異紫草酸純化提取工藝及抗氧化活性研究

李瑞潔，何巧玉，張雙，4，田介峰，羅學軍，曠文靜，孫會睿，5，李瑞明，郝士海

（1.天士力醫藥集團股份有限公司創新中藥關鍵技術國家重點實驗室，天津 300410；2.現代中藥創制全國重點實驗室，天津 300410；3.中國藥科大學，江蘇 南京 211198；4.沈陽藥科大學，遼寧 沈陽 110016；5.天津中醫藥大學，天津 301617）

中藥丹參Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma是唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根和根莖，具有活血祛瘀，通經止痛，清心除煩，涼血消癰的功效[1]。注射用丹參多酚酸是天津天士力之驕藥業有限公司的獨家中藥保護品種，以丹參中水溶性酚酸類成分為有效成分，對缺血性腦損傷、心肌缺血損傷和糖尿病腎損傷等具有保護作用[2]。目前對于酚酸類化合物的分離，常采用大孔吸附樹脂柱[3-4]、超臨界流體萃取[5]、高速逆流色譜[6]、硅膠柱層析[7]、ODS 反向色譜[8]、制備型HPLC 等方法進行。而筆者團隊在此前對丹參多酚酸化學成分的研究中[9]建立了一套聯用反相色譜柱、凝膠柱以及制備液相的酚酸類化合物分離方法，并從中分離得到了異紫草酸，即4-（2-羧基乙烯基）-2-（3，4-二羥基苯基）-2，3-2H-7-羥基-3-苯駢呋喃羧酸-3-[1-羧基-2-（3，4-二羥基）乙基]酯，確定了其立體結構[10]。本實驗通過對比MCI-Gel/ LH-20 凝膠/ C18 鍵合填料柱層析法以及硅膠/ C18 鍵合硅膠柱層析法兩條異紫草酸分離路線的分離效果，意在得到一種操作簡便、分離純度高的異紫草酸分離方法，并進一步研究異紫草酸的藥理活性。

目前普遍認為異紫草酸是丹酚酸B 的降解或轉化產物[11-12]，而丹酚酸B 作為丹參中含量較高、抗氧化活性較強的已知成分，被稱為天然的抗氧化劑，現廣泛用于治療心腦血管疾病類藥物的研究中[13-14]。異紫草酸具有5 個游離酚羥基，具有提供氫質子的能力，從而可以阻斷自由基鏈式反應，即推測其具有清除自由基及抗氧化等作用。本實驗通過測定異紫草酸的·OH 和DPPH 清除能力以及還原能力，探究異紫草酸的體外抗氧化活性，為活性丹酚酸類天然抗氧化劑的深入研發提供科學依據。

1 實驗材料

Buchi 旋轉蒸發儀（瑞士 Buchi 公司）；梅特勒 XS205DU 電子天平（托利多儀器有限公司）；Waters UPLC 超高效液相色譜儀（美國 Waters 公司）；Agilent 1100 高效液相色譜儀（美國 Agilent 公司）；LC-80 軸向加壓制備色譜（法國 Novasep 公司）；Waters Acquity HSS T3（2.1×150 mm，1.8 μm）色譜柱（美國 Waters 公司）；Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 × 250 mm，5 μm）色譜柱（美國 Agilent 公司）；MCI-Gel 樹脂（日本三菱公司）；Sephadex LH20 凝膠（美國 GE 公司）；ODS 填料（日本 YMC 公司）；丹參多酚酸提取物（20131-101，天津天士力之驕藥業有限公司）；異紫草酸對照品（20150620，自制）；紫外分光光度計（美國 Agilent 公司）；乙腈（色譜純，德國Merck 公司）；甲酸、鄰二氮菲、鄰苯三酚、HCL（上海阿拉丁試劑公司）；DPPH、磷酸亞鐵、H2O2、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、Tris 緩沖鹽、三氯乙酸、三氯化鐵、鐵氰化鉀（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）；無水乙醇（分析純，天津市康科德科技有限公司）。

圖1 異紫草酸結構Fig.1 Structure of isolithospermic acid

2 實驗方法

2.1 兩種異紫草酸分離方法對比

兩種異紫草酸分離方法對比見圖2。

圖2 異紫草酸分離方法流程圖Fig.2 Flow chart of of Isolation of isolithospermic acid

2.1.1丹參多酚酸提取物指紋圖譜的測定

采用超高效液相色譜法（UPLC）測定丹參酚酸提取物指紋圖譜。色譜柱：Waters Acquity HSS T3（2.1 × 150 mm，1.8 μm）；流 速：0.4 mL·min-1；檢測波長：280 nm；柱溫：40 ℃；流動相A：0.1%甲酸水；流動相B：乙腈；梯度洗脫條件：0～ 6.4 min，93%～ 86% A；6.4～ 16.0 min，86%～ 84% A；16.0～ 22.0 min，84%～ 83% A；22.0～ 28.0 min，83%～ 82% A ；28.0～ 32.0 min，82%～ 78% A ；32.0～ 35.0 min，78%～ 20% A ；35.0～ 35.5 min，20%～ 93% A；35.5～ 40 min，93% A。

2.1.2MCI-Gel/ LH-20 凝膠/ C18 鍵合填料柱層析法用于高純度異紫草酸的分離

取丹參多酚酸提取物500 g，用1 000 mL 水溶解，上樣至MCI Gel 色譜柱中（10 cm×51 cm）。用10%乙醇水溶液洗脫，流速為100 mL·min-1。依照2.1.1項下色譜條件檢測收集液，與丹參多酚酸提取物指紋圖譜對照，合并含有異紫草酸的洗脫液。調節洗脫液pH 值至3.0，再次上樣至MCI Gel 色譜柱中。依次用水、95%乙醇洗脫，流速為100 mL·min-1，收集95%乙醇洗脫液，回收溶劑至干，得到異紫草酸富集物a。

將異紫草酸富集物a 用2 倍質量體積50%乙醇水溶液溶解，上樣至Sephadex LH-20 凝膠色譜柱中（3 cm×50 cm），用50% 乙醇洗脫，流速為10 mL·min-1。依照2.1.1 項下色譜條件檢測收集液，與丹參多酚酸提取物指紋圖譜對照，合并含有異紫草酸的洗脫液，回收溶劑至干得到異紫草酸粗品a。

將異紫草酸粗品a 用2 倍質量體積23%乙腈水溶液完全溶解，采用動態軸向加壓制備液相分離，以C18 鍵合硅膠為固定相，流動相為乙腈-水23∶77（0.01%甲酸），流速200 mL·min-1。依照2.1.1 項下色譜條件檢測收集液，與丹參多酚酸提取物指紋圖譜對照，合并含有異紫草酸的洗脫液。減壓濃縮后于60 ℃減壓干燥12 小時得到異紫草酸純品a。

2.1.3硅膠/ C18 鍵合硅膠柱層析法用于異紫草酸分 離

取丹參多酚酸提取物50 g，溶于200 mL 水中，用等體積的乙酸乙酯萃取3 次，收集乙酸乙酯萃取液，減壓回收溶劑，將樣品與80 g 100～ 200 目硅膠進行拌樣。干法上樣至裝好的硅膠柱中，用乙酸乙酯-石油醚1∶1（2%甲酸）洗脫，每0.2 倍柱體積為單位收集一個餾分。將各個餾分與異紫草酸對照品點于同一薄層板上，用5%硫酸乙醇為顯色劑進行顯色。將與異紫草酸對照品斑點Rf 值一致的餾分合并，減壓濃縮至干，得到中間體b。

將中間體b 用2 倍質量體積23%乙腈水溶液完全溶解，采用動態軸向加壓制備液相分離，以C18鍵合硅膠為固定相，流動相為乙腈-水23∶77（0.01%甲酸），流速200 mL·min-1，收集合并含有異紫草酸的洗脫液，減壓濃縮后于60 ℃減壓干燥12 小時得到分離產物b。

2.1.4MCI-Gel/ LH-20 凝膠/ C18 鍵合填料柱層析法分離樣品含量測定

2.1.4.1色譜條件

采用超高效液相色譜法（UPLC）進行測定。色譜柱：Waters Acquity HSS T3（2.1×150 mm，1.8 μm）；流 速：0.4 mL·min-1；檢測長：280 nm；柱溫：40 ℃；流動相A：0.02%磷酸水；流動相B：80% 乙腈-20% 0.02% 磷酸水；梯度洗脫條件：0～ 1.6 min，91%～ 78% A；1.6～ 1.8 min，78%～ 74% A；1.8～ 8.0 min，74%～ 61%A；8.0～ 8.4 min，61%～ 91% A；8.4～ 10.0 min，91% A。

2.1.4.2供試品溶液的制備

稱取異紫草酸富集物a 30 mg，異紫草酸粗品a 20 mg，異紫草酸純品a 10 mg，分別置于25 mL 容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度。

2.1.4.3測定

精密吸取上述供試品溶液各2 μL，按2.1.4.1 方法進行測定，記錄異紫草酸歸一化法百分含量。

2.1.5硅膠/ C18 鍵合硅膠柱層析法分離樣品液相檢 測

2.1.5.1色譜條件

采用高效液相色譜法（HPLC）進行測定。色譜 柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6×250 mm，5 μm）；流速：1 mL·min-1；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃；流動相A：0.02%磷酸水；流動相B：80%乙腈-20% 0.02%磷酸水；梯度洗脫條件：0～ 8 min，90%～ 78% A；8～ 15 min，78%～ 74% A；15～ 35 min，74%～ 61% A；61～ 40 min，61%～ 90% A；40～ 50 min，90% A。

2.1.5.2供試品溶液的制備

稱取分離產物b 10 mg，置于25 mL 容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度。

2.1.5.3測定

吸取上述供試品10 μL，按照2.1.5.1 項下條件進行測定。

2.2 異紫草酸體外抗氧化實驗

2.2.1異紫草酸對·OH 的清除能力

采用Fenton 法，參照文獻 [15]方法，分別配制質量濃度為0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 mg·mL-1的異紫草酸樣品進行實驗，測定吸光度A。樣品對·OH清除率I的計算公式為I%=[（A加樣-A損傷）/（A未損傷-A損傷）]×100%

2.2.2異紫草酸清除DPPH 能力的測定

采用比色法測定異紫草酸清除DPPH 能力，參照文獻 [15]方法，分別配制質量濃度為0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg·mL-1的樣品溶液。樣品對DPPH 的清除率I%=[1-（A樣品-A對照）/A空白]×100%

2.2.3異紫草酸還原能力的測定

采用鐵氰化鉀還原試驗，參照文獻 [15]方法，分別配制質量濃度為0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 mg·mL-1的樣品溶液。每份樣品平行3 份，參照為蒸餾水，在700 nm 波長處測定吸光度A。

3 實驗結果

3.1 丹參多酚酸指紋圖譜

丹參多酚酸指紋圖譜檢測結果見圖3，如圖所示，異紫草酸含量較低，常規分離方法很難得到高純度單 體。

圖3 丹參酚酸指紋圖譜Fig.3 Fingerprint of salvia polyphenolic acids

3.2 MCI-Gel/ LH-20 凝膠/ C18 鍵合填料柱層析法樣品含量測定

異紫草酸富集物a、異紫草酸粗品a 和異紫草酸純品a 歸一化法百分含量分別為42.3%、92.6%和98.7%，詳見圖4，該方法分離得到的異紫草酸單體純度高。

圖4 異紫草酸富集物a（A）、粗品a（B）、純品a（C）UPLC 檢測圖Fig.4 UPLC detection diagram of isolithospermic acid enrichment a（A），isolithospermic acid crude product a（B）and isolithospermic acid a（C）

3.3 硅膠/ C18 鍵合填料柱層析法樣品的檢測

根據圖5 結果，采用硅膠/ C18 鍵合填料柱層析法無法將異紫草酸與丹酚酸D 分離，未能得到異紫草酸純品，并且在分離后濃縮過程中很容易出現一個未知的化合物。

圖5 硅膠/ C18 鍵合填料柱層析法分離產物b 液相檢測圖Fig.5 HPLC detection diagram of product b which separated by silica gel/C18 bonded packing column chromatography

3.4 異紫草酸體外抗氧化實驗

在實驗測定范圍內，異紫草酸對·OH 及DPPH均具有清除作用，半數清除率濃度（IC50）分別為0.277 mg·mL-1和17.43 μg·mL-1。異紫草酸的還原能力呈現出良好的量-效關系，即隨著濃度的增加，還原能力也逐漸增加，詳見圖6。

圖6 異紫草酸·OH（A）清除率、DPPH（B）清除率及總還原能力（C）Fig.6 The ·OH clearance curve（A），DPPH clearance curve（B）and reducing power（C）of Isolithospermic acid

4 討論

異紫草酸在丹參多酚酸提取物中的含量很低，且極性與丹酚酸D 非常接近，該化合物含有多個酚羥基，呈弱酸性，易被氧化分解，從丹參酚酸提取物中分離得到純度較高的異紫草酸難度很大?，F有異紫草酸分離方法[16]工藝復雜、用到多種有機試劑，并且對高壓分離設備的依賴性高，制備周期長，成本高。而借鑒常規硅膠柱層析分離方法從丹參酚酸提取物中分離異紫草酸時，丹酚酸D 極易轉化成另一種未知化合物，混入異紫草酸的餾分中，無法達到良好的分離效果，且該方法分離周期長，使用的有機溶劑多，對操作人員的安全帶來隱患。本研究中的高純度異紫草酸分離方法，利用丹酚酸D 和異紫草酸分子量差異，先采用凝膠柱將丹酚酸D 去除，再用C18 鍵合硅膠柱分離得到高純度異紫草酸，其含量大于98.5%。該方法操作簡便、安全性較強，解決了丹參多酚酸中低含量成分異紫草酸分離困難的問題，是一種快速安全高效的異紫草酸分離方法，也為其余丹參多酚酸提取物分離純化提供借鑒參考。

體外抗氧化活性實驗結果表明，異紫草酸具有清除自由基及抗氧化活性。大量研究表明[17-18]，氧自由基與心血管疾病的發生、發展有著密切關系，丹參的抗氧化作用可能是其在治療心血管疾病效果顯著的原因之一。因此異紫草酸可用于治療心腦血管疾病藥物的開發中，為活性丹酚酸類天然抗氧化劑的深入研發提供科學依據。