三孢布拉霉CrgA 泛素連接酶功能的初步探究

楊佳敏， 楊培龍， 曲音波， 余曉斌， 羅 瑋*

（1. 江南大學生物工程學院，江蘇 無錫 21422；2. 農業農村部飼料生物技術重點實驗室，北京 10008；3. 中國農業科學院飼料研究所，北京 10008；4. 山東大學微生物技術國家重點實驗室，山東 青島 266237）

類胡蘿卜素作為一種天然色素， 在抗衰老、抗腫瘤、增強免疫功能等方面均能發揮重要功效。 利用微生物發酵生產β-類胡蘿卜素是較為經濟、安全的生產方法，而三孢布拉霉（Blakeslea trispora）具有生物量大、產量高、生長迅速、不受環境影響等諸多優勢，是工業上大規模生產β-類胡蘿卜的理想菌株[1]。

CrgA 起初是在卷枝毛霉中發現的，是一種在類胡蘿卜素生物合成的光誘導途徑中發揮重要作用的負調節因子[2]。 在藤倉鐮孢（Fusarium fujikuroi）[3]、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）[4]、三孢布拉霉[5]和布拉克須霉（Phycomyces blakesleeanus）[6]中也都鑒定到了同源基因。在卷枝毛霉中crgA基因的表達是由光脈沖活化的，且其進程均與類胡蘿卜素合成的結構基因相似。在卷枝毛霉中敲除crgA基因會導致在黑暗中類胡蘿卜素的大量積累，參與類胡蘿卜素合成的結構基因carB基因和carRP基因在黑暗和光照條件下均被活化表達[7]，表明CrgA 可能作為一種與carB和carRP基因合成有關的負調控因子參與類胡蘿卜素的合成。 McCrgA 和BtCrgA 都含有2個環指結構域和不完整的LON 結構域，見圖1。 環指結構域的存在顯示其具有泛素連接酶活性。 Silva等的研究顯示，McCrgA 參與MCWC-1b 的非降解型的單泛素化和雙泛素化修飾，導致MCWC-1b 失活但并不降解， 在黑暗中CrgA 則通過單泛素化和雙泛素化MCWC-1b 使其失活[8]，影響了調控因子進而抑制類胡蘿卜素的合成。

圖1 McCrgA 及BtCrgA 結構示意圖Fig. 1 Strudure representation of McCrgA and BtCrgA

三孢布拉霉crgA基因導入卷枝毛霉的crgA缺陷型菌株后產生了相同的光誘導和光適應現象，表明CrgA 參與的調節機制在這些真菌之間基本保守， 三孢布拉霉中CrgA 的調節機制可能與卷枝毛霉相似[5]。 鞏尊洋等構建了三孢布拉霉的crgA缺陷型突變株并對其進行研究，發現缺陷型菌株中參與類胡蘿卜素合成的3 種結構基因轉錄顯著增強，生產的類胡蘿卜素水平相較于野生型提高了31.2%[9]，因此三孢布拉霉CrgA 同樣也是作為一種負調控因子調節類胡蘿卜素的相關合成，且在功能上可能與卷枝毛霉CrgA 相似， 其對類胡蘿卜素合成的調控可能也是通過對WC-1b 蛋白的泛素化的調控進而影響類胡蘿卜素的合成。

由于目前三孢布拉霉遺傳轉化操作困難，三孢布拉霉類胡蘿卜素合成機制的解析也較為困難，在已知BtCrgA 作為類胡蘿卜素合成的負調控因子的情況下， 作者嘗試通過異源表達及體外檢測對BtCrgA 參與的機制進行初步分析，期望通過基因挖掘和生物信息學分析三孢布拉霉泛素化相關酶的基本性質，并獲得體外泛素化反應候選酶，通過異源表達、 親和純化及體外泛素化來構建BtCrgA 的體外泛素化反應體系， 以尋找能協助BtCrgA 實現泛素連接酶功能的相關酶， 確定BtCrgA 的泛素連接酶功能并探究其是否能實現對BtWC-1b 的泛素化，進而從體外實現對CrgA 部分功能的探究，為解析CrgA 在三孢布拉霉菌體內的功能及對類胡蘿卜素合成中的負調節作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒三孢布拉霉（Blakeslea trispora）NRRL 2896 （- ）、Escherichia coliBL21（DE3）： 作者所在實驗室保藏菌株， 表達載體為pET-28a。

1.1.2 試劑 真菌總RNA 抽提純化試劑盒、 硫酸卡那霉素： 生工生物 （上海） 有限公司；HiFiScript gDNA Removal RT MasterMix、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒： 康為世紀生物科技有限公司； 質粒提取、DNA 產物純化試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；泛素兔單克隆抗體：武漢愛博泰克生物科技有限公司；0.2 μmPVDF 膜、Myc 抗體（小鼠單抗）、Flag抗體（小鼠單抗）、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG：上海碧云天生物技術有限公司；DNA marker、BamH I 限制性內切酶、Sac I 限制性內切酶：Takara 公司；蛋白質預染marker、2×Phanta Max Master Mix、ClonExpress?II One Step Cloning Kit、高敏型ECL 化學發光檢測試劑盒：諾唯贊生物科技股份有限公司；其他試劑：國藥集團藥業股份有限公司；引物合成、基因合成及測序均由蘇州金唯智公司完成。

1.2 方法

1.2.1 泛素化相關因子基因挖掘 利用真菌總RNA 提取試劑盒提取三孢布拉霉NRRL 2896（-）總RNA。 利用HiFiScript gDNA Removal RT MasterMix反轉錄獲得cDNA。

根據卷枝毛霉E1（EPB87762）氨基酸序列，從三孢布拉霉NRRL2456 全基因組數據庫（https：//mycocosm.，jgi.doe.gov/pages/blast-query.jsf?db=Blatri1）中的Blast 功能得到同源蛋白質的基因位置信息，根據氨基酸序列與堿基序列對應關系初步拼接基因序列并設計引物，以三孢布拉霉cDNA 為模板進行PCR 擴增，通過測序獲得完整序列信息。

從UbiProt 數據庫（http：//ubiprot.org.ru/）中下載釀酒酵母的所有UBC 蛋白質序列，利用TBTools 軟件以釀酒酵母所有UBC 蛋白質氨基酸序列與三孢布拉霉的全氨基酸序列進行比對， 得到候選E2 酶家族成員。 根據候選E2 酶的氨基酸序列與全基因組序列數據庫進行比對獲得基因位置信息，根據氨基酸序列與堿基序列對應關系初步拼接基因序列并設計引物。 以cDNA 為模板進行PCR 擴增，通過測序獲得完整序列信息。

1.2.2 三孢布拉霉泛素化相關因子生物信息學分析 利用ProtParam 預測BtE1 的基本性質。 根據基因組位置信息對所有BtUBC 蛋白質進行重新命名，并利用ProtParam 預測各UBC 蛋白質基本性質。 在Euk-mPLoc 網站預測各蛋白質的亞細胞定位。 利用TBtools 的Batch SMART 功能從SMART 數據庫批量獲取各UBC 蛋白質的保守結構， 分析結果并作圖。 利用MEGA7 軟件對酵母UBC 蛋白質和三孢布拉霉UBC 蛋白質構建系統進化樹。

1.2.3 重組載體構建、 異源表達及純化 以cDNA為模板， 克隆BtE1、BtCrgA、BtWC-1b 以及BtUBC基因，利用ClonExpress? II One Step Cloning Kit 將目的基因片段克隆到pET-28a 載體的BamH I/Sac I位點， 其中BtCrgA 與Myc 標簽融合，BtWC-1b 與Flag 標簽融合， 通過熱擊將重組載體導入E.coli BL21（DE3）。

將含有各重組載體的E.coli 在50 mL LB 液體培養過夜，接種于TB 液體培養基中培養至OD600為0.6～0.8， 加入0.3 mmol/L 的異丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG），在16 ℃、125 r/min 誘導表達20 h。 誘導后菌液經離心棄去上清液、PBS 緩沖液洗滌重懸后，超聲破碎細胞， 于4 ℃、8000 r/min 離心10 min 后取上清液，經0.45 μm 濾膜抽濾后，使用Ni-NTA 進行蛋白質純化， 純化得到的蛋白質經SDS-PAGE驗證。

1.2.4 CrgA 泛素連接酶功能分析 參考Honda等[10]的反應體系進行CrgA 參與的泛素連接酶功能探究，30 μL 的體外泛素化反應體系中包含了1.5 μL 20×反應緩沖液（1 mol/L Tris-HCl、40 mmol/L ATP、100 mmol/L MgCl2、40 mmol/L DTT、pH 7.5）， 加入300 ng BtE1、300 ng BtE2、2 μg 泛素、1 μg BtCrgA及1 μg BtWC-1b 蛋白質，30 ℃反應2 h， 加入5×SDS-PAGE 上樣緩沖液，煮沸5 min，在SDS-PAGE凝膠上進行電泳分離，進行Western blot 分析，將凝膠中分離的蛋白質經半干轉印儀轉印至PVDF 膜，用含有質量分數5%脫脂奶粉的TBST 溶液室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST 溶液洗滌3 次，二抗孵育1 h， 洗滌3 次后使用ECL 發光檢測試劑盒檢測，在化學發光成像系統中進行成像。

2 結果與討論

2.1 三孢布拉霉泛素化相關酶基因挖掘

泛素化修飾是一種重要的蛋白翻譯后修飾途徑， 完整途徑包括了泛素活化酶E1 （ubiquitinactivating enzyme，UBA）、泛素結合酶E2（ubiquitinconjugation enzyme，UBC ） 和泛素連接酶 E3（ubiquitin-protein ligase）[11]， 要實現對BtCrgA 泛素連接酶功能的體外探究，首先需要獲得泛素活化酶及泛素結合酶的相關序列信息。

根據卷枝毛霉已報道的泛素活化酶序列以及三孢布拉霉全基因組信息設計引物，以三孢布拉霉cDNA 為模板進行擴增， 得到全長約為3000 bp 的條帶，與預期結果一致，對擴增得到的序列進行測序，得到3030 bp 的序列，對應的氨基酸序列與卷枝毛霉E1 酶序列同源性為88.4%， 可初步認定該蛋白為E1 酶，將該基因命名為BtE1，見圖2。

圖2 BtE1 及BtUBC 基因編碼序列核酸電泳圖Fig. 2 Nucleic acid electrophoresis of BtE1 and BtUBC gene coding sequences

利用TBtools 軟件， 以酵母已報道的泛素結合酶序列為模板，從三孢布拉霉基因組數據庫信息中共篩選得到三孢布拉霉的18 種UBC 蛋白質， 根據基因信息設計引物，以三孢布拉霉cDNA 為模板進行擴增，得到不同長度的基因序列，經測序后得到BtUBC 基因編碼序列長度在411～1227 bp。

2.2 三孢布拉霉泛素化相關酶特征分析

2.2.1 泛素活化酶基本性質分析 泛素活化酶E1，是泛素化修飾途徑中的重要起始酶類，依賴ATP 作用下激活泛素并將其轉移至E2 酶[12]。三孢布拉霉泛素活化酶BtE1 由1009 個氨基酸組成，蛋白質相對分子質量預測為113700，等電點為5.02，為穩定性蛋白質，亞細胞定位預測顯示它位于細胞質中。

2.2.2 泛素結合酶基本性質分析 泛素結合酶E2在泛素化途徑中起到接受E1 酶的泛素并將泛素轉移給E3 酶或底物蛋白質的作用，E2 酶的主要特征是含有高度保守的泛素結合（UBC）結構域[13]。 目前僅鑒定出三十幾個物種的泛素結合酶E2 家族成員，主要為釀酒酵母、秀麗線蟲、多種植物及人類，且不同物種中的泛素結合酶E2 數目在十幾到數十個不等[14]。而從三孢布拉霉中一共鑒定到18 種泛素結合酶。 這18 種三孢布拉霉UBC 蛋白質由136～408個氨基酸組成， 蛋白質相對分子質量在15200到46100，基因內含子數量為1～9，蛋白質大多數位于細胞核和細胞質，少數位于細胞骨架或細胞膜上，這表明BtUBC 多在細胞內環境中發揮作用。 不同蛋白質的等電點不同（4.17～9.62），BtUBC 蛋白質均屬于不穩定蛋白質，親水性平均系數代表蛋白質的親水性情況，除BtUBC C 蛋白質外，其余蛋白質均為親水性蛋白質。

對所有BtUBC 蛋白質進行保守結構域分析，結果顯示所有BtUBC 蛋白質均含有UBCc 結構域，見圖3（a）。 表明這18 種蛋白質均屬于UBC 蛋白質，在BtUBC A/E/G/I/K/L/N/O 中含有一個低復雜度結構，該結構可能具有位置依賴作用，其在序列中的位置可能與蛋白質的結合特性及生物學作用有關[15]，BtUBC I 和BtUBC O 的N 端含有跨膜結構域。

對所有BtUBC 保守結構域進行多序列比對和二級結構預測，見圖3（b）。 多序列比對結果顯示這些UBC 保守結構域序列的一致性為36.58%， 二級結構預測結果顯示在UBC 保守結構域中含有4 個α 螺旋和3 個β 折疊，另外幾乎所有BtUBC 蛋白質中均含有泛素硫酯中間體相互作用殘基和E3 相互作用殘基， 大部分蛋白質含有半胱氨酸活性位點，部分蛋白質如BtUBC E/I/K/O/P 則缺乏半胱氨酸活性位點，可能屬于類E2 酶，主要是與通過活性E3 酶合作在泛素化修飾中發揮功能[16]。 對14 個釀酒酵母和18 個三孢布拉霉E2 酶成員進行了系統發育分析，見圖3（c）。 BtUBC 蛋白質與ScUBC 蛋白質在進化上并不是完全對應關系，表明在進化不同物種進化過程中UBCs 發生了不同的變化， 酵母和三孢布拉霉的E2 成員分布在7 個亞家族中。 根據結構特征， 各UBC 蛋白質又可分為4 類 （以不同標記區分），分別為僅含有UBC 結構域的I 類、含有C 端延伸及UBC 結構域的II 類、含有N 端衍生及UBC 結構域的III 類和含有C 端、N 端延伸及UBC 結構域的IV 類[17-19]，在涉及的UBC 蛋白質中，BtUBC D/J/B/P/H/C/Q/R 和ScUBC 4/5/7/9/13/MMS2 屬于I 類，BtUBC G/I/L/N/O 和ScUBC1/2/3/6/8 屬于II 類，BtUBC A/F 和ScUBC 12/X 屬于IV 類，BtUBC E/K屬于IV 類。 系統發育樹上相同或相似分支的大部分ScUBC 蛋白質和BtUBC 蛋白質屬于同一類型的UBC， 但也有少數類型不一致， 如ScUBC X 和BtUBC C、ScUBC 2 和BtUBC R。

2.3 泛素化相關酶的異源表達及蛋白質純化

Rad18 是一種泛素連接酶， 能與泛素結合酶Rad6（UBC 2）形成復合物，實現底物蛋白質的單泛素化修飾[20]。 McCrgA 含有的RAD18 超家族結構表明McCrgA 可能也屬于Rad18 這類蛋白質，而BtCrgA 雖然不含RAD18，但它與McCrgA 有很高的同源性， 所以考慮將與ScUBC 2 親緣關系較近的BtUBC A/E/K/N/Q/R 作為候選泛素結合酶。 此外，ScUBC4/5 具有強大的泛素轉移活性，可以協助各種泛素連接酶進行泛素化修飾功能[21]，因此BtUBC D蛋白質也同樣作為候選E2 酶。 這些BtUBC 基因成功構建出重組載體， 但只有BtUBC A、BtUBC D 和BtUBC Q 成功實現異源表達。BtUBC E、BtUBC N 和BtUBC R 經過密碼子優化后可以在大腸桿菌中表達，而BtUBC K 即使經過密碼子優化也無法表達。

所有能表達異源蛋白質的重組菌經培養、誘導表達、超聲破碎、親和純化獲得相應蛋白質，并進行SDS-PAGE 檢測。 其中BtE1 蛋白質的預測相對分子質量約為113000，BtCrgA 蛋白質約為70000，BtWC-1b 蛋白質約為85000。 BtUBC A、BtUBC D、BtUBC E、BtUBC N、BtUBCQ 和BtUBC R 的蛋白質的相對分子質量分別為20300、16900、37500、18400 和17300。SDS-PAGE 結果顯示，目標蛋白質條帶出現在相應位置，BtWC-1b 蛋白質的實際大小大于預測的相對分子質量，見圖4。

圖4 泛素化相關蛋白質純化圖Fig. 4 Purification of ubiquitination related proteins

2.4 CrgA 泛素連接酶功能體外分析

以純化得到的各組分進行體外泛素化反應，經SDS-PAGE 分離、轉膜后利用泛素抗體、Myc 抗體以及Flag 抗體檢測反應情況， 結果顯示在BtUBC A/D/E/N/Q/R 這6 種UBC 蛋白質中，僅有BtUBC D 可介導BtCrgA 發生泛素化，但并未導致WC-1b 發生泛素化， 可能是尚未找到能協助CrgA 發揮對WC-1b 蛋白質泛素化功能的UBC 蛋白質， 可能是目前的體外泛素化條件并未達到要求等原因導致，如某些E2 酶就是與泛素樣分子發生作用而不是與泛素分子。

為進一步確定反應的泛素化情況， 排除是E1酶、E2 酶泛素化反應后產生該類結果的可能， 分別設置缺乏不同成分的對照組進行體外泛素化反應和Western Blot 檢測， 結果顯示當E1、E2、E3 均存在的條件下，CrgA 能夠發揮其泛素連接酶的功能，自身會發生泛素化，而WC-1b 則并未受到影響，見圖5。

圖5 不同UBC 蛋白質的體外泛素化反應結果Fig. 5 In vitro ubiquitination of different UBC proteins

泛素化反應是由泛素激活酶E1 酶起始，E1 酶在ATP 作用下與泛素形成高能硫酯鍵，活化后的泛素轉移到泛素結合酶E2 上， 最后泛素連接酶催化底物蛋白質與泛素連接[22]，修飾形式涉及單一泛素附著（單泛素化）、幾個單一泛素分子或泛素鏈附著（多泛素化）[23]。 在6 種候選泛素結合酶參與的反應中， 僅有BtUBC D 參與的反應可以導致BtCrgA 發生泛素化修飾，而BtWC-1b 未受到影響，表明在該作用下BtCrgA 與泛素形成的連接方式可能并不適用于將泛素轉移給BtWC-1b。該反應涉及步驟大致為BtE1 在ATP 作用下激活泛素并與之結合， 隨即泛素能夠轉移到BtUBC D 上，最后可能由于缺乏相應底物蛋白質， 或者BtCrgA 自身可能就是一種底物蛋白質，導致BtCrgA 發生泛素化修飾，形成多泛素化，見圖6。 這種對于BtCrgA 的泛素化修飾可能與BtCrgA 在菌體內的質量濃度及活性調節有關。

圖6 不同組分體系的泛素化反應結果Fig. 6 Results of ubiquitination reaction of different components

有研究表明含有環指結構域的E3 酶通過向自身添加多聚泛素鏈，進而進入降解途徑或發生功能的改變從而調控其作為E3 酶的酶活力[24]，從構建的三孢布拉霉和釀酒酵母UBC 蛋白質的系統進化樹中可以發現，與BtUBC D 蛋白質親緣關系較近的為ScUBC 4 和ScUBC 5 兩類蛋白質，而這兩類蛋白質在酵母中往往是與不穩定的蛋白質相關[25]。 有研究顯示， 在野生型卷枝毛霉中，CrgA 難以被特異性抗體檢測到， 而在酵母中異源表達CrgA 時同樣顯示出CrgA 的不穩定性[26]，這也可能是由于這類與酵母UBC4、UBC5 同源的UBC 蛋白質參與到了CrgA 的泛素化反應中， 促使CrgA 蛋白質進入26s-蛋白酶體降解途徑或其他途徑導致CrgA 的降解， 從而維持了CrgA 在菌體內的極低水平。 因此，BtUBC D 也可能只直接介導了BtCrgA 的自泛素化而不用將泛素再轉移至其他底物蛋白質， 這對于維持CrgA 在菌體內的水平可能具有重要意義。 而關于BtCrgA對BtWC-1b 的泛素化作用，目前仍未得到驗證，可能是由于缺乏必要的泛素化反應條件才導致無法實現該反應，見圖7。

圖7 BtCrgA 泛素化修飾示意圖Fig. 7 Schematic diagram of BtCrgA ubiquitination modification

3 結語

作者基于基因組數據挖掘，從三孢布拉霉中發現了一種泛素活化酶和18 種泛素結合酶， 利用生物信息學分析了泛素活化酶和泛素結合酶的基本性質， 對三孢布拉霉UBC 蛋白質和釀酒酵母UBC蛋白質構建系統進化樹發現，該家族中的蛋白質分屬于7 種蛋白質亞家族，并篩選出6 種BtUBC 蛋白質作為候選基因構建體外泛素化反應體系。 通過基因克隆和基因合成在E.coli 中實現了BtE1、6 種BtUBC、BtCrgA 以及BtWC-1b 的異源表達。 通過不同UBC 蛋白質參與的體外泛素化反應，最終檢測到BtUBC D 蛋白質能夠實現對BtCrgA 的泛素化修飾。 通過不同組分泛素化反應體系的檢測結果顯示，只有當E1、E2、E3 均存在的條件下，才能檢測到CrgA 的泛素化， 驗證了CrgA 的泛素連接酶功能。BtUBC D 蛋白質與ScUBC 4 以及ScUBC 5 同源，這可解釋CrgA 在菌體內的不穩定性及極低的含量，在這個泛素化反應體系中，泛素經泛素激活酶BtE1活化后轉移給泛素結合酶BtUBC D，最后轉移至泛素連接酶BtCrgA 上， 導致BtCrgA 發生了泛素化修飾。 目前的研究尚未實現對BtWC-1b 泛素化，或可通過構建三孢布拉霉的crgA 缺陷型菌株來從體內探究CrgA 與WC-1b 之間的關系，從而進一步解析三孢布拉霉類胡蘿卜素的合成機制。 另外也可構建crgA 突變型的三孢布拉霉菌株以探究CrgA 的關鍵性結構域對于三孢布拉霉合成類胡蘿卜素的影響，以期為解析類胡蘿卜素合成機制以及提高類胡蘿卜素產量提供部分依據。