pH值對氟馬西尼注射液質量的影響研究

郭丹峰，金怡平，肖利輝，袁金橋（嘉實（湖南）醫藥科技有限公司，長沙 410217）

氟馬西尼作為一種苯二氮?類藥物的拮抗劑，可與苯二氮?受體特異性結合，減少γ-氨基丁酸的釋放[1]，臨床主要用于逆轉苯二氮?類藥物所致的中樞鎮靜作用[2]，如終止用苯二氮?類藥物誘導及維持的全身麻醉。根據其特定的臨床用途以及肝臟首過效應的影響[3]，目前國內外上市的劑型均為注射液[4]。氟馬西尼是一種酯類化合物，易水解生成雜質A，如圖1所示，可能導致氟馬西尼注射液的性狀、溶液澄清度與顏色、可見異物、不溶性微粒和含量在貯藏期間發生改變，影響藥品的安全性和有效性。pH值作為影響雜質A降解速度的關鍵因素之一，暫無文獻報告其對氟馬西尼注射液質量穩定性的影響。本文參考國內外藥典規定的pH值范圍，按照參比制劑的處方制備不同pH值的氟馬西尼注射液，考察自制氟馬西尼注射液與參比制劑質量的穩定性，為制劑工藝中pH值的選擇提供科學依據。

圖1 氟馬西尼的水解反應Fig 1 Hydrolysis reaction of flumazenil

1 儀器與試藥

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；XS105DU型分析天平（精度：0.01 mg）、FE28型pH計（瑞士梅特勒托利多）；FCD-2000型恒溫鼓風干燥箱（上?，槴\實驗設備有限公司）；Milli-Q純水儀（德國默克）；YXQ-LS-50A型立式高壓蒸汽滅菌器（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；AGL-2型安瓿拉絲灌封機（長沙益廣制藥機械有限公司）；SHH-12W-SD型穩定性試驗箱（重慶康誠永生試驗設備有限公司）；YB-2型澄明度檢測儀（天大天發科技有限公司）；LE100型微粒檢測儀（蘇州蘇凈儀器自控設備有限公司）。

氟馬西尼對照品（批號：100727-202003，純度：99.9%，中國食品藥品檢定研究院）；雜質A對照品（批號：190901，純度：99.4%，自制）；氟馬西尼（原料藥，批號：180101，湖南華納大藥廠手性藥物有限公司）；依地酸二鈉（輔料級，批號：102320180301，湖南爾康制藥股份有限公司）；醋酸（輔料級，批號：20180403，臺山市新寧制藥有限公司）；氯化鈉（輔料級，批號：01170803，天津壽光藥業股份有限公司），氫氧化鈉（輔料級，批號：180901，四川金山制藥有限公司），甲醇（色譜純，Sigma，批號：WXBC3660V）；水為超純水；磷酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20180315）；四氫呋喃（色譜純，Sigma，批號：WXBC6565V）；氟馬西尼參比制劑（批號：F4001F02，規格：5 mL/0.5 mg，Cheplapharm Arzneimittel GmbH）。

2 方法與結果

2.1 氟馬西尼注射液的制備

取純化水400 mL，水浴維持60～70℃，依次加入參比制劑處方量的氯化鈉、依地酸二鈉和冰醋酸，攪拌使溶解，再加入氟馬西尼50 mg，攪拌使溶解，冷卻，平行配制6份，用稀冰醋酸溶液或0.1%氫氧化鈉溶液分別調節pH值為3.0、3.4、3.8、4.2、4.6和5.0，再分別用純化水定容至500 mL，用0.22 μm濾膜過濾，照每支5 mL灌裝，熔封，于121℃濕熱滅菌15 min，放冷，即得。

2.2 有關物質和含量分析方法的驗證

2.2.1 色譜條件 照《中國藥典》2020年版二部氟馬西尼注射液有關物質和含量測定方法的色譜條件[5]，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑[Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）]，以稀磷酸溶液（取水1000 mL，用磷酸調節pH至2.0）-甲醇-四氫呋喃（80∶13∶7）為流動相進行洗脫；流速為1.0 mL·min－1；檢測波長為230 nm；柱溫為30℃；進樣量為20 μL。

2.2.2 專屬性試驗 取冰醋酸、依地酸二鈉、氯化鈉和氫氧化鈉適量，用水溶解并稀釋制成處方濃度的溶液，作為空白輔料溶液；以流動相作為空白溶液；取雜質A適量，加甲醇適量使溶解，再用水定量稀釋制成每l mL中約含雜質A 0.5 μg的溶液，作為雜質A溶液；取氟馬西尼注射液作為樣品溶液。取各溶液進樣，結果空白溶液和輔料不干擾主峰和雜質峰檢測，樣品溶液色譜圖中無未知雜質，雜質A峰與主峰之間的分離度為22.2，主峰拖尾因子為1.1，說明本方法具有良好的專屬性，典型圖譜見圖2。

圖2 氟馬西尼注射液色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of flumazenil injection

2.2.3 檢測限和定量限 取雜質A對照品和氟馬西尼對照品適量，精密稱定，加甲醇適量使溶解，再用水稀釋至信噪比等于3的溶液（即檢測限溶液），信噪比等于10的溶液（即定量限溶液）。結果雜質A和氟馬西尼檢測限分別為0.001和0.002 μg·mL－1，定量限分別為0.003和0.006 μg·mL－1。雜質A和氟馬西尼定量限濃度相當于樣品溶液中主成分濃度的0.003%和0.006%，說明本方法具有較好的靈敏度。

2.2.4 線性關系考察 取雜質A對照品和氟馬西尼對照品適量，精密稱定，加甲醇適量使溶解，再用水稀釋至含雜質A和氟馬西尼0.05、0.2、0.8、1.0、1.2和1.5 μg·mL－1的溶液，作為線性溶液。雜質A濃度（X）與峰面積（Y）的線性方程為Y＝7.758×104X－72，r＝1.000；氟馬西尼濃度（X）與峰面積（Y）的線性方程為Y＝7.074×104X－51，r＝1.000。根據標準曲線斜率比法測定雜質A的校正因子，所得校正因子在0.9～1.1，因此雜質A可按照不加校正因子的自身對照法計算[6]。

2.2.5 加樣回收試驗 取雜質A對照品適量，精密稱定，加甲醇適量使溶解，按照50%、100%和150%的雜質限度濃度加入氟馬西尼注射液（pH 3.8）中；另取氟馬西尼對照品適量，精密稱定，按照80%、100%和120%的理論濃度加入空白輔料溶液中，按外標法以峰面積計算雜質A和氟馬西尼的回收率。結果低、中、高濃度水平雜質A的回收率在97.2%～101.2%，氟馬西尼的回收率在100.3%～101.2%，RSD值均小于2.0%，說明本方法能準確檢測氟馬西尼注射液中雜質A和主藥含量。

2.2.6 重復性試驗 取氟馬西尼注射液（pH 3.8）6支，精密量取樣品溶液適量，加水定量稀釋制成每l mL中約含氟馬西尼1 μg的溶液，作為對照溶液，按不加校正因子的自身對照法計算重復性樣品溶液中有關物質，按外標法計算主藥含量。6份重復性樣品溶液中雜質A平均含量為0.05%，RSD為0.83%；氟馬西尼平均含量為100.9%，RSD為0.36%，說明本方法具有良好的重復性。

2.2.7 精密度試驗 取氟馬西尼注射液作為樣品溶液，連續進樣6次，氟馬西尼主峰面積的RSD為0.26%，雜質A峰面積的RSD為0.92%，說明本方法具有良好的精密度。

2.3 pH值對氟馬西尼注射液質量的影響

2.3.1 初始質量屬性對比 取不同pH值的自制氟馬西尼注射液與參比制劑，解析性狀、溶液澄清度與顏色、可見異物、不溶性微粒、有關物質和含量等關鍵質量屬性，結果見表1，所有樣品的性狀、溶液澄清度與顏色、可見異物、不溶性微粒和含量結果基本一致，符合國內外藥典標準以及通則要求；有關物質除雜質A外，均未檢出其他雜質。當pH值在3.4～4.6，自制氟馬西尼注射液中雜質A含量相對較低，說明當pH值控制在上述范圍時，氟馬西尼注射液在生產過程中穩定性較好，不易降解。參比制劑中雜質A含量明顯高于自制氟馬西尼注射液，這可能與參比制劑所用原料藥中雜質A含量較高以及參比制劑在貯藏期間降解有關。

表1 不同pH的氟馬西尼注射液和參比制劑檢測結果Tab 1 Determination of flumazenil injections at different pH and reference preparations

2.3.2 pH值對氟馬西尼注射液穩定性的影響 取不同pH值的氟馬西尼注射液，與參比制劑同時置于長期（30℃，65% RH）和加速（40℃，75%RH）穩定性試驗箱中，于1、3和6個月后分別取樣，評估不同pH值的氟馬西尼注射液與參比制劑的穩定性差異。所有樣品的性狀、溶液澄清度與顏色、可見異物、不溶性微粒在加速和長期穩定性試驗條件下基本不變；有關物質除雜質A外，未檢出其他雜質，雜質A檢測結果見表2，氟馬西尼含量測定結果見表3。不同pH的氟馬西尼注射液中雜質A呈現不同幅度增長，當pH值在3.8～4.6內，自制氟馬西尼注射液中雜質A在長期和加速穩定性試驗條件下的增長速率與參比制劑相當。含量在長期試驗條件下變化較小，受檢測誤差的影響，變化趨勢不明顯，在加速試驗條件下總體呈現逐漸降低的趨勢，但未發生顯著變化。當pH為3.0時，加速3、6個月的氟馬西尼注射液中雜質A含量已超出國內外藥典限度，樣品的性狀、溶液澄清度與顏色、可見異物、不溶性微粒檢測結果不變，說明氟馬西尼降解不會導致本品的性狀、溶液澄清度與顏色、可見異物、不溶性微粒在貯藏期間改變。

表2 雜質A的含量檢測結果(%)Tab 2 Content of impurity A (%)

表3 氟馬西尼注射液中氟馬西尼的含量(%)Tab 3 Content of flumazenil in flumazenil injection (%)

3 討論

3.1 有關物質檢測方法

本文對《中國藥典》2020年版二部氟馬西尼注射液有關物質檢測方法進行了驗證，結果表明該方法具有較好的專屬性、靈敏度、準確度、線性、重復性和精密度，能有效檢測降解雜質A和其他雜質。氟馬西尼注射液無需稀釋直接注入色譜系統，輔料濃度較高，使用該方法檢測有關物質時，應注意識別空白輔料峰。

3.2 氟馬西尼注射液的制備方法

氟馬西尼在冰醋酸中易溶，在水中幾乎不溶，室溫下氟馬西尼溶解速率非常緩慢，升高溫度氟馬西尼溶解速率增加，但雜質A降解加劇。如何增加氟馬西尼的溶解速率，提升配液效率，減少雜質降解是氟馬西尼注射液配制時需要關注的重點。有專利報道了氟馬西尼注射液的制備方法[7]，專利處方與參比制劑基本一致，配液溫度為室溫。重現該專利方法配制氟馬西尼注射液時，盡管有關物質未增長，但原料藥完全溶解所需時間長達2 h，不利于工業化生產。本文介紹的氟馬西尼注射液配制方法為充分評估氟馬西尼溶解速率以及雜質增長后制訂的，當配液溫度為60～70℃，氟馬西尼完全溶解所需時間縮短至30 min以內，雜質A增長可忽略不計，更適用于工業化生產。

3.3 pH值控制范圍

在氟馬西尼注射液的法定藥品標準中，《中國藥典》規定的pH值為3.5～4.2，《美國藥典》規定的pH值是3.4～4.6。根據pH值對氟馬西尼注射液穩定性影響的研究結果，當pH值控制在3.8～4.6時，氟馬西尼注射液在生產和貯藏過程中穩定性好，與參比制劑的穩定性一致，說明《美國藥典》制定的pH值范圍上限更加合理。當pH等于3.4，雜質A增長速度顯著加快，不利于本品在貨架期內貯藏。為嚴格控制產品質量，提高產品的穩定性，生產過程中應將氟馬西尼注射液的pH值控制在3.8～4.6。