差（One-way ANOVA）分析，以P＜0.05為統計學有統計學意義。

2.4 結果與分析

2.4.1 TFE不同體積分數乙醇洗脫物中總黃酮的含量

計算TFE不同體積分數乙醇洗脫物浸膏得率，賦予浸膏得率0.3權重，再根據“2.1.4”項下標準曲線計算不同洗脫物中總黃酮濃度，賦予總黃酮濃度0.7權重，以總得分為評價標準，得分越高，表明該洗脫物越優。結果見表1，TFE-40%洗脫物總黃酮濃度可達91.12%，浸膏得率為23.17%，總得分為70.74，高于其他體積分數的乙醇洗脫物。

表1 TFE不同體積分數乙醇洗脫物浸膏得率及總黃酮含量及其得分(n＝3)Tab 1 Extract yield and total flavonoid content of TFE different volume fractions ethanol elution and their scores (n＝3)

2.4.2 TFE不同體積分數乙醇洗脫物對PC12細胞存活率的影響 結果顯示，與空白組相比，鹽酸多奈哌齊在50 μmol·L－1時，細胞活力無統計學意義；TFE-40%、TFE-60%及TFE-95%在800 μg·mL－1時，PC12細胞活力明顯下降（P＜0.05）；TFE-0%、TFE-20%及TFE-80%組在800 μg·mL－1時細胞活力差異無統計學意義；而TFE各洗脫物在給藥劑量為400 μg·mL－1時，對PC12細胞存活率的影響較小，均未表現出明顯毒性，見表2。為保持單一變量，故在后續實驗中均選擇400 μg·mL－1為TFE不同體積分數乙醇洗脫物的給藥濃度。

表2 TFE不同體積分數乙醇洗脫物對PC12細胞存活率的影響(±s，n＝3)Tab 2 Effect of ethanol eluent of different volume fractions of TFE on the survival rate of PC12 cells (±s，n＝3)

表2 TFE不同體積分數乙醇洗脫物對PC12細胞存活率的影響(±s，n＝3)Tab 2 Effect of ethanol eluent of different volume fractions of TFE on the survival rate of PC12 cells (±s，n＝3)

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。Note：Compared with the blank group，*P＜0.05，**P＜0.01.

組別劑量細胞存活率/%空白組－100鹽酸多奈哌齊組12.5 μmol·L－1115.99±7.18*25 μmol·L－1119.10±5.04**50 μmol·L－1106.10±8.87 TFE-0%組200 μg·mL－1118.41±7.66**400 μg·mL－1117.11±4.57*800 μg·mL－1105.65±9.54 TFE-20%組200 μg·mL－1107.54±3.92 400 μg·mL－1101.30±5.75 800 μg·mL－1 95.65±6.90 TFE-40%組200 μg·mL－1100.21±3.13 400 μg·mL－1 90.72±10.01 800 μg·mL－1 76.09±5.01*TFE-60%組200 μg·mL－1106.13±5.68 400 μg·mL－1102.96±4.58 800 μg·mL－1 85.51±3.62**TFE-80%組200 μg·mL－1133.04±4.94**400 μg·mL－1129.86±5.90**800 μg·mL－1 99.57±3.01 TFE-95%組200 μg·mL－1137.97±1.33**400 μg·mL－1136.81±2.96**800 μg·mL－1 78.12±4.65**

2.4.3 TFE不同體積分數乙醇洗脫物對Aβ25-35誘導的PC12細胞存活率的影響 表3結果顯示，與空白組相比，模型組細胞存活率明顯下降（P＜0.01）；與模型組相比，400 μg·mL－1的TFE-0%與TFE-20%組細胞存活率差異無統計學意義；TFE-40%、TFE-60%、TFE-80%、TFE-95%與鹽酸多奈哌齊組細胞存活率均明顯上升（P＜0.01）。

表3 TFE不同體積分數乙醇洗脫物對Aβ25-35誘導的PC12細胞存活率的影響(±s，n＝3)Tab 3 Effect of ethanol eluent of different volume fractions of TFE on Aβ25-35 induced PC12 cell viability (±s，n＝3)

表3 TFE不同體積分數乙醇洗脫物對Aβ25-35誘導的PC12細胞存活率的影響(±s，n＝3)Tab 3 Effect of ethanol eluent of different volume fractions of TFE on Aβ25-35 induced PC12 cell viability (±s，n＝3)

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。Note：Compared with the blank group，##P＜0.01；compared with the model group，*P＜0.05，**P＜0.01.

組別劑量細胞存活率/%LDH漏出量/（U·L－1）SOD水平/（U·mgprot－1）空白組－100160.42±13.01336.08±3.04模型組 20 μmol·L－169.75±1.96##333.33±15.73##227.32±28.35##TFE-0%組400 μg·mL－169.43±2.56289.58±19.09*258.09±32.04*TFE-20%組400 μg·mL－172.80±2.34279.17±25.26**275.80±2.02**TFE-40%組400 μg·mL－181.16±0.88**233.33±21.95**296.97±8.50**TFE-60%組400 μg·mL－180.49±3.88**222.92±21.95**287.59±1.23**TFE-80%組400 μg·mL－176.22±0.97**243.75±10.83**284.64±8.67**TFE-95%組400 μg·mL－176.26±0.75**247.92±23.66**309.29±7.25**鹽酸多奈哌齊組 50 μmol·L－175.63±3.08**220.83±19.09**321.88±9.27**

2.4.4 TFE不同體積分數乙醇洗脫物對Aβ25-35誘導的PC12細胞LDH漏出量和SOD水平的影響 與空白組相比，模型組LDH漏出量明顯升高（P＜0.01），SOD水平明顯下降（P＜0.01），說明Aβ25-35對PC12細胞有一定程度的損傷。與模型組相比，TEF-0%組SOD水平明顯上升，LDH漏出量明顯下降（P＜0.05），TFE-20%、TFE-40%、TFE-60%、TFE-80%、TFE-95%組及鹽酸多奈哌齊組的SOD水平明顯升高（P＜0.01），LDH漏出量明顯下降（P＜0.01），結果見表3。

2.4.5 細胞形態學觀察 由圖1可知，空白組PC12細胞形態結構完整，多呈梭形結構，有多個突觸。模型組細胞經20 μmol·L－1Aβ25-35誘導24 h后，細胞形態發生了明顯損傷，細胞間隙變大，出現細胞碎片，細胞數目減少，且突觸明顯減少。與模型組相比，TFE-0%組、TFE-20%組細胞形態無明顯改變，但細胞碎片增加，細胞間隙變大，出現明顯損傷；TFE-40%組、TFE-60%組和鹽酸多奈哌齊組細胞形態均有一定程度改善，細胞數目增多，細胞突觸增加，且細胞形態較為完整；TFE-80%與TFE-95%組的細胞突觸變長，但細胞碎片、間隙無明顯改善。說明TFE-40%組、TFE-60%組和鹽酸多奈哌齊組對Aβ25-35誘導損傷的PC12細胞結構及形態均有一定程度的保護作用。

圖1 倒置顯微鏡下觀察PC12細胞形態變化（×100）Fig 1 Morphological changes of PC12 cells under inverted microscope（×100）

2.4.6 TFE不同體積分數乙醇洗脫物對Aβ25-35誘導的PC12細胞上清液中IL-1β、COX-2、TNF-α及IL-6水平的影響 與空白組相比，模型組中IL-1β、COX-2、TNF-α及IL-6分泌量均明顯上升（P＜0.01）；與模型組相比，TEF-0%與TEF-20%組對細胞中COX-2、TNF-α和IL-6的分泌量差異無統計學意義，TEF-20%組中細胞IL-6的分泌量明顯下降（P＜0.05）；TFE-40%組、TFE-60%組、TFE-80%組、TFE-95%組及鹽酸多奈哌齊組使細胞中IL-1β、COX-2、TNF-α及IL-6的分泌量均明顯下降（P＜0.05），且TFE-40%組對IL-1β和TNF-α的影響強于其他給藥組，結果見表4。

表4 PC12細胞上清液中IL-1β、COX-2、TNF-α及IL-6分泌量(±s，n＝3)Tab 4 Secretion of IL-1β，COX-2，TNF-α and IL-6 in the supernatant of PC12 cells (±s，n＝3)

表4 PC12細胞上清液中IL-1β、COX-2、TNF-α及IL-6分泌量(±s，n＝3)Tab 4 Secretion of IL-1β，COX-2，TNF-α and IL-6 in the supernatant of PC12 cells (±s，n＝3)

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。Note：Compared with the blank group，##P＜0.01；compared with the model group，*P＜0.05，**P＜0.01.

組別劑量IL-1β/（pg·mL－1）COX-2/（ng·mL－1）TNF-α/（pg·mL－1）IL-6/（pg·mL－1）空白組－ 27.82±2.17 0.99±0.13 23.59±1.98 40.15±3.46模型組 20 μmol·L－1 50.26±4.51## 3.23±0.25## 58.72±7.62## 79.19±1.69##TFE-0%組400 μg·mL－1 46.40±4.12 3.24±0.14 58.99±4.27 72.95±1.65 TFE-20%組400 μg·mL－1 44.52±3.31* 2.82±0.16 54.16±1.05 70.81±3.37 TFE-40%組400 μg·mL－1 33.96±2.37** 2.34±0.08** 39.21±1.86** 62.58±1.76**TFE-60%組400 μg·mL－1 35.01±2.34** 2.21±0.18** 41.56±2.09** 61.16±1.71**TFE-80%組400 μg·mL－1 38.73±2.21** 2.67±0.09* 44.23±1.65** 63.41±1.93**TFE-95%組400 μg·mL－1 38.01±1.85** 2.56±0.26** 40.84±3.81** 60.86±2.26**鹽酸多奈哌齊組 50 μmol·L－1 32.86±1.63** 2.06±0.11** 35.67±2.51** 56.36±1.37**

3 討論

在正常生理情況下，Aβ淀粉中的蛋白堆積量與其水解時間基本是趨于一致的；但病理條件下，Aβ蛋白質的分解數量會增加，水解次數減少，過量降解產生的Aβ蛋白易凝結形成一個寡聚體，寡聚體間的過度聚集會形成一種難溶性的淀粉斑塊，并沉積在大腦皮層；高濃度的Aβ淀粉聚集具有神經毒性，會導致全身各種特異性免疫的炎癥反應、神經毒性級聯排斥反應以及大量神經元細胞壞死、變性甚至死亡，最終導致AD的形成[12-13]。目前臨床上可用于治療AD的藥物較少，目前有單克隆抗體（阿杜那單抗與侖卡那單抗）和典型的小分子化合物如多奈哌齊、美金剛和卡巴拉汀外，還有來源于天然植物的EGb 761和GV-971，EGb 761是銀杏葉的標準化提取物，其主要活性成分為類黃酮和銀杏內酯[14]。天然黃酮化合物是一類具有廣泛活性的成分，可經腸道吸收，穿過血腦屏障，通過抑制腦組織炎癥因子的表達和分泌、減輕氧化應激造成的損傷、抑制神經元凋亡、降低膽堿酯酶活性、減少Aβ聚集和形成而改善與年齡相關的認知障礙[15]。因此黃酮類化合物已成為一種潛在的神經保護劑，有望開發成為抗AD的藥物[16]。

本研究通過考察薔薇紅景天TFE不同體積分數乙醇洗脫物總黃酮含量、浸膏得率、對Aβ25-35誘導損傷PC12細胞的存活率、細胞形態及拮抗炎癥因子的能力，發現TFE-40%組總黃酮濃度（91.12%）和浸膏得率（23.17%）的綜合評分高于其他各組；20 μmol·L－1Aβ25-35作用于PC12細胞24 h后，細胞碎片增多，細胞間隙增大，細胞活力明顯下降，細胞形態明顯受損，當薔薇紅景天TFE不同體積分數乙醇洗脫物干預后，發現TFE-40%組與TFE-60%組中細胞形態得到明顯改善，細胞存活率明顯上升。

SOD屬于抗氧化酶類，通過清除自由基及減少過氧化物的生成而發揮抗氧化損傷的作用，其水平高低可間接反映自由基含量的高低；當PC12細胞受到具有神經毒性的Aβ蛋白損傷后，細胞膜通透性增加而致LDH從細胞質中溢出，反映出細胞受損的程度。本研究結果顯示20 μmol·L－1Aβ25-35誘導損傷PC12細胞的存活率和SOD水平均顯著下降，LDH漏出量顯著升高，而薔薇紅景天TFE不同體積分數乙醇洗脫物干預后，可不同程度地提高PC12細胞存活率和SOD水平，降低LDH漏出量；提示薔薇紅景天TFE不同體積分數乙醇洗脫物可能會通過促進PC12細胞生成SOD而清除氧自由基，通過降低LDH漏出量而維持細胞膜的完整性，其中TFE-40%洗脫物組的作用強于其他各洗脫物組。

PC12細胞來源于大鼠腎上腺髓質嗜鉻瘤細胞，其細胞形態、結構、功能與神經元細胞相似，因此，在AD的炎癥反應和氧化應激損傷研究中，通常選擇Aβ誘導的PC12細胞建立AD細胞模型[17-18]。有研究表明，Aβ引起的NLRP3炎癥小體激活是AD患者和APP/PS1小鼠疾病進展中炎癥反應的關鍵過程[19]，過量堆積的Aβ蛋白斑塊會激活NLRP3炎癥小體分泌各種促炎癥分子，如IL-1、IL-6、TNF-α、自由基和趨化因子等而損傷神經元[20]。已有研究證實在AD患者體內TNF-α、IL-1β、IL-6及COX-2等炎癥因子的水平高于正常人[21]，Aβ25-35誘導的炎癥反應導致神經元細胞凋亡和突觸損失，COX-2通過炎癥信號、生長因子、缺氧等誘導致炎癥反應加重[22]，進而會加速Aβ的沉積和AD的進展[23]。本研究顯示，20 μmol·L－1Aβ25-35誘導損傷PC12細胞后，刺激TNF-α、IL-1β、IL-6及COX-2等炎癥因子的過度表達，進一步誘發加重炎癥反應，細胞存活率下降，形態發生變化，突觸減少。薔薇紅景天TFE不同體積分數乙醇洗脫物中，除TFE-0%組和TFE-20%組外，其他各洗脫物組均能明顯降低TNF-α、IL-1β、IL-6及COX-2的水平，拮抗Aβ25-35誘發的炎性神經毒性，降低細胞凋亡，提高細胞存活率；且發現TFE-40%組抑制TNF-α、IL-1β、IL-6及COX-2的釋放能力強于其他各洗脫物組。

綜上所述，總黃酮濃度最高的薔薇紅景天TFE-40%可通過促進清除Aβ25-35誘導損傷的PC12細胞中的氧自由基，維持細胞膜的完整性，拮抗Aβ25-35誘發的炎性神經毒性，抑制細胞凋亡而起到保護損傷細胞的作用，TFE-40%中總黃酮含量可達91.12%，提示TFE-40%是以總黃酮為藥效物質基礎的具有保護受損神經細胞作用的活性部位，結合本課題組前期研究基礎和洗脫溶劑極性大小推測，TFE-40%中主要為極性大的游離黃酮類、二氫黃酮類及其苷類成分。后續將進一步對TFE-40%在保護受損神經細胞作用機制及其活性成分方面進行深入研究，為開發薔薇紅景天在抗AD方面提供理論依據。