中藥及其活性物質調控干細胞分化與功能研究進展

章騰, 宋夢瑤,錢程,鄒偉,王愛云,2,陸茵,2,3

(1. 南京中醫藥大學藥學院,江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室,江蘇 南京 210023;2. 南京中醫藥大學江蘇省中醫藥防治腫瘤協同創新中心,江蘇 南京 210023;3.南京中醫藥大學江蘇省中醫藥與再生醫學研究國際合作聯合實驗室,江蘇 南京 210023)

中醫藥是中華民族的傳奇瑰寶,是經歷數千年臨床驗證的科學理論體系。然而隨著現代生物技術的快速更迭,中醫藥的研究手段、技術方法、治療模式以及轉化應用等方面亟需得到進一步的突破和創新。

現代再生醫學旨在修復或使功能衰弱的器官和組織再生,通過獲得非免疫抑制的狀態來減少藥物毒性和抗排異藥物的成本[1]。其最終目的是通過提供根本性的治療而非姑息治療,改變未來的醫學實踐。這與中醫藥理論中“治本”的觀念不謀而合?，F階段,已有諸多學者逐步將促進體內組織修復并涵括生物學及工程學的一些理論和方法與傳統中醫藥理論相結合,形成具有現代中醫特色的“中醫再生醫學”[1]。

干細胞具有自我更新能力,能夠分化為多種細胞類型[2]。因此,在先進的再生工程和細胞治療中干細胞具有巨大潛力。到目前為止,其來源主要有四個:胚胎組織、胎兒組織、骨髓和成體組織,可劃分為胚胎干細胞(Embryonic stem cells, ESCs)、間充質干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)、神經干細胞(Neural stem cells,NSCs)、造血干細胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)以及誘導性多能干細胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs)。以往ESCs和MSCs是再生醫學延緩衰老,治療疾病的主要工具。隨著諸多重編程方法的問世,iPSCs逐漸成為再生醫學的主流。它能解決與胚胎干細胞相關的倫理問題及體外干細胞擴增的局限性問題,在器官移植和細胞療法方面進一步提高了再生醫學技術的研究層次。

1 干細胞和中醫藥的協同需要中醫藥理論指導

現階段,隨著國內外老齡化趨勢的加劇。因年齡增長產生的受損組織再生和替換的需求正在不斷擴大。針對此類需求,利用活檢獲取已分化細胞是臨床選擇之一。這類細胞在適當的支架上擴增后能夠用于受損組織的修復。但該方法體外培養效率低下。干細胞具有高度增殖能力,是解決上述問題的有效方法之一[3]。

干細胞是現代再生醫學的核心,是負責器官和組織系統發育與再生的生物組織單位[4-5]。這類細胞具有強大的自我更新和多能分化的潛力,能分化為多種細胞系和完整的組織器官。主要有以下用途:①直接注射干細胞,用于損傷部位修復或再生;②憑借細胞自身多能分化的潛能,定向誘導為特定細胞系用于疾病建模和治療;③借助干細胞的高增殖、高分化的特性,使其在合適的支架上分化為廣泛的細胞系或完整的器官用于組織工程[3]。因此,干細胞在組織工程和細胞療法中都占據重要地位。

但是調控干細胞分化和利用干細胞治療是一個復雜的過程[6-7]。臨床上,不同疾病的患者無法通過使用相同的干細胞療法獲得同樣的治療效果,治療過程中也缺乏靈活調節干細胞功能的措施。如果臨時變更干細胞類型,誘導過程又會額外增加生產成本從而大大提高患者的經濟負擔。最新研究表明,中藥分子及其提取物相對容易獲得,在解決內源性干細胞不足、干細胞定向分化以及功能調控等問題上發揮著重要作用[8-10]。據報道,這些中藥及其活性成分可協同干細胞或調控干細胞功能,根據患者病情,更靈活地治療疾病[11]。但在此過程中再生醫學缺乏理論指導。而中醫藥理論中的辨證論治可針對不同個體、在不同疾病狀況下指導天然藥物和干細胞的正確、準確的應用[12-14]。中醫理論中的“腎精”“精氣血”“陰陽自和”等理論均與干細胞有著千絲萬縷的聯系。因此,運用中醫藥理論指導干細胞和中藥治療疾病,既是擴大干細胞應用的助推力,也是中藥在再生醫學領域中的優勢體現。

2 傳統中醫藥理論與再生醫學的理念相互契合

傳統中醫藥文化是中華民族智慧的結晶,是在中醫藥理論的指導下利用天然藥物保護與增進人類健康,預防與治療疾病的醫學科學。傳統中醫藥理論中并沒有對再生醫學有明確的理解和敘述,但兩者“治本”的基本理念和“治病”的臨床實踐是高度相似的。中醫理論認為,生機是機體自我調節和修復再生能力的表現,是維持人體健康的根本,屬于中醫概念中“神”的范疇[1]。古籍中有云:“神者,生之制也”,“失神者死,得神者生也”。因此,中醫多是從整體出發,基于人體自身再生能力和自我調控機制使用中藥或自然方法預防和治療疾病。而維護生機也是再生醫學治療疾病的關鍵理念,亦是預防疾病和健康長壽的秘訣所在。

中醫“腎精”理論與再生醫學觀念也存在相通點?！夺t學正傳》中提到:“腎元盛則壽延,腎元衰則壽夭”。外邪入侵或機體衰老的內在表現也是精氣神的虛衰,腎精的虧虛[15]。NSCs與中醫“腎精”相似,甚至被認為是“腎精”在細胞層面的特殊表現[16]。古籍中有云:“人始生,先成精,精成則腦髓充”。人體中封藏于腎的“腎精”是形成“神”的基本物質。而NSCs能分化為神經元和星形膠質細胞等,是多種腦細胞的前體細胞,也是中樞神經系統分化完整的基本條件。其次,NSCs可促進神經細胞的增殖和造血相關細胞的分化,影響個體生命的發育和成熟。這與“腎主生殖”“腎藏精,精生血”的中醫理論不謀而合[17]。人體之“精”又分為“先天之精”和“后天之精”。男女兩精結合是人體生命產生和發展的本源[18]?！饵S帝內經》曰:“夫精者,生之本也”“兩神相搏,合而成形,常先身生,是謂精”?！跋忍熘狈A受于父母,經過水谷之精的滋潤、滋養使其在腎臟藏而化生。在再生醫學中干細胞是促進創傷修復和調控組織再生的關鍵。其中胚胎干細胞來源于胚胎,分化為整個生命個體,類似于生命發生時藏于腎臟的“先天之精”。成體干細胞是存在于已分化組織(肝、脾等)中的干細胞群體,類似于貯藏在臟腑的先天之精(臟腑之精)[18]。藏于各大臟腑中的“腎精”經過“腎氣”的激發或中藥的干預可進一步彌補器官的生理性損傷和組織缺失,故古書中有云:“腎為先天之本”。除此之外,機體內還存在“骨髓之精”,類似于調控氧化應激的骨髓干細胞。因而,“腎精”的充盈是機體具備再生作用的關鍵基礎,故中醫常突出強調“先天稟賦”的重要性[1,17]。先天稟賦好的個體,后天所具備的再生修復能力強,表現為不易患病或患病后能快速康復。

陰陽學說也體現著機體再生功能的制約和平衡。人體內陰陽雙方可在生理和病理狀態下調節平衡,因此有學者認為:人體的再生修復功能也是陰陽自和的作用體現[18]。正常生理條件下,細胞和組織自然衰老凋亡,由嶄新細胞和組織補充以維持原有結構和功能,這體現了機體系統內部的自我調節的能力。這也正是中醫理論中陰平陽秘和陰陽自和的自然過程。此外,五行學說中的生克制化也體現了臟腑之間相互滋生、制約的平衡狀態。

依據中醫藥相關理論,確定治則治法,確定中藥類別和干細胞類型,選擇具體中藥和干細胞進行協同治療會更加準確、有效。

3 中藥依據中醫藥理論調控干細胞的生理功能

中藥是在中醫藥理論指導下使用的天然藥物,是中醫藥的主要應用形式和體現,也是化學物質的重要來源?，F階段,有研究證明中醫藥理論中不同的治則治法對干細胞功能有著不同影響[19]。由于國際上越來越多的研究聚焦于中藥及活性成分對干細胞的影響,因此以下針對現階段科研上常用的干細胞類型闡述中醫藥在其中的干預調節作用。

3.1 依據“扶正”“調和”調控ESCs增殖、分化

ESCs是再生醫學的重要細胞來源,具有高度自我更新和多向分化的潛能,理論上可以分化為機體內幾乎所有細胞類型,在臨床治療中有廣泛的應用。

ESCs被認為是人體在腎臟藏而化生的“先天之精”[18]。因此,中藥干預ESCs也主要是圍繞“扶正”“調和”理論進行的。其中中醫補腎方含藥血清對人ESCs體外分化存在影響,補腎方的含藥血清可明顯促進擬胚體分化為類卵泡結構[20]。而生半夏湯的含藥血清能夠誘導小鼠ESCs的晚期凋亡,但干姜和半夏配伍組合能夠抑制晚期凋亡并促進ESCs的增殖和分化[21]。另外,中藥方劑扶正化瘀方處理后,可引起ESCs細胞內白蛋白、代謝酶和轉運蛋白的表達增加以及胞內WNT信號通路的激活,使其趨向于肝細胞分化[22]。見圖1。

圖1 中藥干預間充質干細胞的增殖和分化Fig.1 Chinese medicine interferes with the proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells

此外,縮泉丸[23]、川芎[24]、赤芍[25]等中藥對ESCs的增殖也存在影響。

3.2 依據“補法”“活血化瘀法”調控MSCs

MSCs是非造血、多能的成人干細胞,可從骨髓、臍帶、脂肪組織、大腦甚至牙齦中獲取[26-27],能定向分化為軟骨細胞和骨細胞并分泌外泌體和生物小分子參與組織的再生與修復。例如:MSCs分泌過表達缺氧誘導因子1α(Hypoxia inducible factor,HIF-1α)的外泌體,促進心肌梗死模型中因缺氧受損的內皮細胞血管生成能力的恢復[28];改良后的人骨髓MSC分泌的外泌體也可抑制心肌細胞的細胞焦亡[29]等。

3.2.1 依據“補法”調控MSCs的增殖和分化 現代醫學中的MSCs與中醫“髓”的概念相呼應。中醫認為:“腎藏精,主骨生髓,腎精足則腦髓充養”。因此具有“補腎益精”“補氣養血”“舒筋活絡”“強筋骨”等功效的中藥或處方多用于調節間充質干細胞活力和增殖。金匱腎氣丸和六味地黃丸等中藥補腎強骨名方的含藥血清刺激衰老骨髓中的MSCs后,細胞中Ⅰ型膠原蛋白和堿性磷酸酶表達升高,促進了體內的成骨分化[30]。扶芳藤含藥血清能激活胞內Notch1通路刺激骨髓MSCs的增殖,促進MSCs胞內胰島素的釋放,修復炎癥損傷引起的胰島素功能損傷[31]。而七方痹敏湯在MSCs治療過敏性鼻炎中具有額外的治療作用[32],使用七方痹敏湯刺激MSC后再注射會顯著抑制卵清蛋白誘導的過敏性鼻炎的癥狀,減輕鼻黏膜病理變化[32]。

除此之外,中藥復方冠心丹參方[33],中成藥參附注射液[34]等,中藥地黃[35-36]、鐵皮石斛[37]均可促進間充質干細胞的分化和增殖。中藥成分白藜蘆醇[38]、姜黃素[39]、靈芝酸-D[40]、人參皂苷Rg1[41]、淫羊藿苷[42-43]、樟腦醌[44]、當歸多糖[45]、黃芪多糖[46]、細辛脂素[47]、黃芩苷[48]等也均可維持間充質干細胞活力和功能,促進增殖。

3.2.2 依據“活血化瘀”法調控MSCs外泌體的分泌和遷移 “活血化瘀”法是中醫八大法中的消法?！堆C論》曰:“瘀血去則新血生,新血生而瘀血自去”[49],認為“生新”是活血化瘀法的本質。這與MSCs動員入血、衍生出外泌體修復損傷的過程高度吻合。因此,中藥是依據“生新”和“活血”理論調動MSCs及其外泌體發揮治療作用的。例如:中藥復方象皮生肌膏預處理后的骨髓MSCs衍生的外泌體就能夠促進人臍靜脈內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖、遷移、小管形成以及血管內皮生長因子的表達[50]?；钛雒剿傩Ь刃耐璧暮幯蹇稍鰪奙SCs衍生的外泌體遷移能力和對心肌梗死的治療作用[51]。此復方以GTPase依賴性的方式上調心臟間充質細胞中Rab27b mRNA水平、促進Rab27b蛋白產生,誘導外泌體分泌以調節心臟穩態,保護心肌細胞、促進心臟修復[52]。而將復方通心絡預處理過的MSCs衍生外泌體可以遷移到大鼠心臟的梗死區域,顯著改善左心室射血分數,減少梗死面積[53]。

3.3 依據“精氣血互生”理論調控HSCs增殖、分化

HSCs是存在于造血組織中的原始細胞,是大多數造血細胞和免疫細胞的起源。出生后,骨髓成為HSCs的主要來源。在胚胎迅速生長的骨髓中造血干細胞多處于增殖周期,而在成年人骨髓中多處于靜止期。

臨床上中醫學者多是基于“精氣血互生”理論調控HSCs功能的。其中扶正補血食療方的含藥血清能抑制HSCs的凋亡,促進增殖,并通過影響Notch信號發揮抗化療后的骨髓抑制作用[54]。該方本身就具有補血養血的功效,所以對機體內的造血相關細胞具有一定的影響。而龜鹿二仙膠滋陰填精,益氣壯陽,其含藥血清顯著下調β-gal,p16INK4a,p53和p21Cip/Waf1蛋白表達以延緩環氧酰胺誘導的HSCs衰老[55]。方中藥物少有補血功效,反而多以補氣填精為主,卻最終起到了延緩HSCs衰老,維持正常造血的作用。此研究驗證了“氣”能鼓動“精”等物質轉化為“血”暫時彌補身體中血不足的現象,也印證了“精血同源”“氣能生血”的中醫理論。復方阿膠漿氣血雙補,補氣能行血、攝血以推動和維持血液在脈管中正常運行。而補血能增加血液對氣的濡養作用,兩者相互影響、相互作用。因此該方能夠參與機體造血功能的調節。有實驗證實,在給予復方阿膠漿10 d后,骨髓抑制小鼠中的HSCs百分比顯著增加,造血祖細胞向所有譜系細胞的分化增強,加速了體內造血功能的恢復[56]。此外,中醫認為:“氣為血之帥”,氣是血液生成的動力,能參與、促進血液的化生。例如:補氣代表藥黃芪中的黃芪多糖能與骨髓中的HSCs直接結合,增強細胞中FOS表達,保護HSCs免受環磷酰胺等化療誘導的骨髓抑制[57]。并且黃芪多糖與當歸多糖共同使用還能激活RAS-MAPK信號通路調控骨髓HSCs增殖、分化[58]。

現階段,HSCs在移植領域取得重大進展,但對于在術后促進恢復方面的手段仍很有限。HSCs移植后會在患者體內引發移植物抗宿主病導致死亡。研究人員認為這種外源性造血干細胞的侵入引起的T淋巴細胞激活會是患者體內的“邪毒”?！拔逍小崩碚撝姓J為:“邪毒”傷腎起始,腎精虧虛,無法鼓動五臟正氣,逐漸累及其余五臟,機能減退,病邪叢生[59]。中醫藥在分階段干預多發性骨髓瘤患者自體HSCs移植過程中具有協同、互補的作用,促進造血系統的重新構建、減少不良反應的發生。其中益髓解毒方益精填髓,顯著提高骨髓瘤患者的完全緩解率和深度緩解率,有效預防相關并發癥的發生[60-61]。在移植HSCs治療重型再生障礙性貧血過程中,補腎活血化瘀類中藥相較于非中藥制劑更能降低移植的失敗率和治療相關的死亡率,并提高移植患者的總生存率[62]。

此外,中藥補氣藥黃芪[63]、補血藥當歸[64]、地榆[65]也能增強和保護造血干細胞功能。

4 中醫藥和再生醫學發展迎來新機遇

4.1 中藥作為生物材料影響干細胞功能

中藥提取物及其天然分子也可作為生物相容性材料,與功能性分子聯合,共同在干細胞調控方面發揮作用。與現代醫學材料相比,中藥提取物更適合被制成用于干細胞培養和分化的生物材料。一方面,中藥提取物是多成分的,富含多種干細胞所需的營養物質。另一方面,中藥提取物具有較好的藥劑學性質,?；?藥輔合一"的理念制備水凝膠和生物膜劑。例如:中藥牛骨提取物能夠被制成生物支架或復合材料,BMSCs在其上方生長可表現出更強的增殖和成骨分化的能力[66-67]。

傷口愈合是一個高度協調的過程,涉及到多種細胞的參與。圍繞此方面開發出包含中藥成分的生物材料是可行的策略。例如:在機械力的作用下,可制備出聚氨酯天麻素與納米羥基磷灰石結合的復合材料,用于愈合傷口。使用這種復合材料體外共同培養RAW 264.7骨髓MSCs、巨噬細胞以及HUVECs,可使巨噬細胞趨向于M2型分化并提高骨髓MSCs中BMP-2、ALP等成骨相關因子的表達,加速成骨、血管生成以及傷口愈合[68]。除此之外,具有良好生物兼容性的中藥魚膠原蛋白膜也可用于MSCs的增殖和分化[69]。蛋白膜由于木黃酮、淫羊藿苷及柚皮苷等中藥成分的加入,其自身的溶解性和體外生物降解性得到增強,并且在此類膠原膜上培養MSCs會提高細胞增殖調控基因水平和增殖速率[69]。

中醫根據中醫藥理論選擇有效的中藥,但中藥及其提取物的作用機制需要進一步的研究。其中各成分的功能鑒定是制備生物材料的前提。以目前的技術,也很難解決這個巨大難題。這也導致生物材料制備所用的中藥多是以中藥成分的形式出現,而非提取物。但探索中藥與現代醫學融合的研究仍在繼續,有希望產生包含中藥提取物的新型生物材料。

4.2 iPSCs可能是中醫藥和再生醫學發展的新工具

iPSCs是使用多種載體在終末分化的體細胞中導入Oct4、Sox2、Klf4等轉錄因子,重編程后獲得的一類多能干細胞。自2007年山中伸彌首次成功將體細胞重編程為具自我更新能力的干性細胞以來,相關研究和應用不斷被挖掘[70]。iPSCs分化為特定細胞群的過程冗雜多變(誘導分化過程的突變和畸形瘤的形成),但卻能規避胚胎干細胞應用附帶的倫理和法律問題。在理想情況下,來源于個體患者的iPSCs可產生多種類型的細胞、組織以及器官進行疾病建模和治療。例如:基于iPSCs技術的肝病、心肌梗死以及阿爾茨海默癥的疾病建模和藥物篩選[71];使用嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)工程編輯后,iPSCs衍生CAR-T[72]、CAR-NK[73]和CAR-巨噬細胞[74]治療腫瘤等。見圖2。

圖2 誘導性多能干細胞經過嵌合抗原受體編輯后分化為特定免疫細胞Fig.2 iPSCs are edited by chimeric antigen receptors to differentiate into specific immune cells

中藥也能解決iPSCs所面臨的問題。在iPSCs定向分化為特定細胞的過程中,畸形瘤的產生是重大疑難問題。近期研究表明:中藥蜂毒和黃連醇提物都能抑制畸形瘤的產生,但是兩者發揮作用的機制不同。前者通過鈣蛋白酶途徑去除iPSCs中致畸性的細胞亞群降低畸形瘤產生的風險[75]。而后者是通過選擇性誘導未分化的iPSCs中的DNA損傷和活性氧的產生,降低細胞活力誘導細胞凋亡[76]。除此之外,部分中藥也可調節iPSCs的分化?；钛鏊幍?味苦、性寒,有活血化瘀、清心除煩、養心安神的功效。經證實,丹參能促進iPSCs分化為神經元[77],并且其中丹酚酸B還可保護iPSCs衍生的NSCs免受過氧化氫造成的損傷[78],維持正常腦功能。

現如今,iPSCs技術在多個領域中快速更新發展,但與中醫藥的結合卻很少。目前的大多數研究也僅是圍繞中藥成分在iPSCs分化為神經或心臟細胞中起到的相關作用開展探討,研究的范圍比較局限。比如利用iPSCs進行中醫證候相關的疾病建模,或者是闡述中醫的“精氣血互生”“陰陽五行”理論的科學性等都是較好的想法,但卻鮮有人付諸實踐。因此中醫藥與干細胞之間仍然存在巨大的潛力和可能,等待發掘。

5 中醫藥與再生醫學發展遇到的新挑戰

雖然從2022年開始,政府頒布了一系列政策,加大對中醫藥和干細胞的扶持力度,但目前仍只有少數人從事干細胞與中醫藥的相關研究。其發展緩慢或許是由于中藥中廣泛存在同名異物和同物異名的現象,藥材難以規范化。另一方面,中藥種類繁多,一藥多基原的現象也普遍存在,難以對中藥中多個來源的品種標準化。此外,產地分散、替代品層出不窮,生長環境、采收季節以及炮制工藝的差異,也都會造成化學成分的變化,使中藥的質量控制成為難以跨越的障礙。解決上述問題,或許能夠促進中醫藥與干細胞的進一步發展[79]。

目前,衰老和疾病引起的組織器官衰竭、缺損或功能障礙的人數正在逐年上漲。據統計,現階段我國一線城市心力衰竭的住院費用就給患者帶來巨大的經濟負擔,其中手術費用和住院費用占據多數,進而造成患者的心理負擔[80]。與此同時,每年常見的燒傷、燙傷群體也非常龐大。而燙燒傷的傳統治療方法已無法滿足現階段人民對健康保健的需求,迫切需要新型的治療方式。已有實驗表明干細胞和中醫藥的聯合,可以緩解組織器官的衰竭,促進損傷后組織再生,減少患者的免疫排斥反應。深入挖掘兩者的作用關系將是再生醫學和同種異體療法發展的重要方向之一。

6 結語與展望

傳統中醫與現代醫學具有不同的理論思維模式,但隨著人類對健康需求的高質化,中醫和現代醫學走向融合是未來發展趨勢。中醫藥使用各種手段,調動人體的再生潛能以恢復機體的整體平衡,這其中就包括運用中藥成分,單味藥以及復方干預干細胞的過程。而干細胞應用廣泛,可作為驗證中醫理論和用藥科學性的重要工具。然而,還有大量的問題有待解決。包括中藥發揮作用的具體成分和機制,干細胞歸巢和分化與“歸經”理論的關系等。

干細胞是再生醫學的核心內容,而非全部內容?，F階段快速發展的3D打印技術和納米生物材料也是再生醫學的組成部分。新穎的納米材料可以將藥物和干細胞送至體內損傷部位,實現靶向遞送和干細胞的誘導分化。而3D生物打印技術能模擬體內細胞生長環境,為干細胞分化成高度復雜的組織化結構提供了更多可能?？傊?3D打印技術和納米生物材料均是作為輔助角色服務于干細胞應用的。因此在再生醫學和中醫藥調控干細胞的研究中,引入這種國際新技術、新方法是必要的,這也可能是中醫藥和再生醫學發展的未來方向。