三江源區高寒草原退化對不同生長期土壤真菌群落的影響

楊明新，陳科宇，李成先，黃青東智，張 靜，谷 強

（1.北京林業大學草業與草原學院, 北京 100089；2.中國地質調查局西寧自然資源綜合調查中心, 青海 西寧 810000）

草地生態系統是我國面積最大的陸地生態系統類型，提供了重要的生態系統服務功能，如水源涵養、生物多樣性維持、牧草生產、文化傳承、地方和區域的旅游和休閑等[1-3]。但由于20 世紀對草地的不合理利用和過度開發加之全球氣候變化的影響，我國大面積草原處于退化狀態[4]。草地退化的主要表現為植被蓋度和生產力下降、毒雜草比例增加，生態環境加速惡化，生物多樣性減少，草地生態系統可提供的多種服務功能減弱，最終威脅區域生態安全[5-6]。草地退化不僅表現為植被群落的退化，土壤與土壤生物群落也會發生同步變化，并影響草地生態系統物質循環和能量流動過程[7-9]。因此，探究草地退化過程中土壤生物群落的變化規律，對于闡明退化對草地生態過程的影響，提高修復治理效率具有重要意義。

土壤微生物群落是陸地生態系統重要生態過程的主要驅動力，特別是土壤真菌群落在凋落物分解過程中發揮著重要作用[10]。但在草地退化過程中，由于植物群落和土壤環境的強烈變化，土壤真菌群落組成、結構和多樣性通常在一定程度上發生改變，進而影響其群落功能及相關生態過程[11]。隋心等[12]在東北三江平原的研究表明，草甸退化顯著改變了真菌群落的組成和多樣性，并可能增強土壤中碳的釋放。蔡曉布等[13]研究表明，草地退化會導致土壤真菌數量顯著下降，進而影響土壤微生物碳氮含量和脲酶、磷酸酶活性。金志薇等[8]研究表明，草地退化后土壤微生物群落豐度顯著降低，并且明顯改變微生物群落結構。Luo 等[14]研究發現，草地退化降低了土壤真菌群落的復雜性以及生態系統的多功能性。此外，土壤真菌群落具有一定季節性，群落結構和多樣性會隨時間變化而發生改變[15]。Ullah 等[16]研究表明，季節變化導致的土壤真菌群落改變會影響相關酶的分泌，進而影響土壤碳循環過程。然而，目前鮮有研究關注草地退化對不同生長期土壤真菌群落的影響，限制了草地退化對土壤真菌群落生態過程影響的認識，特別是在草地退化風險較高的青藏高原地區。

青藏高原是世界上面積最大、海拔最高的單一地貌單元，被譽為“亞洲水塔”。而位于青藏高原腹地的三江源地區是我國重要河流上游的關鍵區，每年向下游供水約200 億m3，是我國影響力最大的生態調節區之一[17]。高寒草原作為三江源區內主要生態類型之一，受全球氣候變化和人類活動的綜合影響，草原退化現象普遍，嚴重威脅區域生態安全[18-19]。因此，本研究以三江區高寒草原為研究對象，通過野外調查和高通量測序相結合，探究不同生長期草地退化對三江源區高寒草原土壤真菌群落的影響及其驅動因素，為預測草地退化對生態系統過程的影響提供數據支撐，同時為針對性制定土壤群落恢復治理措施提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究區域概況

本研究區位于青海省三江源國家公園黃河源園區(97°01′20″～99°14′57″ E，33°55′05″～35°28′15″ N，平均海拔4 500 m)。區域內是典型的高原大陸性氣候，具有冷暖交替、旱雨交替的特點，年均降水量303 mm，年均溫-4 ℃。高寒草原是該區域主要草地類型之一，主要優勢植物種為紫花針茅 (Stipapurpurea)，常見伴生植物種有草地早熟禾 (Poa pratensis)、二裂委陵菜 (Potentilla bifurca)、多裂委陵菜 (P.multifida)、黑褐苔草 (Carex atrofusca)等。在20 世紀末期，由于氣候變化、超載過牧以及鼠蟲害等原因，黃河源區草地發生了嚴重的退化[20]，雖然近年來政府部門實施了一系列的生態保護工程措施，草地退化得到有效的遏制，但研究區仍有部分草地還處于退化階段，高寒草原退化后以火絨草(Lobularia maritima)、細葉亞菊(Ajania tenuifolia)、披針葉野決明(Thermopsis lanceolata)、沙生風毛菊(Saussurea arenaria)等雜類草為主[21]。

1.2 采樣方法

在研究區內根據草原植被群落特征設置6 個1 km × 1 km 的樣地(圖1)，其中以高寒草原區紫花針茅為優勢種的樣地視為原生草原，以高寒草原區沙生風毛菊、細葉亞菊、披針葉野決明、火絨草等雜類草為主的樣地視為退化草原[19,22]，原生草原和退化草原各3 個樣地(表1)。于2021 年植物生長季初期(5 月19 日－21 日)、生 長 季 盛 期(8 月10 日－16 日)和生長季末期(10 月11 日－14 日)分別進行土壤真菌群落樣品采集，在每個樣地內隨機選取植被群落、生境條件和利用方式相對一致的區域各設置4 個1 m × 1 m 重復樣方，使用內徑3 cm 土鉆在樣方內隨機選擇3 個點采集0－20 cm 土樣混合后作為該樣方的土壤樣品。將土壤樣品過2 mm 篩，去除植物殘體、根系及石塊，-20 ℃冰箱保存用于提取土壤真菌群落DNA。于8 月植物生長盛期進行植被群落調查及土壤理化特征樣品采集，通過樣方法測定植物群落不同植物種高度、蓋度、頻度，并記錄樣方內物種豐富度，然后將植物地上部分全部進行刈割后帶回實驗室用于測定植物群落生物量。在樣方內采用環刀法采集土壤容重樣品，隨后用土鉆采集的土壤樣品一部分用于測定土壤含水率和有機質、有機碳、全氮、全磷、速效磷、銨態氮、硝態氮含量等理化指標。

表1 樣地位置及植被群落特征Table 1 Locations of sampling sites and vegetation community characteristics

圖1 研究區位置及樣地分布圖Figure 1 Location of the study area and distribution of the sampling sites

1.3 土壤理化特征測定方法

土壤容重及含水率均采用烘干法測定；土壤有機質含量采用重鉻酸鉀容量法－外加熱法測定[19]；土壤全氮、全磷、速效磷、銨態氮和硝態氮含量采用連續流動分析儀 (AMS Alliance, Proxima，法國)測定。

1.4 土 壤DNA 提 取、PCR 擴 增、illumina 測 序和數據處理

根 據 說 明，使 用DNeasy Powersoil Kit 試 劑 盒(Qiagen，德國)從0.25 g 土壤樣品中提取DNA，使用NanoDrop 2000C 分光光度計 (Thermo Fisher Scientific,Inc., Waltham, MA, USA)測量DNA 的 濃度和質量。使 用ITS3 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3′)引物擴增 真 菌ITS 區[23]。PCR 擴 增 使 用BIO-RAD C1000 TouchTMThermal Cycler (BIO-RAD，美國) 完成，混合后的PCR 純化產物，用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒 (Illumina，美國) 進行標準建庫，構建好的文庫經過Qubit，文庫合格后，使用Illumina 測序平臺進行上機測序。

MiSeq 測序數據的處理由QIIME 1.7.0 (http://qiime.org/tutorials/tutorial.html)完成。根據樣本條形碼對原始序列進行排序，并使用QIIME 對序列進行質控(長度 ＞ 300 bp，平均基礎質量評分 ＞ 30)。用UCHIME算法去除嵌合體序列[24]。序列通過QIIME 管道中包含的完全鏈接聚類方法進行聚類[25]?；?7%的序列相似性閾值，將序列聚類為操作分類單元 (OTUs)。在alpha 和beta 多樣性分析中，每個樣品都被提純到具有最低讀數的土壤樣品 (50 254 條序列)，并根據生成的物種觀察稀釋曲線，使用Ribosomal Database Project classifier 進行分類。

1.5 數據分析

基于植物群落高度、蓋度、頻度獲得的重要值分別計算植物群落Shannon 多樣性指數和Pielou 均勻度[26]。

重要值 (Important value, IV)：

IV=(相對蓋度+相對高度+相對頻度)/3。

香濃維納多樣性指數 (Shannon-Wiener index, H)：

均勻度指數 (Pielou J index, J)：

式中：Pi為樣方中第i種植物在群落中所占的重要值；S為種i所在樣方的物種總數[27]。

使用SPSS 19.0 的單因素方差分析(One-way analysis of variance) 和 最 小 差 數 法(least significant different, LSD) 進行各項指標 (植物群落生物量、蓋度、多樣性，土壤理化特征，土壤真菌群落特征)的差異顯著性檢驗。以OTUs 相對豐度表格作為輸入數據，使用R version 3.4.0 計算Bray-Curtis 距離，采用基于Bray-Curtis 距離的非度量多維標度(nonmetric multidimensional scaling, NMDS) 評 估 真 菌 群 落 結構，并通過adonis 命令對不同退化程度和生長期的土壤真菌群落結構進行差異分析。使用SPSS 19.0的Pearson 相關性分析功能，分析植物群落和土壤理化特征與植物生長盛期真菌群落多樣性的相關性。使用R version 3.4.0 進行消除趨勢對應分析(detrended correspondence analysis, DCA)，并 根 據 結果對原生和退化植物群落特征、土壤理化特征、真菌群落結構進行距離典型相關分析 (distance-based canonical correlation analysis, db-CCA)，分析影響土壤真菌群落的主要因素。

2 結果與分析

2.1 植物生長盛期草原退化對植物群落和土壤理化特征的影響

在高寒草原生長盛期進行的植物群落調查結果顯示，草原退化導致黃河源區植物群落生物量顯著下降(P＜ 0.05) (表2)，植物群落均勻度指數則顯著上升(P＜ 0.05)，植物群落蓋度、豐富度和香濃維納多樣性指數并沒有發生顯著改變(P＞ 0.05)。

表2 草原退化對植物群落特征的影響Table 2 Effects of grassland degradation on plant community characteristics

在植物生長盛期，草原退化則顯著增加了土壤含水率(P＜ 0.05) (表3)，但是顯著降低了土壤有機質和硝態氮含量(P＜ 0.05)，對土壤容重、有機碳含量、全氮含量、全磷含量、速效磷含量以及銨態氮含量并沒有產生顯著影響(P＞ 0.05)。

表3 草原退化對土壤理化特征的影響Table 3 Effects of grassland degradation on soil physicochemical properties

2.2 草原退化對不同生長期土壤真菌群落組成的影響

從不同生長期的72 份土壤樣品中合計測得真菌序列11 920 871 條，單個樣品真菌序列數介于50 254～985 559，單個樣品的平均序列數為165 567 條。除去未鑒定種，不同生長期高寒草原土壤真菌群落優勢菌門均為子囊菌門(Ascomycota)和擔子菌門(Basidiomycota) (圖2)。

圖2 草原退化對不同生長期土壤真菌群落組成的影響Figure 2 Effects of grassland degradation on fungal community composition during different growth periods

在原生草原，植物生長季初期和盛期的子囊菌門相對豐度顯著高于生長季末期(P＜ 0.05) (圖2)，而生長季末期的擔子菌門、被孢霉門(Mortierellomycota)和壺菌門(Chytridiomycota)的相對豐度均顯著高于初期和盛期(P＜ 0.05)。在退化草原，植物生長季初期和盛期的子囊菌門相對豐度同樣顯著高于末期(P＜ 0.05)，其他菌門的變化并不明顯。

在生長季初期，草原退化導致子囊菌門的相對豐度顯著下降(P＜ 0.05) (圖2)。而在生長季盛期，草原退化導致子囊菌門和球囊菌門(Glomeromycota)的相對豐度顯著下降(P＜ 0.05)，對其余各菌門相對豐度的影響不顯著(P＞ 0.05)。在生長季末期，草原退化則顯著降低了子囊菌門和擔子菌門的相對豐度(P＜ 0.05)，對其余各菌門的相對豐度則沒有產生顯著影響(P＞ 0.05)。

2.3 草原退化對不同生長期土壤真菌群落多樣性的影響

在同一生長期內，原生草原和退化草原真菌群落多樣性差異不顯著(P＞ 0.05) (表4)，但是真菌群落多樣性均隨著植物生長而增加。具體表現為在原生草原和退化草原生長末期的香濃維納多樣性和OTU 豐度均顯著高于初期和盛期(P＜ 0.05)，而生長盛期和末期真菌群落Pielou 均勻度則顯著高于初期(P＜ 0.05)。

NMDS 分析(Stress = 0.19)和adonis 分析表明，在原生草原和退化草原，植物生長初期、盛期和末期下的土壤真菌群落結構分別存在顯著差異(P＜0.05) (圖3)。通過Bray-Curtis 距離對同一生長期不同退化程度的土壤真菌群落結構進行差異分析表明(表5)，在同一生長期內，草原退化均導致土壤真菌群落結構發生顯著改變(P＜ 0.05)。

表5 同一生長期不同退化程度的土壤真菌群落結構差異分析Table 5 Differential analysis of soil fungal community structure during different degrees of degradation in the same growth periods

圖3 草原退化對不同生長期土壤真菌群落結構的影響Figure 3 Effects of grassland degradation on fungal community structure during different growth periods

2.4 植物生長盛期土壤真菌群落構成的影響因素

基于最小赤池指數(akaike information criterion,AIC)篩選環境因子后建立的db-CCA 分析表明，在原生草原(AIC = 211.26，總解釋率66.55%)，植物群落生物量和均勻度是顯著影響不同生長期土壤真菌群落結構的主要環境因素(P＜ 0.05) (圖4a)；而在退化草原 (AIC = 111.11，總解釋率81.65%)，植物群落生物量和土壤有機質含量則是顯著影響不同生長期真菌群落結構的主要環境因素(P＜ 0.05) (圖4b)。

圖4 環境因素與土壤真菌群落結構間的CCA 分析Figure 4 CCA of fungal community structure and environmental factors

3 討論

3.1 不同生長期土壤真菌群落的變化

真菌是重要的土壤微生物類群，其群落組成通常決定了生態系統的資源利用效率及相關生態功能[28]。本研究中，不同生長期的原生和退化高寒草原優勢菌門均為子囊菌門和擔子菌門(圖2)，與青藏高原地區土壤真菌群落相關研究結果一致[10,29-30]。在高寒生態系統中子囊菌門和擔子菌門是最普遍的優勢真菌類群[31]，較強的耐寒能力可能是其在高寒地區占據優勢地位的主要原因。此外，植物生長季末期的子囊菌門相對豐度顯著低于生長季初期和盛期，而擔子菌門、被孢霉門和壺菌門的相對豐度均顯著高于初期和盛期(圖2)。高寒生境下植物和土壤微生物的生命活動均受到土壤養分含量的限制，為了緩解養分競爭壓力，植物和土壤微生物對養分的吸收存在季節性分化的特征[32]，即植物在春夏兩季吸收養分以維持其生長發育，而土壤微生物則主要在秋季和冬季早期儲存大量養分，并在次年春季受土壤凍融作用進行釋放，為生長初期的植物提供養分來源，這種養分的“脈沖式”釋放是高寒生態系統最大的養分輸入過程[33]。因此，主要的優勢菌門(子囊菌門)在植物生長末期相對豐度的下降，可能會影響土壤養分在非生長季來臨前的貯存，進一步使土壤更加貧瘠，加劇草原退化。

本研究得出季節變化對土壤真菌群落多樣性有著顯著的影響，土壤真菌群落多樣性均隨著植物生長而增加，特別是相較于植物生長盛期和末期，在植物生長初期溫度較低且有部分區域積雪覆蓋，植物生理代謝活動尚不強烈，而植物生長末期隨著根系以及枯落物的大量積累，微生物可利用養分增加，為真菌群落多樣性創造了良好的條件，這可能是導致土壤真菌群落多樣性初期較低、末期最高的主要原因[34]。

3.2 草原退化對土壤真菌群落的影響

草原退化在植物不同生長期均顯著降低了子囊菌門的相對豐度(P＜ 0.05)。相關研究證實，子囊菌門相對豐度與土壤氮、磷含量顯著相關[35]，而放牧和土壤硝態氮含量會顯著影響擔子菌門的相對豐度[32,36]。本研究中，雖然除硝態氮外，退化草原土壤氮、磷含量與原生草原差異不顯著，但整體上低于原生草原，且放牧和野生動物采食是導致黃河源地區草原退化的主要原因之一[20]。因此，放牧擾動和草原退化導致的土壤養分限制可能是引起植物生長盛期的子囊菌門和末期的子囊菌門、擔子菌門相對豐度下降的主要原因。

生物多樣性被認為是驅動生物群落生態過程和生態功能的重要因素[33,37]。本研究發現，在三江源高寒草原生態系統中，草原退化對土壤真菌群落的多樣性影響并不顯著，但整體上退化草原的真菌多樣性低于原生草原 (表4)。退化未導致真菌群落多樣性顯著改變的研究結果與Li 等[38]一致。生態系統為群落提供的生態位通常是決定群落生物多樣性的關鍵因素[10]。本研究中的退化草原樣地均處于輕中度退化階段，植物種類發生了明顯改變，但豐富度和多樣性變化不顯著；除土壤含水率、有機質和硝態氮含量外，土壤理化特征整體變化也不明顯，這些可能是真菌多樣性未產生顯著改變的原因。

3.3 土壤真菌群落的影響因素

探究退化草原真菌群落的影響因素，對于針對性制定合理的草原修復治理措施具有重要意義[38-39]。本研究中，在植物生長盛期，原生草原的植物群落生物量和均勻度對土壤真菌群落產生較大影響，而草原退化后植物生物量和土壤有機質對退化草原土壤真菌群落結構的影響更大。Xu 等[40]研究表明植物生物量在原生和退化草原均是顯著影響土壤真菌群落結構的主要因素，與本研究結果相似。此外研究表明退化草地中土壤養分有效性是土壤微生物群落變化的驅動因素[32,38,41]。草原退化導致了植被地上、地下生物量的下降，植物生物量則直接決定了微生物主要碳源的凋落物量，在底物相對匱乏的生境中可利用資源有效性對土壤真菌群落結構的影響可能更強[42-43]，特別是在退化草原土壤有機質含量對真菌群落的影響增強，也進一步強調了有機碳源對真菌群落結構的驅動作用。

4 結論

三江源區高寒草原土壤真菌群落優勢菌門為子囊菌門和擔子菌門，其中子囊菌門豐度在生長季初期達到最大，擔子菌門豐度在生長季末期達最大，且不同生長期草原退化對土壤真菌群落多樣性的影響不顯著，但顯著改變了真菌群落組成和結構。在原生草原植物群落生物量和均勻度顯著影響土壤真菌群落結構，而在退化草原，植物群落生物量和土壤有機質含量則是土壤真菌群落結構的主要影響因子。因此，通過建植栽培草地、添加有機肥等措施提升植物群落生產力，能夠緩解土壤真菌群落的養分限制，實現植被與土壤的同步治理，提升退化草原治理效率。