補腎助孕方對黃體功能不全性不孕癥大鼠Treg、Th17及其相關因子的影響

阮芳,周惠芳

(1.南京中醫藥大學第一臨床醫學院,江蘇 南京 210023;2.南京中醫藥大學附屬醫院,江蘇 南京 210029)

黃體功能不全(Luteal phase defect,LPD)指排卵后黃體發育不全或過早退化,引起孕激素分泌不足、子宮內膜分泌反應不良,導致胚胎著床失敗和發育障礙,與不孕、早期流產、月經不調等密切相關。LPD占不孕癥病因的5%～10%[1],在輔助生殖技術(Assisted reproductive technology,ART)的過程中,LPD的發生率可達100%[2]。研究表明,子宮內膜容受性受損是LPD性不孕癥患者的關鍵特征[3]。免疫反應是子宮容受性的重要介質[4],具有調節上皮-胚胎附著、蛻膜轉化、滋養層侵襲、子宮血管適應、炎癥激活和消退以及免疫耐受作用。調節性T細胞(Treg)和輔助性T細胞17(Th17)是CD4+T細胞的2個顯著不同的亞群,在自身免疫、炎癥和對外來抗原的免疫排斥方面具有相反的功能[5-6]。Treg細胞對植入成功至關重要,發揮著建立妊娠所必需的強大抗炎、免疫抑制和血管調節功能[7-8]。FOXP3是叉頭樣轉錄因子家族的成員之一,是Treg細胞發育和發揮免疫抑制功能所需的特異轉錄因子,FOXP3持續表達是Treg譜系穩定的先決條件[9]。FOXP3下降與不孕癥相關[10],調節FOXP3可以減少Treg細胞向Th17細胞分化[11]。Th17細胞在TGF-β、IL-6、IL-23等多種細胞因子參與下發生活化,分泌白介素(IL)-17以及由RAR相關孤兒受體C(RORC)編碼的“主調節因子”RORγT,參與炎癥反應和自身免疫疾病的發生與發展。研究發現,IL-17的異常表達或Th17細胞正常百分比的改變可能是妊娠失敗的潛在原因[12]。

中醫認為LPD性不孕癥發病以腎為本,涉及肝郁、脾虛、氣虛、血虛、陰虛和陽虛[13-15],治療上以補腎為主。隊列研究的薈萃分析顯示,補腎類中藥可在體外受精的基礎上,進一步提高妊娠率至60%,較單純體外受精的妊娠率顯著提高[16]。補腎助孕方是由周惠芳教授數十年的臨床經驗凝練而成,具有補腎寧心,交通心腎之功。課題組前期研究證明補腎助孕方主要通過改善子宮內膜容受性,起到調經助孕的作用[17]。補腎助孕方廣泛應用于不孕癥、高泌乳素血癥、多囊卵巢綜合征等婦科疾病[18-20]。因此,本實驗通過分析補腎助孕方對Treg/Th17細胞平衡的調控作用,為臨床上治療LPD型不孕癥提供新策略和方向。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠:雌性60只,8周齡,體質量180～230 g;雄性10只,10周齡,體質量280～320 g。大鼠均購于北京維通利華實驗動物技術有限公司,實驗許可證號:SCXK(京)2021-0011。統一分籠飼養于南京中醫藥大學實驗動物中心,自由飲食,保持環境清潔,室內溫度控制在22～25 ℃,相對濕度40%～70%,自由飲食。本實驗通過南京中醫藥大學實驗動物福利與倫理審查(倫理編號:202103A043)。

1.2 藥物

地屈孕酮(荷蘭Abbott Biologicals B.V,10 mg·片-1,批號:362941)、米非司酮(上海新華聯制藥有限公司,25 mg·片-1,批號:0019221102)。以上2種藥物充分研磨后,分別利用生理鹽水配置成濃度為0.2、1 mg·mL-1均一混懸液;補腎助孕方由鹿角片10 g,菟絲子15 g,炒白芍10 g,淮山藥15 g,山萸肉10 g,醋柴胡5 g,紫石英10 g和丹參10 g組成,購自江蘇省中醫院。取總藥量8倍量水浸泡藥物30 min,先將鹿角片、紫石英煎煮30 min,加入其他6味中藥,再煎30 min,過濾回收水煎液;再取6倍量水再煎30 min,濾過;最后取4倍量水煎煮30 min?；旌?次水煎液,在62 ℃下通過旋轉蒸發儀進行真空蒸發,得到濃縮成含生藥2 g·mL-1補腎助孕方溶液,-20 ℃密封保存備用。

1.3 主要試劑

抗大鼠CD4 BB700流式抗體、抗大鼠CD25 BV421流式抗體(BD公司,批號:742157、565608),抗大鼠FOXP3 PE流式抗體、抗大鼠IL-17A APC流式抗體、抗大鼠CD3 FITC流式抗體、兔抗鼠RORγT單克隆抗體、固定/破膜液(Thermo Fisher科技有限公司,批號:12-5773-80、17-7177-81、1-0030-82、PA5-86733、00-5523);FIX&PERM KIT試劑盒(南京福麥斯生物技術有限公司,批號:FMS-FP0050);兔抗鼠FOXP3單克隆抗體(武漢三鷹生物技術有限公司,批號:22228-1-AP);大鼠白介素(IL)-10、IL-17A ELISA試劑盒(上海酶免生物科技有限公司,批號:MM-0195R1、MM-70049R1);BCA蛋白質測定試劑盒(上海翊圣生物科技股份有限公司,批號:2021ES86);RIPA裂解緩沖液、蛋白酶抑制劑混合物(上海碧云天生物技術有限公司,批號:P0013B、P1045);HRP標記的二抗(武漢三鷹生物技術有限公司,批號:SA00001-2);SYBR?Green Universal PCR Master Mix、TRIzol試劑(南京諾唯贊生物科技股份有限公司,批號:Q311-01、RC101-01)。

1.4 主要儀器

多色分析流式細胞儀(美國BD公司,型號:GaliosTMFlow Cytometer);多功能酶標儀(瑞士TECAN公司,型號:M200-Pro);高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司,型號:5810R);恒溫振蕩儀(杭州奧盛儀器有限公司,型號:MB100-4P);旋轉蒸發儀(上海Eyela公司,型號:N-1200B);混合球磨儀(德國Retsch公司,型號:MM400);高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司,型號:5810R);光學顯微鏡(日本Olympus公司,型號:BX43F);Power Pac Basic垂直電泳儀、Chemi DOCMP多功能蛋白印跡成像系統(美國Bio-Rad公司,型號:041BR123579、731BR02543)。

1.5 動物分組、造模及給藥

開始實驗之前,動物的體質量沒有顯著差異。每天檢查大鼠陰道涂片觀察發情周期的規律性,呈現出規律的4 d發情活動后,以隨機數字法將雌鼠分為6組(n=10):空白組(生理鹽水),模型組(米非司酮),陽性對照組(地屈孕酮),補腎助孕低、中、高劑量組。

LPD性不孕癥模型大鼠的構建與給藥,參考課題組前期方法[21]。每日8:00發現大鼠進入動情期后空白組灌服生理鹽水(10 mL·kg-1),其他組灌服米非司酮混懸液(10 mL·kg-1)。于15:00以及次日8:00空白組與模型組灌服等量生理鹽水,其余各組灌服相應藥物,藥物劑量根據人與動物體表面積折算,補腎助孕中劑量組對應臨床等效劑量:地屈孕酮組(0.02 g·kg-1),補腎助孕低劑量組(4.5 g·kg-1),補腎助孕中劑量組(9 g·kg-1),補腎助孕高劑量組(18 g·kg-1),此為第1動情周期。連續用藥2個周期后,進入第3周期,于8:00確認大鼠進入動情期后,各組均灌服生理鹽水,當日15:00各組按劑量給予相應藥物(空白組與模型組灌服生理鹽水),18:30開始雌、雄大鼠按2∶1的比例合籠,次日7:30檢測雌鼠陰道涂片見精子為妊娠D1(PD1);除空白組外,其余各組于PD2 9:00給予米非司酮灌胃;于PD2—PD4 14:00地屈孕酮組及補腎助孕方各組按原劑量給藥。PD5處死大鼠,腹主動脈取血分為2部分,一部分肝素鈉抗凝管取血立即用于流式細胞檢測,另一部分促凝管取血用于分離血清,將樣品在4 ℃下以1 000×g離心10 min, -80 ℃保存備用。立即剪取子宮組織,每組隨機選取6個樣本進行病理檢測,余下子宮組織凍存備用。見圖1。

圖1 黃體功能不全性不孕癥大鼠造模方法Fig.1 The modeling method for infertile rats with luteal phase defect

1.6 觀察指標和方法

1.6.1 HE染色觀察子宮組織病理狀態 取子宮組織,經常規透明、打蠟、包埋后切成厚度為5 μm的切片。每組取3片進行HE染色,脫水后密封。采用Olympus顯微鏡拍照,選取10～15個視野觀察子宮組織形態變化。

1.6.2 大鼠外周血Treg與Th17的細胞數量檢測 取2 mL全血于肝素鈉抗凝管中,加入紅細胞裂解液進行裂解,15 min后重懸細胞。取100 μL細胞液加入2.5 μL CD4抗體和CD25抗體進行表面染色,室溫避光孵育20 min,加入1 mL預冷的Staining buffer溶液離心(常溫400 r·min-1離心10 min,離心半徑6 cm),棄上清,加入固定/破膜工作液,室溫避光孵育40 min,充分清洗后加入破膜液,同時加入2.5 μL FOXP3抗體進行核染。

取100 μL細胞液加0.5 μL CD3抗體、2.5 μL CD4抗體,室溫避光孵育15 min;加1 mL Staining buffer溶液清洗(常溫400 r·min-1離心10 min,離心半徑6 cm),棄上清;再加入固定破膜劑100 μL FIX&PERM A工作液,震蕩混勻,室溫避光孵育15 min;充分清洗后加入100 μL FIX&PERM B工作液和0.1 μL IL-17抗體染色。最后清洗,細胞重懸上機檢測,運用FlowJo V10軟件分析Treg和Th17細胞占CD4+T細胞的比例。

1.6.3 大鼠子宮組織相關蛋白的表達檢測 使用含有蛋白酶抑制劑混合物的RIPA裂解緩沖液從冷凍的子宮組織中提取總蛋白。按照說明書,使用BCA蛋白質測定試劑盒測定蛋白質濃度。將5×十二烷基硫酸鈉(SDS)加樣緩沖液添加到樣品中,然后將其在100 ℃下煮沸15 min備用。將等量蛋白質(36 μg)在10%凝膠上進行SDS-PAGE,然后將蛋白質電泳轉移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉30 min,按目標蛋白分子量分段剪切PVDF膜,與抗FOXP3(1∶2000),抗RORγT(1∶1 000),4 ℃過夜;洗膜,加入HRP標記的二抗(1∶5 000),室溫孵育1 h,洗膜,避光條件下加入顯影液進行曝光,以GAPDH為內參進行矯正,用Image J軟件計算條帶灰度值。

1.6.4 大鼠子宮組織相關基因表達檢測 使用TRIzol試劑從冷凍子宮組織中分離總RNA。分光光度法測定RNA濃度,取等量(1 μg)RNA,用反轉錄試劑盒合成cDNA。用SYBR?Green Universal PCR Master Mix和每個基因的特異性引物共擴增2 μL cDNA。用于檢測FOXP3、RORγT和GAPDH mRNA的引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.6.5 大鼠血清IL-10、IL-17A水平測定 取大鼠血清,按照說明書稀釋后備用,配置標本稀釋液、標準品及洗滌液,依次進行布孔、加樣、洗板、孵育一抗、洗板、加入酶標抗體工作液、洗板、加入底物工作液、終止反應,最后用酶標儀檢測各孔在450 nm波長處的吸光度(A)值。

2 結果

2.1 各組大鼠子宮組織病理形態結果

HE染色結果如圖2所示:模型組子宮內膜厚度較空白組明顯變薄(P<0.01),管壁子宮腺體數量減少,腺體小而直。與模型組比較,地屈孕酮組內膜增厚(P<0.05),內膜上皮排列整齊,間質比較致密,腺體增加,腺腔擴張,補腎助孕中、高劑量組中見多量子宮腺體,間質血管豐富,內膜厚度顯著增加(P<0.01),腺體與間質發育同步,與空白組相似。綜上,補腎助孕方可以增加著床期大鼠子宮內膜厚度,促進腺體分泌。各組大鼠子宮內膜厚度比較見表2。

表2 子宮內膜厚度比較Table 2 Endometrial thickness comparison μm, n=6)

注:紅色箭頭指示血管;黑色箭頭指示腺體。

2.2 各組大鼠外周血Treg、Th17細胞占CD4+T細胞百分比及相關因子表達特征比較

流式細胞術分析Treg和Th17細胞占CD4+T細胞百分比。結果顯示,模型組外周血中Treg細胞百分比及IL-10含量較空白組相比下降明顯(P<0.01),Th17細胞百分比及IL-17A含量顯著高于空白組(P<0.01);與模型組比較,地屈孕酮組,補腎助孕中、高劑量組Treg細胞百分比和IL-10水平升高(P<0.01,P<0.001),同時,補腎助孕中、高劑量組Th17細胞百分比和IL-17A明顯降低(P<0.01,P<0.001),說明補腎助孕方可以調節Treg和Th17細胞的平衡,而且這種調節可能呈劑量依賴性。地屈孕酮組IL-17A雖有下降,但無明顯統計學意義。見圖3～4。

注:與空白組比較,##P<0.01,###P<0.001;與模型組相比,

注:與空白組比較,##P<0.01;與模型組相比,

2.3 各組大鼠FOXP3、RORγT蛋白相對表達量比較

為了進一步驗證補腎助孕方對子宮免疫微環境的影響,采用Western blot檢測Treg和Th17細胞核轉錄因子(FOXP3和RORγT)的蛋白表達,結果如圖5所示。與空白組相比,模型組FOXP3蛋白表達下降(P<0.001),RORγT蛋白表達上升(P<0.01);與模型組比較,地屈孕酮組和補腎助孕中劑量組FOXP3蛋白表達上升(P<0.01),補腎助孕高劑量組上升程度更加顯著(P<0.001),而補腎助孕中、高量組RORγT蛋白表達明顯下降(P<0.05),地屈孕酮組RORγT蛋白水平表達雖有下降,但無統計學意義。

注:A.空白組;B.模型組;C.地屈孕酮組;D.補腎助孕低劑量組;E.補腎助孕中劑量組;F.補腎助孕高劑量組;與空白組比較,##P<0.01,###P<0.001;與模型組相比,

2.4 各組大鼠FOXP3、RORγT mRNA相對表達量比較

與Western blot結果比較,FOXP3、RORγT mRNA出現了微小變化。如圖6所示,與空白組相比,模型組FOXP3 mRNA表達下降(P<0.05),RORγT mRNA表達明顯上升(P<0.001);與模型組比較,補腎助孕高劑量組FOXP3 mRNA表達上調(P<0.01),RORγT mRNA表達顯著降低(P<0.001),地屈孕酮組更是顯著增加了FOXP3 mRNA表達(P<0.001),降低了RORγT mRNA水平(P<0.001)。雖然補腎助孕中劑量組FOXP3 mRNA表達上升,RORγT mRNA表達下降,但無明顯統計學意義。

注:與空白組比較,#P<0.05,###P<0.001;與模型組相比,

3 討論

中醫古籍并未記載LPD性不孕癥的病名,根據LPD性不孕的臨床癥狀,將其歸為中醫學“胎漏”“胎動不安”“不孕”等范疇。臨床以國醫大師夏桂成教授提出的“心-腎-子宮軸”的中醫生殖軸理論為指導,主張LPD性不孕癥以補腎助陽為治療大法,腎主生殖理論貫徹治療的始末[22]。腎中元氣,是生命的原動力、人體的先天之本,對五臟六腑起著至關重要的溫煦、濡養、激發等作用。腎陰滋盛,涵養卵子,助長胞宮;腎陽充旺,鼓卵促排,暖煦胞宮。先天之精充養后天之氣,滋養肝血,運化脾氣,氣血充盈,則胞宮得養,經孕如常。補腎助孕方以鹿角片為君,溫腎助陽,益血生精;菟絲子、炒白芍、懷山藥、山萸肉共為臣藥,以補肝腎之精陰,佐以柴胡疏肝解郁、鼓舞陽氣,紫石英寧心安神,全方共奏補腎助陽,調經助孕之功。

米非司酮作為孕激素的經典拮抗劑,可破壞子宮內膜容受性并抑制囊胚著床。本實驗采用米非司酮成功構建LPD性不孕癥模型,造模后大鼠子宮內膜腺體分泌延遲,蛻膜化被破壞,補腎助孕方干預后,大鼠子宮內膜上皮細胞結構發生改變,子宮內膜厚度增加,促進了子宮內膜上皮細胞腺體間質同步發育,這與前期課題組研究結果相一致[21],表明補腎助孕方改善了子宮內膜容受性,為胚胎植入提供了良好的環境?；谶@些前提,我們探討補腎助孕方促進著床作用的潛在機制。

胚胎植入是一個復雜的生理過程,包含囊胚侵入子宮內膜,胚胎的持續生長發育、妊娠的建立與維持等[23],受多種因素影響,子宮內膜蛻膜化的發生發展和維持是胚胎植入、胎盤形成及妊娠維持的必要條件[24]。炎癥樣過程對蛻膜的組織生長、重塑和分化至關重要。胚胎植入過程中,炎癥反應必須被控制并逆轉為抗炎狀態。在眾多免疫細胞中,Th17細胞是輔助性T細胞的重要譜系,通過分泌IL-17參與胚胎植入的炎癥反應。在IL-17家族中,IL-17A對妊娠免疫最為重要,IL-17A通過與受體結合來引導多種自身免疫性疾病的發生,IL-17A的變化提示Th17水平的改變及疾病的發生。研究表明,IL-17的過表達不利于胚胎著床及妊娠的維持[25]。Treg細胞具有抑制抗原特異性免疫的作用,主要分泌IL-10和TGF-β并表達CD25、CTLA4和PD-L。Treg細胞可以通過細胞與細胞之間的直接接觸抑制Th17過度活化并減少IL-17的分泌。Th17與Treg來源相同,但功能上相互拮抗,在胚胎植入和妊娠期間需要兩者維持精細的免疫平衡,尤其是胚胎著床部位[26]。當Treg/Th17細胞失衡向Th17細胞方向偏移時,小鼠和人類就會發生植入失敗和流產[27-28]。FOXP3、RORyT分別是Treg、Th17細胞的特異性核轉錄因子,在這2種免疫細胞的發育和功能中發揮重要作用,檢測子宮組織FOXP3和RORγT的表達可以間接反應Treg細胞和Th17細胞的水平。

基于上述理論,我們探討了補腎助孕方對LPD性不孕模型大鼠Treg/Th17細胞平衡的作用,結果發現LPD性不孕模型大鼠外周血Th17細胞百分比和相關因子的表達明顯上升,而Treg細胞百分比及相關因子呈現不同程度的下降趨勢,表明LPD性不孕大鼠處于Treg/Th17免疫失衡的炎癥狀態,補腎助孕方的干預逆轉了上述趨勢,證明補腎助孕方可以調節LPD性不孕模型大鼠Treg/Th17免疫平衡,有利于Treg偏倚。孕酮可抑制T細胞分化為Th17細胞,同時抑制IL-17及RORγT的表達[29-30]。本研究亦發現,地屈孕酮同樣具有調節Treg/Th17細胞平衡的作用。流式細胞和血清ELISA結果均顯示地屈孕酮可增加Treg細胞百分比及相關因子表達,降低Th17細胞百分比,但地屈孕酮組IL-17A下降無明顯統計學意義,提示補腎助孕方較地屈孕酮而言,對Treg/Th17平衡的靶向性可能更強。綜上所述,補腎助孕方可能通過糾正Treg/Th17細胞失衡,調節子宮內膜的免疫狀態,改善子宮內膜容受性,促進胚胎植入。

然而,本研究有一定的局限性,沒有繼續追蹤或記錄妊娠后大鼠的命運。我們只觀察了著床期補腎助孕方對局部免疫的影響,而沒有探討它們對妊娠中晚期外周和局部免疫平衡的影響。此外,補腎助孕方如何改善的深入機制尚不完全清楚,將在未來做進一步研究。