基于數據挖掘和網絡藥理學研究中藥免疫增強劑的作用機制及用藥規律

信立媛,鄭亮,2

(1.南京中醫藥大學針灸推拿學院·養生康復學院,江蘇 南京 210023;2.南京中醫藥大學第二附屬醫院,江蘇 南京 210017)

機體免疫力指機體抵抗外來侵襲、維護體內環境穩定性的能力,是機體識別和排除“異己”的生理反應,而由免疫器官、免疫細胞和免疫活性成分構成的免疫系統是機體免疫力的基礎[1]。隨著經濟水平的提高,因營養不良而導致疾病的情況已不再常見,可生活與工作的壓力、不合理的作息與飲食,嚴重影響著人們的健康。據世界衛生組織統計,全球約有35%～50%的人處于以疲勞、活力減退、免疫力降低為主要臨床表現的“亞健康”狀態[2]。但目前為止,尚未有增強免疫力、安全且有效的藥物,如何提高機體免疫力、增強抗病能力,越來越受到大眾的關注,增強免疫力也成為社會熱門話題。

中藥專利復方作為現代新藥研發行業核心技術的載體,多為臨床實踐經驗和科學研究的結晶,具有療效確切、可重復性高的特點,是中醫藥科研成果最直接的轉化形式,為中醫藥市場的重要組成部分。因此,挖掘中藥復方專利信息,對把握中醫藥前沿、面向臨床診療需求和研發新藥具有重要意義[3]。

近年來,中醫藥界對增強免疫力的研究不斷深入,增強免疫力的相關研究很多,為保證研究的嚴謹性及研究成果的實用性,本研究于專利數據庫獲取原始信息,在對增強免疫力相關專利復方數據分析的基礎上,探討藥物組成規律與內在聯系,通過網絡藥理學方法篩選出核心中藥的有效活性成分及其增強免疫力的核心靶點,并通過分子對接的方法驗證核心靶點與有效活性成分的對接情況,探討核心藥物發揮增強免疫力的作用機制,以期對相關中藥新藥的進一步研發提供借鑒。

1 資料與方法

1.1 資料來源與檢索

以“(增強免疫力or提高免疫力or免疫力低下)and中藥”為檢索式,在國家知識產權局中國專利公布公告平臺(http://epub.cnipa.gov.cn/)檢索自建庫以來(1985年9月10日)至2023年5月1日的“發明授權”與“發明公布”。

納入標準:①研究方案完整,且用于增強人體免疫力的專利;②中藥或者中藥提取物為主要成分的專利;③專利藥物組成1味以上。排除標準:①類型為實用新型、外觀設計的專利;②聯合西藥一同使用的專利;③用于增強動物(如豬、牛、羊、雞、魚等)免疫力的專利;④外用中藥專利(如熏香、外用膏劑、藥浴等);⑤同一處方以不同研究角度發表的專利只取1篇。

1.2 數據庫的建立及數據規范

將專利名稱、申請號、申請時間、復方中藥組成導入Microsoft Excel 2021表格中,建立數據庫。依據《中華人民共和國藥典》(2020版)和《中華本草》(第2版)對專利復方的中藥名稱進行規范。如名稱規范,如“金鈴子”規范為“川楝子”;炮制方式不同的中藥規范,但對炮制后藥效差別較大者分別錄入,如“生地黃”“熟地黃”;少數不能明確進行規范的藥物,由于其出現頻次較少按原名錄入,如“南星”既不規范為“天南星”也不規范為“膽南星”,按“南星”錄入;于《中華人民共和國藥典》和《中華本草》中未查詢到的藥物,按照原始數據錄入。中藥性味歸經以《中華人民共和國藥典》為參考。

1.3 數據挖掘方法

使用Microsoft Excel 2021軟件對納入的中藥復方專利的申請數量進行統計,并繪制出各年專利數量變化趨勢曲線圖;再對藥物進行頻次分析,將高頻藥物(頻次≥20)的性味歸經分別進行頻次分析。使用IBM SPSS Modeler 18.0軟件獲取處方的關聯規則配伍結果,并對頻次≥5藥物進行復雜網絡分析:分別設置鏈接數為10、20、30,提取核心藥物組合。綜合考量頻次、關聯規則、復雜網絡分析結果,篩選出核心藥物。

1.4 網絡藥理學

1.4.1 核心藥物成分及靶點、免疫力靶點的篩選 以藥代動力學參數中的口服利用度(Oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性(Drug-likeness,DL)≥0.18為篩選標準,于TCMSP[4]平臺(http://tcmspw.com/tcmsp.p-hp)獲取核心藥物的活性成分及其相關靶點,通過UniProt[5](https://www.unipro-t.org/)數據庫對靶點信息進行規范化。以“Immunity”為檢索詞,于OMIM[6](https://omim. org/)、DrugBank[7](https://go. drugbank. com/)、GeneCards[8](https://www. genecards. org/)和UniProt四個數據庫進行檢索,其中GeneCards數據庫選擇score≥10的靶基因,UniProt數據庫選擇已驗證的且物種為人源的靶基因,獲取免疫力相關靶點,利用UniProt數據庫將所得靶點的信息進行規范化。

1.4.2 交集靶點篩選及蛋白互作(PPI)網絡構建 經比對,篩選出交集基因,運用Cytoscape3.7.2軟件,構建免疫力相關的藥物-成分-靶點網絡。將交集基因導入STRING[9]數據庫(https://string-db.org),設置最小互作分數值(Minimun required interaction score)為0.9,并刪除游離基因,獲取PPI關系的TSV格式文件,導入Cytospace3.7.2軟件進行可視化和網絡拓撲參數分析。以大于節點度值中位數的2倍、大于緊密度中位數、大于介度中位數為篩選條件,篩選出關鍵靶點。

1.4.3 GO功能分析和KEGG通路分析 將交集靶點導入Metaspace[10]數據庫(http://metascape.or-g/gp/index. html),分別進行基因本體(Gene ontology,GO)功能生物過程(Biological processes,BP)、細胞組分(Cellular components,CC)、分子功能(Molecular functions,MF)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析,并使用微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)進行可視化。

1.5 分子對接

將關鍵靶點及其先對應的化合物進行分子對接驗證。從RCSB PDB數據庫[11](https://www1.rcsb.org/)獲取靶蛋白質的3D結構(PDB ID:1NFI、7JRA、1TSR、1ALU),使用PyMOL2.3.0軟件將蛋白質去水、去殘基配體以備對接所用;小分子化合物的3D結構文件從Pubchem數據庫[12](https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)下載并使用Chem3D軟件對小分子結構進行分子力場優化,最終獲得能量最低狀態的最優分子結構。使用AutoDock Tools1.5.6分別對蛋白質和小分子進行加氫處理,并判定小分子的可扭轉鍵,均保存為pdbqt文件。運行AutoDock Vina1.2.0進行分子對接,使用Grid模塊設置分子對接范圍參數,設定對接方式為半柔性對接,對接算法為拉馬克遺傳算法,得到對接結合自由能。結果中結合能為負說明兩者能夠自發結合,結合能越小表明結合活性越強,相互作用越是穩定[13]。將結合能最小的蛋白質與化合物運用PyMOL2.3.0軟件進行可視化。

2 結果

2.1 數據挖掘結果

2.1.1 專利公布情況 經人工檢索,得到專利文獻617項,經排除、篩選后納入有效專利條目314項,公布時間為2002年至2022年,圖1為相關專利年度公布數量變化趨勢圖。

圖1 相關專利年度公布情況Fig.1 Annual announcement of relevant patents

2.1.2 單藥使用頻次結果 頻數統計結果顯示,547味中藥共出現2 908次,高頻藥物有黃芪(116次)、人參(93次)、枸杞子(92次)等。高頻藥物(頻次≥20次)見表1。

表1 相關專利中的高頻藥物(≥20)Table 1 High-frequency drugs (≥20 times) in relevant patents

2.1.3 高頻藥物性味歸經 32味高頻中藥的藥性多為溫(10次,31.3%)與平(10次,31.3%);藥性以甘(30次,60%)、苦(5次,10%)為主;歸腎(17次,20%)與肺(16次,18.8%)兩經的中藥最多,詳見圖2。

圖2 高頻中藥性味歸經圖Fig.2 High-frequency distribution graph of properties and flavors of traditional Chinese medicine

2.1.4 關聯規則分析結果 在關聯規則中,支持度表示前后兩項同時出現的概率,置信度表示前項出現時后項出現的頻率[14]。當歸-黃芪、枸杞子-黃芪為最高支持度的藥對;黃芪-當歸為最高置信度的藥對。結果按照支持度排列,詳見表2。

表2 中藥關聯規則分析Table 2 Analysis of traditional Chinese medicine association rules

2.1.5 復雜網絡分析結果 在復雜網絡中,節點為中藥,兩個節點之間的連線越粗、顏色越深,表明兩種中藥在同一處方中同時出現的頻次越高;節點連線越多,表明中藥地位越核心。由圖3可見,鏈接數越大,核心藥物的配伍越凸顯。當鏈接數>30時可見增強免疫力最核心的藥物為黃芪、人參、當歸、枸杞子、白術、茯苓、山藥與大棗。

圖3 常用藥物復雜網絡分析Fig.3 Complex network analysis of commonly used drugs

綜合考量藥物頻次、關聯規則、復雜網絡分析結果,篩選出核心藥物為黃芪、人參、枸杞子、茯苓、當歸。

2.2 網絡藥理學結果

2.2.1 核心藥物成分及靶點、免疫力靶點的篩選結果 依據TCMSP平臺共獲取5味中藥的全部活性成分104個,將所得活性成分去重,最終得到藥物活性成分共97個,靶點經去重后獲得214個。將4個疾病數據庫檢索所得的靶點合并去重后,最終獲得靶點1 784個,通過韋恩圖(圖4)可見交集靶點共55個。

圖4 核心藥物成分與免疫力靶點Venn圖Fig.4 Venn diagram of core drug components and immune targets

2.2.2 免疫力相關核心藥物-成分-靶點網絡圖 將交集靶點相關數據上傳至Cytoscape3.7.2構建免疫力相關的核心藥物-成分-靶點網絡(圖5)。圖5包含75個節點(4味中藥,18個化合物,55個靶基因),121條邊線,其中藍色菱形代表靶點基因,黃色圓圈代表中藥,六邊形代表藥物的活性成分,同一種藥物的活性成分用同一顏色表示,共有活性成分以綠色正方形表示。圖中各節點的大小、各節點字體大小與度值正相關。度值是指某一節點與周圍節點相關連接的數目,度值越大則說明該節點與周圍節點相互作用關系越強,在整個網絡中的作用也越大[15]。根據度值排名將所涉及到的化合物進行排序,具體見表3。藥物的活性成分可以作用于多個不同靶點,且不同的活性成分也可作用于同一靶點,多種成分之間相互協調,符合中藥作用的“多成分,多靶點”的特性[16]。

表3 藥物活性成分的網絡節點信息Table 3 Network node information of active pharmaceutical components

圖5 免疫力相關核心中藥成分靶點網絡關系圖Fig.5 Network diagram of immune-related core traditional Chinese medicine component targets

2.2.3 PPI網絡分析 圖6所示,PPI網絡共包含節點50個,邊線206條。其中,節點表示預測的作用靶點,圓圈越大、顏色越紅,說明與該靶點相互作用的基因越多;邊線表示蛋白之間的作用關系,邊線越粗,說明兩靶點基因作用關系越緊密[17]。通過拓撲分析得到,度值中位數為8、介度中位數為0.007 1、緊密度中位數為0.485 1。經篩選后得出RELA、TNF、TP5、IL-6為核心藥物增強免疫力的關鍵靶點。

圖6 PPI網絡圖Fig.6 PPI network diagram

2.2.4 GO功能及KEGG通路富集結果 富集結果顯示,GO功能富集條目1 224個(其中BP 1 114個,CC 36個,MF 74個),選取GO每個種類P值前10進行可視化分析,見圖7?？梢?GO功能富集中,在BP上主要涉及了對細菌起源分子的反應、對脂多糖的反應、細胞對生物刺激的反應等;CC主要分布在脂筏、膜微區、轉錄調節復合物等處;MF則體現在細胞因子受體結合、細胞因子活性、信號受體激活劑活性等方面。

圖7 GO功能富集分析柱狀圖Fig.7 GO functional enrichment analysis histogram

富集分析結果涉及KEGG通路160條(P<0.01),按照P值將前20條通路繪制成氣泡圖,見圖8,可見核心中藥發揮增強免疫力的作用可能與脂質和動脈粥樣硬化、南美洲錐蟲病、TNF信號通路、癌癥通路等多條信號通路的激活與調控相關。

圖8 KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.8 KEGG pathway enrichment analysis bubble chart

2.2.5 分子對接結果 將關鍵靶點RELA、TNF、TP53、IL-6與其相對應的活性成分進行分子對接,結果見表4。一般認為,結合能<0 kcal·mol-1(1 kcal≈4.185 851 820 85 kJ)代表受體與配體可自發結合,結合能<-5 kcal·mol-1說明結合情況優異,<-7 kcal·mol-1代表結合作用強烈[18]。表4所示4個關鍵靶點與其對應的活性成分結合能均<-5 kcal·mol-1,提示槲皮素、山柰酚、異鼠李素、人參皂苷Rh2可能為核心藥物增強免疫力的核心成分,而RELA、TNF、TP53、IL-6可能為核心靶點。將每組結合作用最強的受體與配體,進行可視化,見圖9,在2D圖中,綠色虛線表示作用力結合方式為氫鍵作用,淡粉色為π-烷基作用,粉色為π-π堆積相互作用,紫色為π-σ作用,黃色為π-硫鍵作用。

表4 活性成分與靶點受體蛋白的結合結果Table 4 Binding results of active components and target receptor proteins

注:A.RELA-槲皮素;B.TNF-山柰酚;C.TP53-槲皮素;D.IL-6-槲皮素

圖9顯示,槲皮素與RELA的HIS-245、VAL-219形成氫鍵,TYR-251形成π-π堆積相互作用,LYS-221形成π-硫鍵作用。山柰酚與TNF的TYR-227、LEU-233形成氫鍵,ILE-231形成π-烷基作用,TYR-135形成π-π堆積相互作用,LEU-133形成π-σ作用。槲皮素與TP53的ARG-196、ASP-184、ASN-200形成氫鍵。槲皮素與IL-6的ARG-179、ARG-30、GLN-175、ASP-34形成氫鍵,LEU-178、LEU-33形成π-σ作用。

3 討論

嚴格來講,免疫力下降并不算是一種疾病,而是指人體所處的一種狀態,但免疫力的下降會導致諸多疾病的發生,最常見的有感冒、蕁麻疹、斑禿、腫瘤等。祖國醫學認為,人體免疫力的下降與正氣不足相關,機體正氣充足時,衛外功能正常,那么邪氣無法侵害機體。因此扶正祛邪是增強機體免疫力的基本原則。

相關專利年度申請數量總體呈現上升趨勢,2014年、2015年專利申請數量達到峰值,每年34項,此后稍有下降,但對于之前仍處于相對較高的水平,表明增強人體免疫力的中藥專利復方的研制逐漸受到廣大科研工作人員的關注,近2年趨勢下降的主要原因可能是專利審核流程逐漸嚴格以及部分專利審核工作尚未完成等[19]。

以頻次分析來看,當前用于增強免疫力的中藥專利處方最常用的藥物是黃芪、人參、枸杞子、茯苓、當歸等。黃芪為補氣之圣藥,《珍珠囊》記載黃芪“益元氣,補諸虛,壯脾腎”[20];人參為大補元氣之藥,早在《神農本草經》就有記載:“人參……除邪氣……久服輕身延年”[21],正氣得充,鼓邪外出?！妒朝煴静荨酚涊d枸杞子“堅筋耐老,除風,補益筋骨,能益人,去除虛勞”[22]。高頻藥物多為甘溫或甘平之品,甘溫補陽,甘平補氣?，F代藥理學證明,溫性藥能夠提高免疫力,有效促進呼吸功能,提高內分泌系統興奮性及基礎代謝率,為全身提供能量及營養物質[23];歸腎、肺、脾經的中藥占比最多,中醫認為,正氣虧虛多與肺、脾、腎相關。依據中醫藥理論,腎精虧損、脾肺虛衰從而引起正氣不足、衛外不固[24]。關聯規則中關聯強度最高的藥對是“當歸-黃芪”“枸杞子-黃芪”?，F代藥理學研究,黃芪-當歸藥對可通過調節T細胞、細胞因子的分化和分泌等來調節體液與細胞免疫,維持機體正常生命活動[25]。枸杞子擅于滋肝腎之陰血,黃芪長于益脾肺之陽氣,兩者一陰一陽, 一滋先天一補后天,合二為用,調和陰陽氣血之平衡,增益機體抗病能力。

根據藥物-成分-靶點圖顯示結果,槲皮素的度值最高,現代研究表明,槲皮素是一類具有多種生物功能的黃酮類化合物,它可以選擇性抑制環氧化物酶-2,具備良好的抗炎活性。有研究發現,槲皮素對小鼠淋巴細胞有促進增殖的作用,并且能夠抑制B淋巴細胞和T淋巴細胞的增殖與細胞因子分泌,具有免疫雙向調節作用[26]。在對系統性紅斑狼瘡(SLE)模型小鼠的研究中,發現槲皮素可以增加SLE小鼠脾臟樹突狀細胞和Th1細胞的比例,同時減少Th2細胞的比例,從而增強SLE小鼠免疫功能[27]。根據Singh等[28]的研究,槲皮素對于提高抗原特異性體液免疫反應具有重要作用。槲皮素參與B淋巴細胞的活化進程,激活的B細胞能夠釋放大量的免疫細胞因子,從而參與免疫調節功能。此外,槲皮素還能夠促進B細胞增殖和分化,產生如IgG和IgM等抗體,以參與免疫應答的過程[29]。山柰酚的作用機制通過調控信號傳導與轉錄激活因子3和激活NF-κB信號通路,來減弱IL-6對環氧化酶-2表達的影響,從而在調節急性和慢性炎癥方面發揮重要作用[30]。異鼠李素能夠通過抑制細胞炎癥因子IL-6、TNF-α、MCP-1的釋放來發揮抗炎作用,并且具有調節免疫的功能[31]。也有研究顯示,人參皂苷Rh2可以對多種免疫細胞產生作用,它可以增加免疫細胞的數量,并促進免疫細胞的分化與成熟,從而發揮其免疫增強效應[32]。

通過PPI分析結果顯示, RELA、TNF、TP53和IL-6可能為核心藥物增強免疫力的關鍵作用靶基因。RELA是核轉錄因子κB(NF-κB)家族的重要一員,在翻譯后修飾的過程中,精準調控NF-κB轉錄活性,從而參與調節炎癥、腫瘤、代謝和免疫應答等多個生命過程[33]。TNF是免疫反應的關鍵調節因子,調控細胞代謝、細胞死亡及各種炎癥反應[34],其中, TNF-α是主要活性因子,它促進T細胞的生長與成熟,刺激T細胞持續增殖,參與固有免疫。TNF-α具有多種免疫活性,能夠激活巨噬細胞,活化多種免疫細胞,增強炎性細胞的吞噬能力,釋放炎性介質,直接殺死病原菌[35]。TP53是一種抑癌基因,可以調控細胞周期[36],并在免疫調節過程中修復由內源或外源因素導致的DNA損傷[37]。IL-6是炎癥細胞因子,具有免疫調節作用,通過促進T淋巴細胞和B淋巴細胞的分化來誘導免疫反應的發生[38]。因此,核心配伍藥物主要通過RELA、TNF、TP53、IL-6關鍵靶基因,調控機體免疫細胞和轉錄等過程,來提高機體抗炎、抗菌、抗癌的能力,以此增強機體免疫力。分子對接結果顯示,受體與配體的結合能均小于-5 kcal·mol-1,說明小分子化合物與蛋白質之間具有優良的親和力,進一步佐證了核心藥物增強免疫力有多重作用途徑。

KEGG通路富集分析結果顯示,核心藥物增強機體免疫力主要涉及脂質與動脈粥樣硬化、南美洲錐蟲病、TNF信號通路、癌癥通路等多條信號通路。而靶點-通路圖說明核心藥物通過調控多條信號通路發揮增強免疫力的作用;富集基因最多的通路為癌癥通路、脂質和動脈粥樣硬化、乙型肝炎三條通路。近幾十年來,癌癥通路一直是研究的熱點。癌癥通路的靶點基因多與細胞凋亡相關,目前有研究發現,黃芪的多種活性成分對于多種腫瘤(如胃癌、肝癌等)都有療效[39-41]。由此引發思考,口服核心藥物是否對增強腫瘤患者免疫力具有顯著效果,望今后有臨床試驗可以加以驗證。脂質和動脈粥樣硬化通路也被認為是免疫系統重要的通路[42-43]。雖然乙型肝炎通路與本研究相關性不強,但仍有多種靶點基因富集在此通路,說明,核心藥物對乙型肝炎有一定的應用價值。

綜上,國家專利數據庫用以增強免疫力的中藥以補虛藥為主,根據其用藥規律得出核心藥物為黃芪、人參、枸杞子、茯苓、當歸。網絡藥理學研究表明核心藥物中的槲皮素、山柰酚等多種化合物作用于RELA、TNF、TP53、IL-6等靶點,通過脂質和動脈粥樣硬化、南美洲錐蟲病、TNF信號通路、癌癥通路等多條通路發揮增強免疫力的作用。本研究通過網絡藥理學與分子對接技術初步揭示了核心藥物多成分、多靶點、多途徑增強免疫力的調控方式,為增強免疫力物質基礎和作用機制研究提供一定的理論參考,但僅依靠網絡藥理學與分子對接的研究仍存在一定的局限性,后續相關中藥新藥的研發仍需進一步實驗室和臨床驗證。