杞參益智方改善D-半乳糖注射亞急性衰老模型小鼠學習與記憶能力的效應評價研究

陳楊,朱梓強,陸韞青,鄭嘉妮,曹程,仝佳祥,李璇,郭盛,康宏杰,段金廒,朱悅

(1.南京中醫藥大學藥學院,江蘇省方劑研究重點實驗室/江蘇省方劑高技術研究重點實驗室/中藥資源產業化與方劑創新藥物國家地方聯合工程研究中心/江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心,江蘇 南京 210023;2.寧夏枸杞創新中心,寧夏 銀川 750000)

全球已進入老齡化社會,老年人口的快速增加導致相關的醫療保健等養老問題日趨嚴峻[1]。老年期癡呆癥是一種因腦老化導致的中樞神經系統退行性疾病,表現為記憶、智力、語言及日常生活能力等大腦高級功能的全面障礙,尤其以阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)發病率最高。預計到2050年,中國AD患者人數將超過3 000萬,給社會和家庭帶來巨大的負擔與壓力[2]。研究認為,AD患者腦內皮層與海馬的β淀粉樣蛋白(Amyloid-β peptide,Aβ)沉積導致腦內產生大量氧自由基,加劇氧化應激損傷,氧自由基同時激活小膠質細胞釋放大量促炎因子產生炎性應激損傷,氧化應激與炎性應激綜合作用導致海馬神經元凋亡,是AD重要的病理機制[3-4]。目前AD臨床治療的一線藥物主要是膽堿酯酶抑制劑如多奈哌齊與N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-Methyl-D-aspartic acid receptor,NMDA)受體阻斷劑美金剛等。然而心功能不全患者慎用或禁用膽堿酯酶抑制劑[5],同時AD重在預防以及干預窗口應提早到輕度認知功能障礙(Mild cognitive impairment,MCI)階段也已經取得共識[6]。

中醫根據AD臨床表現,將其歸屬于“健忘”與“癡呆”范疇,并認為患者年齡增長,腎精肝血虧虛,導致心脾失養,運化無力,漸致髓海失養,記憶衰退而成癡呆[7]。AD病位雖在腦,卻與心肝脾腎功能失調密切相關。杞參益智方系在《圣濟總錄》所載經典方劑二精丸(枸杞子與黃精)的基礎上,結合防治AD中藥材的用藥頻次統計分析與現代藥理學研究成果,加味人參、益智仁組成,同時有助于改善二精丸滋膩易影響脾胃運化功能的不足。全方滋補肝腎、益精填髓、養心安神。處方組成均為藥食兩用中藥,安全性高,更適合AD的預防與長期用藥的要求。本研究通過皮下注射D-半乳糖構建亞急性衰老小鼠模型,評價杞參益智方改善模型動物學習與記憶效用,為開發AD防治產品提供理論科學支持。

1 材料

1.1 實驗動物

健康SPF級C57BL/6小鼠,雄性,體質量18～22 g,購自斯貝福(北京)生物技術有限公司,動物許可證號:SCXK(京)2019-0010。動物在南京中醫藥大學實驗動物中心SPF級環境中常規飼養,本實驗獲得南京中醫藥大學動物實驗倫理委員會的批準(批準號:202111A045)。

1.2 藥材

枸杞子(LyciumbarbarumL.,批號:2106157)、黃精(PolygonatumsibiricumRed.,批號:237200516)、人參(PanaxginsengC. A. Mey.,批號:109200125)、益智仁(AlpiniaoxyphyllaMiq.,批號:45200618)采購于亳州市紫銳藥業有限公司,經段金廒教授鑒定為正品藥材。

1.3 實驗試劑

D-半乳糖(N13GS167640)購自上海源葉生物科技有限公司;多奈哌齊(GD18339)購自薩恩化學技術有限公司;PAGE凝膠快速制備試劑盒(PG112)、三色預染蛋白Marker(180-6003)購自上海雅酶生物醫藥科技有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0009)、RIPA裂解液(P0013B)購自上海碧云天生物技術有限公司;小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒(AF2132-A)、小鼠白細胞介素(IL)-6 ELISA試劑盒(AF2163-A)、小鼠IL-1β ELISA試劑盒(AF2040-A)購自湖南艾方生物科技有限公司;小鼠超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(A001-3-2)、還原性谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒(A006-2-1)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒(A003-4-1)均購自南京建成生物工程研究所。ECL化學發光液(180-5001)購自上海天能公司;抗體β-actin(66009-1-Ig)、Nrf-2(16396-1-AP)、HO-1(10701-1-LG)、Cleaved Caspase-3(25128-1-AP)購自Proteintech公司;抗體Caspase-3 (9662)、NF-κB p65(8242)與p-NF-κB p65(3033)購自CST公司;HRP-Linked Anti-mouse IgG(BA1050)、HRP-Linked Anti-rabbit IgG(BA1054)均購自博士德公司。

1.4 實驗儀器

小鼠腦立體定位儀(68000)購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司;動物行為學影像采集系統(JLBehv)購自上海吉量生物科技有限公司;倒置顯微鏡(AXIO Vert A1)購自瑞士Zeiss公司;旋轉蒸發儀(Rotavapor R-210)購自瑞士Buchi公司;貝克曼離心機(Microfuge 22R)購自南京百瑞達生物科技有限公司;組織研磨機(Tissuelyer-48)購自上海凈業信發展有限公司;多功能酶標儀(ENSPIRE)購自Perkin-Elmer公司;凝膠成像系統(ChemiDoc XRS+Imaging System)購自美國Bio-Rad公司;干式恒溫金屬浴(SBH130D)購自英國STUART公司。

2 方法

2.1 杞參益智方水提取物的制備

按照處方比例稱取枸杞子50 g,黃精50 g,人參30 g,益智仁30 g,加入10倍量水回流提取1.5 h,再加8倍量水回流提取2次各1 h,合并提取液,濃縮至生藥含量為1 g·mL-1。

2.2 D-半乳糖注射動物模型的建立及給藥

將健康雄性小鼠適應性飼養1周,隨機分為5組,分別為空白組、模型組、杞參益智方低劑量組、杞參益智方高劑量組和多奈哌齊(陽性藥)組,每組12只。模型組及各給藥組小鼠每天皮下注射D-半乳糖600 mg·kg-1,空白組小鼠注射等量的生理鹽水,連續造模6周[8]。杞參益智方水提取液用生理鹽水分別配制成濃度為0.5、1 g·mL-1的溶液,多奈哌齊用生理鹽水配制成濃度為0.2 mg·mL-1的溶液。造模第12天起,除空白組和模型組外,其余各組每日同時以相應的給藥量進行灌胃給藥,給藥體積均為0.01 mL·g-1。給藥劑量設置為:杞參益智方低劑量組1.33 g·kg-1·d-1;杞參益智方高劑量組2.67 g·kg-1·d-1;多奈哌齊組2 mg·kg-1·d-1。連續給藥30 d?？瞻捉M與模型組給予等量生理鹽水灌胃。

2.3 行為學檢測

給藥30 d后進行Morris水迷宮實驗和Y迷宮實驗,評價模型小鼠學習與記憶能力,具體方法參照課題組已發表的文章[9]。

2.4 TUNEL染色法檢測海馬區細胞凋亡

行為學測試結束后,小鼠頸椎脫臼處死并解剖取出全腦組織,生理鹽水潤洗,每組取6只動物全腦組織,放入4%多聚甲醛中固定24 h,依次用乙醇進行梯度脫水,放入二甲苯至透明后包埋,并用切片機切片,切片厚度約5 μm,放于載玻片上展平,并于60 ℃烘箱內烘烤,制得各組動物腦組織病理切片。將所得的腦組織石蠟切片脫蠟。根據TUNEL試劑盒檢測步驟進行檢測,并用倒置顯微鏡進行拍照,檢測各組動物海馬區的細胞凋亡水平。

2.5 氧化應激因子表達檢測

行為學檢測后,解剖獲得海馬組織,稱取相應質量的組織,加入10倍量PBS,低溫研磨,離心取上清待測,按照試劑盒說明書檢測SOD活力和MDA、GSH含量。

2.6 致炎因子水平檢測

行為學檢測后,解剖獲得海馬組織,稱取相應質量的組織,加入10倍量PBS,低溫研磨,離心取上清待測,按照ELISA試劑盒檢測說明書檢測IL-6、IL-1β、TNF-α的含量。

2.7 Western blot檢測

稱取海馬組織,加入10倍量含有蛋白酶抑制劑(Cocktail)的RIPA裂解液,研磨后冰浴30 min,離心取上清,按照BCA試劑盒的步驟測定蛋白濃度,98 ℃加熱15 min,使蛋白變性。按照蛋白凝膠試劑盒實驗步驟制備10%和12.5%的PAGE凝膠,120 V電泳1.5 h,300 mA轉膜2 h,用5%脫脂奶粉放在搖床上封閉1 h,加入一抗(Nrf2 Rabbit mAb、HO-1 Rabbit mAb、Caspase-3 Rabbit mAb、Cleaved Caspase-3 Rabbit mAb抗體稀釋比例為1∶2 000;NF-κB p65 Rabbit mAb、p-NF-κB p65 Rabbit mAb抗體稀釋比例為1∶1 500;β-actin Rabbit mAb抗體稀釋比例為1∶10 000),4 ℃搖床過夜,二抗(HRP-Linked Anti-mouse IgG,HRP-Linked Anti-rabbit IgG,稀釋比例1∶10 000)孵育1 h,成像系統曝光并采集。

2.8 統計學方法

3 結果

3.1 杞參益智方對D-半乳糖注射亞急性衰老模型小鼠學習與記憶行為的影響

水迷宮實驗考察結果如圖1所示,與空白組小鼠相比,模型組小鼠潛伏期與上臺前路程顯著增加(P<0.01),穿越平臺次數顯著減少(P<0.05),表明D-半乳糖皮下注射導致了小鼠學習與記憶能力損傷。杞參益智方水提物高、低劑量組顯著減少模型小鼠潛伏期和上臺前路程(P<0.05,P<0.01),穿越平臺次數顯著增加(P<0.05,P<0.01)。其中高劑量組作用趨勢強于低劑量組。

注:與空白組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較,

Y迷宮實驗結果如圖2所示,與空白組小鼠相比,模型小鼠的新臂探索時間和次數顯著減少(P<0.05,P<0.01)。杞參益智方低劑量組和高劑量組均能顯著增加模型小鼠新臂探索時間和次數(P<0.05)。

注:與空白組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較,

上述研究表明,杞參益智方能夠顯著改善亞急性衰老模型小鼠受損的學習與記憶能力。

3.2 杞參益智方對D-半乳糖注射亞急性衰老模型小鼠海馬組織凋亡的影響

結果如圖3所示,與空白組小鼠相比,模型組小鼠海馬組織凋亡細胞數量顯著增多(P<0.01),杞參益智方低、高劑量組顯著減少了模型小鼠海馬組織凋亡細胞數量(P<0.01),作用趨勢相似。

注:與空白組比較,##P<0.01;與模型組比較,

3.3 杞參益智方對D-半乳糖注射亞急性衰老模型小鼠海馬組織氧化應激因子表達的影響

結果如圖4所示。模型組較空白組小鼠SOD活力和GSH含量顯著降低(P<0.05),MDA含量顯著升高(P<0.05),表明模型小鼠腦內氧化應激加劇。杞參益智方低、高劑量組均能夠顯著提高SOD活力和GSH含量(P<0.05),顯著降低MDA含量(P<0.05),表明杞參益智方能夠降低氧化產物的生成,提高抗氧化因子的表達,從而減緩氧化應激。其中高劑量組在提高GSH表達與降低MDA表達上的作用趨勢略強于低劑量組。

注:與空白組比較,#P<0.05;與模型組比較,

3.4 杞參益智方對D-半乳糖注射亞急性衰老模型小鼠海馬炎性因子水平的影響

結果如圖5所示,與空白組小鼠相比,模型組小鼠海馬中IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著上升(P<0.05,P<0.01),杞參益智方能夠降低上述致炎細胞因子表達的水平(P<0.05,P<0.01)。

注:與空白組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較,

3.5 杞參益智方對D-半乳糖注射亞急性衰老模型小鼠海馬組織凋亡通路蛋白表達的影響

用Western blot法檢測小鼠海馬組織中凋亡通路蛋白Cleaved Caspase-3與Caspase-3表達,結果如圖6所示。與空白組相比,模型組小鼠海馬Cleaved Caspase-3與Caspase-3表達均顯著升高(P<0.05),Cleaved Caspase-3/Caspase-3比值也顯著升高(P<0.05)。杞參益智方能夠顯著抑制上述2種蛋白的表達(P<0.05),下調Cleaved Caspase-3/Caspase-3比值(P<0.05),表明杞參益智方能夠抑制海馬細胞凋亡通路的激活。高劑量組的作用趨勢略強于低劑量組。

注:與空白組比較,#P<0.05;與模型組比較,

3.6 杞參益智方對D-半乳糖注射亞急性衰老模型小鼠海馬組織抗氧化通路蛋白表達的影響

采用Western blot法檢測受試動物海馬組織中抗氧化關鍵信號通路蛋白Nrf2與HO-1的表達,結果如圖7所示。模型組小鼠海馬組織蛋白Nrf2和HO-1的表達水平較空白組顯著下調(P<0.05)。與模型組相比,杞參益智方顯著增加模型動物海馬組織Nrf2和HO-1的表達(P<0.05,P<0.01),提示杞參益智方可通過調控Nrf2/HO-1信號通路發揮抗氧化作用。高劑量組的上調作用趨勢略強于低劑量組。

注:與空白組比較,#P<0.05;與模型組比較,

3.7 杞參益智方對D-半乳糖注射亞急性衰老模型小鼠海馬組織NF-κB蛋白表達的影響

采用Western blot法檢測小鼠海馬組織中炎性通路關鍵蛋白NF-κB與其磷酸化蛋白p-NF-κB表達,結果如圖8所示。與空白組相比,模型組小鼠海馬p-NF-κB表達與p-NF-κB/NF-κB比值顯著升高(P<0.05),杞參益智方能夠顯著下調p-NF-κB表達與p-NF-κB/NF-κB比值(P<0.05),提示杞參益智方能夠抑制海馬細胞炎性通路的激活。

注:與空白組比較,#P<0.05;與模型組比較,

4 討論

迄今為止,1956年Harman提出的線粒體自由基學說是衰老損傷發生機制中最具有影響力的學說。該學說認為隨著年齡增長,細胞代謝過程中產生的自由基不斷增加而清除能力逐漸降低[10]。ROS急劇增加,導致抗氧化劑GSH和抗氧化酶SOD顯著降低,氧化劑MDA急劇增加,破環細胞微環境平衡,損害氧化合成酶和脫氫酶,導致線粒體能量轉化停止,線粒體通透性增加,Ca2+體內平衡被破壞,濃度升高,引起線粒體功能障礙[11-12]。線粒體是氧化還原的重要場所,線粒體的缺陷會加劇神經變性。大腦相比于人體其他組織的耗氧量更高,因此氧化應激損傷在腦衰老中作用更加凸顯[13]。Nrf2是細胞抗氧化防御系統的關鍵蛋白,對神經元氧化損傷的保護起著至關重要的作用[14]。生理狀況下,Nrf2與抗氧化反應元件相互作用,增強抗氧化酶的表達,調節下游靶基因HO-1的表達,發揮抗氧化作用。而氧化應激下氧化還原平衡被破壞,Nrf2/HO-1信號通路被抑制,導致氧自由基過度增加,引起炎癥細胞浸潤并導致NF-κB信號通路激活,導致IL-1β、IL-6與TNF-α等炎性介質過度釋放。在氧化應激與炎性應激的綜合作用下, Caspase凋亡通路激活,最終導致細胞凋亡[15]。同時,Aβ沉積會激活海馬區小膠質細胞,釋放大量炎癥因子[16],進一步放大小膠質細胞炎癥級聯反應,與氧化應激損傷交織而最終導致細胞凋亡[17]。給動物長期連續注射D-半乳糖會使細胞內半乳糖濃度增高,破壞并消耗機體抗氧化防御系統,加劇自由基脂質過氧化反應,導致脂褐質增多與器官功能減退,出現與自然衰老動物相似的生理生化改變,從而被廣泛用于抗衰老藥物的研究[18]。本研究表明,杞參益智方能夠增加模型動物海馬中SOD活力和GSH含量(P<0.05),降低MDA的表達(P<0.05),同時提升Nrf2與HO-1的表達(P<0.05,P<0.01),表現出顯著的抗氧化作用。同時該方還能夠抑制炎性因子IL-1β、IL-6與TNF-α的表達水平(P<0.05,P<0.01),下調炎性通路關鍵蛋白p-NF-κB表達與p-NF-κB/NF-κB比值(P<0.05),并減少模型動物海馬區細胞凋亡(P<0.01),抑制凋亡通路關鍵蛋白Caspase-3與Cleaved Caspase-3表達(P<0.05),體現了中藥復方多層次、多靶點與多通路調控的綜合治療優勢。

杞參益智方是在中醫“助氣固精,保鎮丹田”的經典方劑二精丸基礎上加味而成。二精丸中黃精與枸杞子均為中醫益精填髓、滋補肝腎之要藥,與中醫理論中AD疾病腎精虧虛、髓海失養的基本病機高度吻合。但腎精需得元氣資助,方能濡養臟腑。人參大補元氣,不僅使氣血生化有源,還可推動氣血上榮于腦。黃精質滋黏膩,易助濕滯氣,年老之人本就脾腎功能漸衰,久服有礙脾之嫌,故輔以益智仁溫腎以助腎陽,暖脾以滋脾運,又取其芳香之氣,補而不滯。四藥相合,使腎精得充,氣血可化,神志可復。該方四味藥均為藥食同源的藥材,安全性好,有利于長期用藥。

杞參益智方中的4味藥及其活性成分均有改善癡呆模型動物學習與記憶能力的現代報道。枸杞多糖可以改善APP/PS1小鼠海馬區淀粉樣蛋白沉積,改善小鼠受損突觸的可塑性,并促進海馬神經新生[19]。黃精中薯蕷皂苷元能夠顯著改善癡呆大鼠的空間學習記憶能力,降低氧化應激與炎癥應激水平,保護神經元免受損傷并抑制乙酰膽堿酯酶活性[20]。人參所含的多種人參皂苷Rb1、Rg1、Re等也可通過改善模型小鼠體內氧化應激水平,降低ROS的表達,上調Nrf2/GPX-1/ERK/CREB信號通路,改善模型小鼠神經損傷[21-24]。益智仁不同極性提取物能夠調節癡呆動物膽堿能系統,改善其學習與記憶能力[25]。因此杞參益智方改善癡呆模型可能是方中各成分共同作用的結果。

本研究初步評價了杞參益智方改善衰老模型動物學習與記憶能力的效用,后續我們將深入研究方中發揮作用的主要活性成分,并對其作用機制進行進一步深入研究,以期為將該方防治老年期癡呆產品開發提供更多的現代科學依據。