克氏原螯蝦蝦青蛋白A2 基因克隆、組織分布及原核表達

陳 浩， 吉宏武*， 張 迪， 劉書成，宋文奎， 郝記明

（1. 廣東海洋大學食品科技學院， 廣東 湛江 524008；2. 廣東省水產品加工與安全重點實驗室， 廣東 湛江 524008；3. 廣東省海洋生物制品工程實驗室，廣東 湛江 524008；4. 廣東省海洋食品工程技術研究中心，廣東 湛江 524008；5. 水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東 湛江 524008）

蝦青蛋白（crustacyanin，CR）是甲殼動物中特有的一種載脂蛋白，屬于脂鈣蛋白（lipocalin）家族，常與蝦青素特異性結合， 從而為甲殼等組織提供顏色。 Wade 等人研究發現，當提高飼料中類胡蘿卜素的水平并養殖于黑色底質， 斑節對蝦（Penaeus monodon）表皮中的蝦青蛋白含量顯著增加，體色隨之變得更藍更黑[1]。 而Budd 等人采用RNA 干擾技術沉默蝦青蛋白基因，斑節對蝦體色由藍色轉變為紅色[2]；顯微結果顯示，實驗蝦表皮上只有紅色的蝦青素顆粒，卻未見有藍色的蛋白質顆粒。Gao 等人采用類似方法干擾脊尾白蝦蝦青蛋白的表達，其體色也發生了較大的改變[3]。 由此可見，蝦青蛋白在提供甲殼水產品體表顏色以及參與色澤調控等方面發揮著重要作用。

蝦青蛋白存在多種類型的亞基，依據相對分子質量、氨基酸組成和序列等性質的不同，主要分為CR-A 亞型（包含A2 和A3） 和CR-C 亞型（包含A1、C1 和C2）。目前，從不同甲殼動物體表結構中純化的天然蝦青蛋白，均是由CR-A 或CR-C 亞型的一種或多種組合而成的多聚體，呈現藍色、黃色等多種顏色，如來自歐洲龍蝦（Homarus gammarus）甲殼的β-蝦青蛋白呈現紫色，由A1 和A3 亞基組成[4]。近年來，天然蝦青蛋白多聚體的呈色機制越來越受到學者的關注，研究者運用晶體學、量子力學等方法對天然蝦青蛋白多聚體結構進行了剖析，陸續提出了極化作用、共平面效應、激子耦合、烯醇化等理論[5-8]。 但是，蝦青素與蝦青蛋白亞基之間相互作用引起復合物光譜紅移的機制仍無定論。 為此，Chayen 等將蝦青蛋白多聚體脫去蝦青素，純化后得到單一的亞基并研究該亞基與蝦青素的相互作用，取得了較好的效果[9]。 但是該方法純化難度較大，耗時費力。 因此，快速簡便制備蝦青蛋白亞基能夠為蝦青蛋白呈色機制研究奠定良好基礎。 作為一種成熟的表達系統，大腸桿菌早已廣泛應用于藻藍蛋白等其他色素結合蛋白質的研究中[10-11]。 大腸桿菌表達系統制備重組蛋白質，具有操作簡便、經濟快捷、純度較高等優點。 然而，蝦青蛋白亞基異源重組表達的報道很少，關于克氏原螯蝦蝦青蛋白亞基的表達至今未有人研究。 因此，以大腸桿菌為表達宿主，研究克氏原螯蝦蝦青蛋白亞基異源重組表達具有重要意義。

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），屬甲殼綱、十足目、鰲蝦科，原產于北美洲，現已廣泛養殖于長江中下游水域。 近年來，因其色澤紅亮、味道鮮美而廣受消費者的追捧。2020 年總產量已達240 萬t，約占我國甲殼類水產品總養殖產量的56.2%[12]。 目前，克氏原螯蝦相關研究多集中在養殖模式、食品安全監測、病毒與免疫等方面，而色澤與蝦青蛋白相關研究較少[13-15]。 作者所在課題組前期從克氏原螯蝦甲殼中純化得到一個藍色的蝦青素蛋白多聚體，亞基相對分子質量為21000（命名為PcCRA2），經質譜鑒定以及氨基酸比對分析推測該亞基屬于蝦青蛋白家族。 迄今，關于PcCRA2 編碼基因、組織分布以及異源表達還未有研究報道。 作者通過基因克隆獲得PcCRA2 基因（命名為cra2）的DNA 和cDNA序列，采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）分析cra2基因在不同組織的表達特征，構建原核表達載體并在大腸桿菌中進行重組表達，為進一步研究蝦青蛋白呈色機制及蝦類色澤調控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

克氏原螯蝦： 購自潛江市楚淼水產品有限公司，平均體長（11±1） cm，平均體質量（32±4） g，實驗前暫養1 d。 隨機挑取6 只健康的克氏原螯蝦進行解剖，分別取表皮、肌肉、心臟、血淋巴、胃、肝胰腺、腸道、神經、眼柄等9 種組織用液氮速凍后，置于-80 ℃保存待用。

1.2 菌種和質粒

大腸桿菌表達菌株BL21（DE3）、大腸桿菌感受態Top10、質粒pET28a（+）、pMD19-T 載體：安徽通用生物系統有限公司。

1.3 主要試劑

Ezup 柱式DNA 抽提試劑盒、 柱式Trizol 總RNA 抽提試劑盒、柱式DNA 膠回收試劑盒、T-載體PCR 產物克隆試劑盒： 上海生工生物工程有限公司；HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit、AceQ qPCR SYBR Green Master Mix： 南京諾唯贊生物科技股份有限公司；LB 肉湯、LB 瓊脂： 北京陸橋技術股份有限公司；鎳-次氮基三乙酸（Ni-NTA）瓊脂糖凝膠：德國Qiagen 公司；限制性內切酶Xho I 和Nco I、T4 DNA 連接酶：寶日醫生物技術（北京）有限公司；SDS-PAGE 凝膠快速配制試劑盒、 蛋白質相對分子質量標準： 上海碧云天生物技術有限公司；蝦青素（ATX）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；卡那霉素 （Kan）、 異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）、曲拉通（Triton X-100）、尿素（Urea）、咪唑：北京索萊寶科技有限公司。

1.4 主要儀器

GeneAmp 9700 基因擴增儀： 美國Applied Biosystems 公司；CFX96 實時熒光定量PCR 儀、GelDoc XR+凝膠成像系統： 美國Bio-Rad 公司；Cary 60 紫外可見分光光度計： 美國Agilent 公司；JY92-2D 超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；SW-CJ-2FD 超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；HZQ-X100 全溫振蕩培養箱：蘇州市培英實驗設備有限公司。

1.5 克氏原螯蝦cra2 基因克隆

使用Ezup 柱式DNA 抽提試劑盒提取克氏原螯蝦肌肉的基因組總DNA。根據美國國家生物信息中心數據庫 （NCBI） 公布的紅螯螯蝦蝦青蛋白A（GenBank：ALC79588.1）和凡納濱對蝦蝦青蛋白A2（GenBank：XP_027238673.1） 高度保守氨基酸序列MFTT（L/V）（V/I）AA 和TAECVYRA，設計一對簡并引物A2-Fw 和A2-Rev 用于PCR 擴增，見表1。 以克氏原螯蝦基因組總DNA 為模板進行PCR 擴增，然后將PCR 擴增產物純化回收后與克隆載體pMD19-T 進行連接反應，得到的反應產物轉化至大腸桿菌Top10。 通過菌液PCR 驗證獲得陽性轉化子， 提取陽性轉化子質粒進行酶切和測序驗證，最終獲得cra2 基因的DNA 序列。

表1 實驗中所用引物序列Table 1 Primers used in experiments

根據已獲得的cra2 基因DNA 序列設計一對引物CA2-Fw 和CA2-Rev 用于cra2 基因cDNA 克隆。使用柱式Trizol 總RNA 抽提試劑盒提取克氏原螯蝦肌肉總RNA， 通過HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒進行反轉錄， 以反轉錄的產物為模板， 以引物CA2-Fw 和CA2-Rev 進行PCR 擴增。 擴增產物的回收、連接以及篩選驗證均和cra2基因DNA 序列實驗過程一致， 最終獲得cra2 基因cDNA 序列。

1.6 基因序列分析

用軟件DNAMAN 6.0 查找開放閱讀框（ORF），并推導出氨基酸序列。 通過NCBI BLASTp 進行同源比對， 并下載其他蝦種蝦青蛋白的氨基酸序列，用DNAMAN 6.0 進行氨基酸序列多重對比， 并用MEGA 6.0 構建系統進化樹。 用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）預測蛋白質理化性質；用SignalP 4.0 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/）分析信號肽；用Tmpred program（https：//www.expasy.org/resources/tmpred） 分析跨膜區；用ScanProsite（http：//prosite.expasy.org/）搜索蛋白質功能結構域；用CDD Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）進行保守結構域預測。

1.7 克氏原螯蝦不同組織cra2 基因表達分析

按照柱式Trizol 總RNA 抽提試劑盒分別提取克氏原螯蝦9 種組織的總RNA，采用1.0 g/dL 瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA 質量和完整性。 分別以9種組織總RNA 為模板， 使用HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒反轉錄合成cDNA 第一鏈，-20 ℃保存。根據已獲得的cra2 基因cDNA 序列設計引物CRA-F 和CRA-R，同時以克氏原螯蝦βactin 基因序列（GenBank：D14612.1）為內參設計引物ACT-F 和ACT-R。 以獲得的cDNA 為模板，通過RT-qPCR 測定cra2 基因在9 種組織中的表達情況。 RT-qPCR 反應體系10 μL：cDNA 2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2×AceQ qPCR SYBR Green Mix 5 μL，ddH2O 2 μL。 擴增程序：95 ℃5 min；95 ℃10 s，60 ℃35 s， 進行40 個循環；95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃30 s，95 ℃15 s。 每個樣品重復3 次。 根據熒光定量數據，采用2-ΔΔCt法計算各組織中cra2 基因的相對表達量， 結果表示為平均值±標準差。 采用SPSS 20.0 進行單因素方差分析和Duncan 多重比較分析，P＜0.05 表示差異顯著。

1.8 PcCRA2 原核重組表達

1.8.1 表達載體的構建與轉化 用在線軟件JAVA Condon Adaption Tool（https：//www.jcat.de/）將克氏原螯蝦cra2 基因cDNA 序列按照大腸桿菌密碼子偏好性進行優化。 優化后的基因序列由安徽通用生物系統有限公司合成，合成過程中額外添加了限制性內切酶Xho I 和Nco I 的酶切位點和6×His 標簽。合成好的基因和pET28a 載體分別用Xho I 和Nco I進行雙酶切，并將酶切產物分別純化回收后進行連接反應。將連接產物轉化至大腸桿菌Top10，經菌液PCR 鑒定后，選取陽性克隆單菌落質粒進行雙酶切和測序驗證。 最后將驗證正確的質粒轉化至表達菌株E. coli BL21（DE3）中。

1.8.2 重組PcCRA2 誘導表達條件優化 將構建成功的重組菌E. coli BL21 （DE3） 劃線于含Kan（100 mg/L）的LB 固體平板上，挑取單菌落，接種于4 mL 含Kan（100 mg/L）的LB 液體培養基中，37 ℃、200 r/min 振蕩培養12 h（OD600約為1.0），然后按體積比1∶100 接種于4 mL 含Kan（100 mg/L）的LB 液體培養基中。

1）最佳IPTG 誘導終濃度的確定 接種后培養3 h， 加入IPTG 并使其終濃度分別為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L，37 ℃、200 r/min 振蕩誘導4 h。

2）最佳誘導起始點的確定 分別向接種后培養2、3、4、5、6 h 的菌液中加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，37 ℃、200 r/min 振蕩誘導4 h。

3）最佳誘導溫度的確定。 向接種后培養4 h 的菌液加入終濃度為0.5 mmol/L 的IPTG，分別在16、23、30、37、44 ℃的條件下200 r/min 振蕩誘導4 h。

4）最佳誘導時長的確定 向接種后培養4 h 的菌液加入終濃度為0.5 mmol/L 的IPTG，30 ℃、200 r/min 下分別誘導2、4、6、8、10 h。 分別取出1 mL菌液，經4 ℃、5000 g 離心3 min，收集菌體，超聲（300 W 超聲10 s，間隔15 s，共30 次）處理后，進行SDS-PAGE 電泳分析，并使用設備自帶軟件分析電泳條帶灰度來確定目標蛋白質表達量。

1.8.3 重組蛋白的分離與純化 按最優條件擴大至1 L 培養。 所得菌體按1 g∶50 mL 用包涵體洗滌液（2 mol/L Urea，體積分數1%的Triton X-100，50 mmol/L 的pH 7.4 PBS）洗滌2 次，4 ℃、5000 g 離心3 min。 所得沉淀按1 g∶10 mL 加入變性液（8 mol/L Urea，50 mmol/L 的pH 7.4 的PBS） 于4 ℃攪拌溶解。按說明書使用Ni-NTA 柱進行親和層析純化，8 mol/L 尿素—不同濃度咪唑（10、20、50、100、200 mmol/L）溶液由低至高進行梯度洗脫，分別收集洗脫液，進行SDS-PAGE 電泳檢測。 收集符合要求的洗脫液，使用尿素梯度（6、4、2、0 mol/L）透析復性，超濾濃縮，得到重組PcCRA2。

1.8.4 重組PcCRA2 與蝦青素特異性結合 參照PAN 等[16]的方法，稍作調整。 將40 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0）、0.2 mol/L 硫酸銨溶液和12 mmol/L 蝦青素丙酮溶液等體積混合，加入重組PcCRA2 并使其終濃度為5 mmol/L，混合均勻，裝入透析袋置于20 mmol/L PBS 溶液中，4 ℃過夜。 超濾除去游離蝦青素后，測定其在220～800 nm 的紫外可見光譜。

2 結果與分析

2.1 cra2 基因的克隆及序列分析

DNA 和cDNA 擴增結果見圖1。 電泳檢測分別在750～1000 bp 和500～750 bp 處有單一條帶。 通過測序分別獲得cra2 基因DNA 序列和cDNA 序列。 將cra2 基因DNA 序列和cDNA 序列分別提交至NCBI 數據庫， 序列登錄號分別為MW727506 和MW727507。

圖1 克氏原螯蝦cra2 基因的擴增圖譜Fig. 1 Amplification of the cra2 gene from P. clarkii

cra2 基因cDNA 序列全長為573 bp， 共編碼190 個氨基酸，見圖2。 由ProtParam 預測分析可知，PcCRA2 蛋白分子式為C960H1433N237O286S9， 相對分子質量為21158.9，理論等電點為5.59，屬酸性蛋白質。不穩定系數39.29，推測該蛋白質為穩定蛋白質。 脂肪系數為66.74，平均親水性系數-0.162，說明該蛋白質為親水蛋白質。 SignalP4.0 和SMART 分析顯示，PcCRA2 蛋白為分泌蛋白， 信號肽序列為1～16 氨基酸，ARM 保守結構域 （lipocalin） 為43～184。 通過Tmpred蛋白質跨膜區分析發現，PcCRA2 蛋白存在2個由內向外的跨膜區（第1～19、102～122 氨基酸位）和1 個由外向內的跨膜區 （第1～19 氨基酸位）。ScanProsite 分析結果顯示，PcCRA2 蛋白存在1 個肌鈣蛋白標記（lipocalinsignature），位于36～49 氨基酸處。

圖2 克氏原螯蝦cra2 基因cDNA 序列及推導的氨基酸序列Fig. 2 Nucleotide and deduced amino acids sequences of cra2 gene from P. clarkii

2.2 氨基酸同源性比較及系統發育分析

BLAST 比對結果表明，克氏原螯蝦PcCRA2 與NCBI 公布的其他100 種蝦類蝦青蛋白氨基酸序列的相似性在57.89%～91.58%。 其中，與紅螯螯蝦蝦青蛋白A（Cherax quadricarinatus，ALC79588.1）的相似度最高，達91.58%；與歐洲龍蝦蝦青蛋白A2（H.gammarus，P80007.1）、 美洲龍蝦蝦青蛋白A2（Homarus americanus，XP_042227234.1）和天鵝龍蝦（Panulirus cygnus，ACL37112.1） 相似度分別達到87.93%、87.37%和73.68%。 多重比較氨基酸序列發現，克氏原螯蝦與其他9 種蝦的蝦青蛋白均具有脂鈣蛋白（lipocalin）家族典型區域SCR-1（G-X-W，X代表不同的氨基酸）、SCR-2 （T-D-Y） 和SCR-3（R）， 而且這些區域在不同物種間具有高度保守性，見圖3。

利用MEGA5.0 軟件進行系統進化分析， 結果顯示，克氏原螯蝦與紅螯螯蝦先聚在一起，再與歐洲龍蝦、美洲龍蝦、天鵝龍蝦聚為一大支，而同屬對蝦科的日本對蝦、凡納濱對蝦、寬溝對蝦、刀額新對蝦、斑節對蝦聚為另一大支，見圖4。此外，遺傳距離分析結果表明，克氏原螯蝦與紅螯螯蝦具有最近的親緣關系。

圖4 蝦青蛋白系統進化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of crustacyanin

2.3 cra2 基因組織表達分布

運用RT-qPCR 檢測cra2 在克氏原螯蝦9 種組織中的表達水平見圖5。 cra2 mRNA 在各組織中均有表達，其中在表皮中的相對表達量顯著高于其他組織（P＜0.05），其次是腸道、肝胰腺，而肌肉中的表達量最低。

圖5 克氏原螯蝦cra2 基因mRNA 在不同組織中表達水平Fig. 5 Expression level of cra2mRNA in different tissues of P. clarkii

2.4 PcCRA2 原核重組表達

2.4.1 原核表達載體的構建與轉化 根據大腸桿菌密碼子偏好性， 優化了克氏原螯蝦cra2 基因cDNA 序列。 GC 比例由優化前的54%減少至46%，密碼子適應指數（codon adaptation index）由0.69 提高至0.94，與理想值1.0 更為接近，有利于目標基因高效表達[17]。 經雙酶切和測序驗證，表達載體pET28a-cra2 未發現移碼、堿基突變等情況，與預期目標基因一致，表明cra2 基因cDNA 序列成功插入表達載體pET28a 中。

2.4.2 重組蛋白誘導表達條件的優化 如圖6（a）所示，除了對照組（未誘導），不同終濃度的IPTG 誘導下目標蛋白質均有表達（22000），但表達量不同。當IPTG 終濃度為0.1 mmol/L 時， 目標蛋白質表達量為18.9%；IPTG 繼續增加濃度至0.5、1.0 mmol/L，目標表達量均明顯增加，但是相差不大；當IPTG 濃度增至1.5、2.0 mmol/L 時， 目標蛋白質表達反而減少。 綜合考慮目標蛋白質表達量和成本， 選擇0.5 mmol/L 為最佳IPTG 誘導終濃度。

如圖6（b）所示，接種后4 h 時開始誘導，目標蛋白質表達量最高，約占菌體總蛋白質的31.3%。接種后生長2 h 和6 h，目標蛋白質占菌體總蛋白質比例均不高。 因此，選擇接種生長4 h 為最佳誘導起始點。

如圖6（c）所示，隨著溫度的升高，目標蛋白質表達量先升高后降低，30 ℃時達到最大。 當16 ℃和23 ℃誘導時，目標蛋白質電泳條帶在22000 處，顏色較淺，但在菌體總蛋白質中的比例分別為23.5%，25.6%。 當誘導溫度升高至44 ℃，目標蛋白質表達量降低。 因此，選擇30 ℃為最佳誘導溫度。

如圖6（d）所示，誘導時長在2～6 h 時，目的蛋白質表達量隨誘導時間而逐漸增加；超過6 h 時，目標蛋白質表達逐漸降低。 因此，選擇6 h 為最佳誘導時長。

誘導最佳條件為： 接種4 h 后加入0.5 mmol/L的IPTG，于30 ℃誘導6 h。

2.4.3 重組PcCRA2 與蝦青素特異性結合 重組PcCRA2 的Tris-HCl 溶液在270 nm 處出現單峰，見圖7。 蝦青素的丙酮溶液在474 nm 處有最大吸收峰。 超濾除去游離蝦青素后，重組PcCRA2 與蝦青素反應溶液在265 nm 和505 nm 處均出現最大吸收峰， 說明重組PcCRA2 與蝦青素發生特異性結合。 相比游離蝦青素，可見光區最大吸收峰發生了紅移，從474 nm 移至520 nm 處。

圖7 重組PcCRA2 與蝦青素特異性結合的UV-vis 圖Fig. 7 UV-vis spectra of the specific binding of recombinant PcCRA2 to astaxanthin

2.5 討論

通過同源克隆獲得了克氏原螯蝦cra2 基因的DNA 和cDNA 序列， 并通過cDNA 序列獲得PcCRA2 氨基酸序列。 PcCRA2 氨基酸序列中含16個氨基酸（N 端） 的信號肽和174 個氨基酸的成熟肽，其中43～184 氨基酸位為lipocalin 保守結構域，而且具有脂鈣蛋白家族3 個典型區域SCR-1 （GX-W）、SCR-2（T-D-Y）和SCR-3（R），表明PcCRA2屬于脂鈣蛋白家族。 這些典型區域在不同物種蝦青蛋白中高度保守，說明蝦青蛋白該區域在進化上相對保守，這可能與蝦青蛋白均具有β-桶形空間結構有關[2]。 另外，通過基因和氨基酸序列比對，可以確定PcCRA2 屬于蝦青蛋白A2 亞基。 迄今為止，在甲殼動物中只發現了2 個編碼蝦青蛋白的基因：cra和crc 基因， 它們同時或單獨存在于同一物種中表達CR-A 亞型或CR-C 亞型蝦青蛋白[18]。而且，同一亞型蝦青蛋白可能在翻譯后發生酰胺化或糖基化等修飾，從而導致它們的結構、性質等存在差異[19]。由此，克氏原螯蝦cra2 基因屬于cra 基因，但是克氏原螯蝦中是否還存在crc 基因有待進一步研究。系統進化樹顯示，PcCRA2 與紅螯螯蝦、 歐洲龍蝦、美洲龍蝦等聚為一支，說明其與鰲蝦科蝦類有血緣關系，而與對蝦科蝦類有明顯區分。

克氏原螯蝦cra2 基因的表達具有組織特異性，在表皮中表達量最高。 Tlysty 等人認為蝦青素主要在表皮中與蝦青蛋白特異性結合形成結合蛋白質，而后轉移至甲殼中繼續修飾成不同顏色的多聚體[20]。在羅氏沼蝦中，crc 基因在表皮中的表達量高于其他組織，且在蛻殼期間比其他生長階段表達高[21]。干擾該基因后，其在表皮中的表達量明顯減少，此時蝦的體色轉變成紅色。 另外，李清清等人發現cra1基因在中華絨螯蟹表皮中表達相對較高，而crc1 基因和crc2 基因卻在肝胰腺和卵巢中表達更高[22]。 他認為前者可能主要參與蟹的色澤調控，后者更多地參與卵巢色澤形成和發育。 由此，克氏原螯蝦cra2基因可能主要參與其體色的形成以及色澤的調控，但是具體調控機制有待后續研究。

原核系統具有基因修飾簡便、 生產周期較短、成本較低等優點，因而在各種蛋白質表達研究中被廣泛使用。為獲得大量重組PcCRA2，作者采用大腸桿菌原核表達系統， 并使用目前調控T7 啟動子效果最優的乳糖類似物IPTG 作為誘導劑。 考慮到表達元件和外界環境均能影響原核表達效果，對誘導劑終濃度、誘導起始點、誘導溫度和誘導時間等條件進行了優化。結果表明，IPTG 終濃度為0.5 mmol/L和1.0 mmol/L 時目標蛋白質表達效果較好。 尼羅羅非魚Galectin-4 基因的原核表達條件優化結果顯示，IPTG 濃度在0.4 mmol/L 表達量最大， 而在0.4～1.0 mmol/L 內沒有明顯增加， 與本研究結果相似[23]。 當IPTG 濃度超過1.0 mmol/L 時，目標蛋白質的表達量下降，這可能是IPTG 具有潛在毒性，過量會抑制菌體生長和蛋白質表達[24]。以接種后生長4 h作為起始誘導點，重組PcCRA2 表達量最大，此時重組菌處于對數期。 誘導處于生長遲緩期和穩定期的菌體均不利于目標蛋白質的表達和積累[25]。 在30 ℃誘導時，目標蛋白質表達效果最好。溫度過低，重組菌生長緩慢，菌體密度不高；溫度過高，重組菌加速增殖，不利于蛋白質的表達，而且容易使目標蛋白質形成包涵體，增加了后續純化的難度[26]。誘導6 h 時，重組PcCRA2 表達量達到最大，這與哈維氏弧菌PspF 基因的異源表達條件優化結果一致[27]。

由于大腸桿菌系統表達的蛋白質主要以包涵體形式存在，容易在生成過程中出現未折疊或錯誤折疊等情況而使重組蛋白質喪失活性，純化時需要增加復性操作[28]。 本研究獲得的目標蛋白質包涵體占78.2%， 故采用尿素濃度梯度透析法對其進行了復性。 復性后的純化重組PcCRA2 能與蝦青蛋白特異性結合， 在265 nm 和505 nm 處出現最大吸收峰。 而Ferrari 等人制備的重組美洲龍蝦蝦青蛋白H2 與蝦青素結合后，不僅在580 nm 處出現最大吸收峰，還在520 nm 處有肩峰[29]。 此外，重組PcCRA2與蝦青素結合率（A505/A265）為0.38，略高于Ferrari 等的實驗結果。 雖然結合效率不高，但是為后續研究蝦青蛋白亞基與蝦青素的相互作用提供可能。

3 結語

采用同源克隆獲得了克氏原螯蝦cra2 基因的DNA 和cDNA 序列，RT-qPCR 發現該基因在克氏原螯蝦9 種組織中均有表達， 其中表皮表達量最高。 構建了表達載體pET28a-cra2， 并獲得重組PcCRA2，證實了該蛋白質能與蝦青素特異性結合。本研究結果可為獲取重組蝦青蛋白亞基、探究其生物功能提供參考。