復合益生菌對染菌白羽肉雞生長性能及腸道形態、菌群的影響

徐美余， 羅成瑩， 辛維崗， 張關令， 王 春， 李亞萍， 林連兵*

（1. 昆明理工大學生命科學與技術學院， 云南 昆明 650500；2. 云南省高校飼用抗生素替代技術工程研究中心，云南 昆明 650500；3. 昆明三正生物科技(集團)有限公司，云南 昆明 650500）

白羽肉雞具備繁殖成本低、易成活、生長速度快、屠宰率高、肉質好、飼糧比高等特點，在保障中國肉類供應方面發揮了重要作用[1-3]。 同時，白羽肉雞是目前我國畜禽養殖類中養殖規?；彤a業化程度高度集群的禽類，是我國動物蛋白來源的重要組成部分，是中國唯一能通過大量出口創造經濟效益的肉類食品[4]。 值得注意的是，目前食品安全問題受到了高度重視，在全面禁止抗生素飼用的大背景下，畜禽的生長性能下降，發病率上升，養殖經濟效益大幅縮減等問題逐步加劇。 而白羽肉雞作為高度集約化養殖的家禽更易感染致病菌，因此，找到有效的抗生素替代品并進行多方面的評價對于保障白羽肉雞等肉類制品的供應意義重大。

產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens），也叫魏氏梭菌（Clostridium welchii），是厭氧型革蘭氏陽性病原菌，嚴重威脅著畜禽養殖和人類食品安全[5-6]。產氣莢膜梭菌G 型菌株可分泌α 毒素和NetB 毒素兩種主要的毒力因子，感染雛雞后可引發壞死性腸炎，從而導致小腸黏膜壞死[7-8]。 同時，雛雞壞死性腸炎在家禽養殖中廣泛存在， 是一種產氣莢膜梭菌G型菌株感染引起的腸毒型疾病，對肉雞養殖造成了嚴重威脅，如改變腸道形態從而降低白羽肉雞對飼糧的吸收能力，嚴重者甚至引起肉雞大量死亡[9]。 目前主要通過在飲水或飼糧中添加抗生素來治療肉雞的壞死性腸炎，極易導致耐藥性和藥物殘留等問題[10-11]。 因此，隨著我國畜牧業逐步進入無抗養殖時代，如何有效防治產氣莢膜梭菌感染引起的家禽壞死性腸炎等疾病再次成為畜牧工作者面臨的難題[12]。

益生菌制劑飼喂畜禽可以促進畜禽吸收營養物質和分泌腸道消化酶，提高飼料轉化率和畜禽免疫力，改善其生長性能和腸上皮屏障，在腸道健康調節等方面發揮關鍵作用[13-14]。 例如，益生性枯草芽孢桿菌能分泌胞外酶降解飼料，增強畜禽對飼料的利用，從而對宿主的生產性能產生影響；益生性地衣芽孢桿菌能代謝產生抑菌活性物質從而促進腸道菌群平衡。 以往研究表明，多菌制劑比單菌制劑在畜禽的腸道形態、抗病性方面表現出更好的益生性，如謝文惠等研究表明飼喂復合益生菌可改善雛雞的血清生化指標、腸道黏膜形態和養分表觀利用率[15]，劉淑嬌等的研究也表明飼喂復合益生菌能顯著提高雛雞的日增重、降低料肉質量比，促進生長，提高肉雞免疫力[16]。此外，盡管諸多研究證實了復合益生菌可以治療細菌性感染疾病和提高肉雞生長性能，但人們對復合益生菌治療細菌性感染疾病后的影響知之甚少。 因此，作者在構建產氣莢膜梭菌攻毒感染模型的基礎上，通過在基礎日糧中添加由枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌制成的復合益生菌制劑，探究其在不同添加質量濃度下對產氣莢膜梭菌攻毒感染后的白羽肉雞生長性能、腸道形態以及腸道菌群結構變化，為復合益生菌改善白羽肉雞生產中壞死性腸炎的防治和益生菌制劑的科學應用提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

無添加肉雞基礎日糧完全參照作者所在課題組先前研究[17]進行配制；3 日齡白羽肉雞500 羽、復合益生菌（枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌，總菌數1×1010CFU/g）、金霉素制劑、雞源A 型產氣莢膜梭菌：昆明三正生物科技（集團）有限公司；總DNA 抽提試劑盒（TIANamp Stool DNA Kit）：天根生物技術公司；QIAquick Gel Extraction Kit 試劑盒：德國Qiagen公司；SMRT Bell Template Prep Kit 試劑盒： 美國Pacific Biosciences 公司；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀： 常州市中威電子儀器有限公司；Qubit 3.0 熒光計：美國英濰捷基公司；Agilent 2100：美國安捷倫公司；數碼三目攝像顯微鏡（BA400Digital）：麥克奧迪實業集團有限公司； 圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0：美國Media Cybernetics 公司。

1.2 構建白羽肉雞壞死性腸炎模型

試驗采用A 型產氣莢膜梭菌毒株攻毒感染構建白羽肉雞壞死性腸炎模型。 產氣莢膜梭菌的培養使用厭氧肉肝湯培養基。 試驗3 日齡白羽肉雞每天每羽灌服雞源A 型產氣莢膜梭菌混懸液1 mL 進行感染，白羽肉雞表現腹瀉，則模型構建成功。

1.3 試驗分組與飼喂管理

所有試驗按照組方的不同分為5 組：基礎日糧組（CHE）；基礎日糧中添加50 μg/g 金霉素制劑，使用濃度參考以往研究設置（CKB）[17]，基礎日糧中添加50 mg/kg 復合益生菌（CJK1）， 基礎日糧中添加200 mg/kg 復合益生菌（CJK2），基礎日糧中添加500 mg/kg 復合益生菌（CJK3）。 以上5 組飼糧配好于陰涼干燥處存放。 試驗中隨機將500 羽產氣莢膜梭菌攻毒感染后的白羽肉雞分配至5 個組，每組5 個重復， 每個重復20 羽。 試驗周期為21 d， 以GB/T 19664—2005 為飼養規范，每個重復分開飼養，避免接觸感染。

1.4 生長性能測定

試驗期間每天記錄白羽肉雞的采食量，分別于實驗開始后第1、13、21 天早晨記錄白羽肉雞空腹質量。 平均日采食量見式（1）：

式中：F 為平均日采食量，g/d；mT為總耗料量，g；t 為試驗天數，d。 平均日增重見式（2）：

式中：G 為平均日增重，g/d；ma為總增重，g；t 為試驗天數，d。 平均料肉比見式（3）：

式中：r 為平均料肉比；F 為平均日采食量，g/d；G 為平均日增重，g/d。 每個分組選取5 羽健康白羽肉雞進行稱量，每羽獨立重復3 次。

1.5 腸道形態的測定

在試驗第21 天時，每個組抽取5 羽白羽肉雞，截取腸道卵黃蒂前端5 cm 腸段， 固定采用質量分數10%的中性福爾馬林溶液。 固定后的組織用不同體積分數的乙醇梯度脫水，再用二甲苯透明處理樣本，用石蠟包埋樣品。 包埋后將組織蠟塊用切片機切片，經烤片、烘片處理后，用蘇木精-伊紅染液染色，然后用中性樹脂封片，做成永久切片。 采集切片圖像并測量絨毛高度（villus height，VH）、隱窩深度（crypt depth，CD），每組數據相對應計算絨隱比。

1.6 腸道微生物的測定

1.6.1 DNA 提取和PCR 擴增 在試驗第21 天時，每組隨機放血處死并剖檢5 羽白羽肉雞。 無菌結扎盲腸后截取腸段樣本，凍存備用于腸道菌群測定分析。將雞盲腸腸段取出清洗表面微生物并置于2 mL離心管中， 按照試劑盒說明書提取總DNA 并用瓊脂糖凝膠電泳檢測。 以稀釋至1 mg/L 的基因組DNA 為模板，選擇帶Barcode 的特異引物和高保真酶混合體系進行16S 全長的PCR 擴增。 用2 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。根據PCR 擴增產物濃度進行混合， 使用QIAquick Gel Extraction Kit試劑盒對目的條帶進行膠回收。

1.6.2 文庫構建和上機測序用SMRT Bell Template Prep Kit 試劑盒構建16S 基因文庫， 在擴增后的DNA 片段兩端用DNA 聚合酶將測序接頭連接上， 用AMpure PB 磁珠純化DNA 片段， 構建SMRT Bell 文庫。 用緩沖液回溶純化后的DNA 片段，用BluePipin 片段篩選特定片段并用AMpure PB磁珠純化篩選片段。用Qubit 3.0 熒光計進行文庫的濃度定量， 用Agilent 2100 進行插入片段長度的確定，在百邁客生物科技有限公司二代測序平臺對樣品進行測序和分析。

1.6.3 數據處理 PacBio 下機數據導出為bam 文件。 使用Lima 軟件根據barcode 序列區分各樣本的數據并以bam 格式保存。 校正序列使用CCS（SMRT Link v5.0） ，矯正參數CCS=3，最小準確率0.9，選取長度范圍1340～1640 bp 的序列，以fastq和fasta 保存； 隨后進行SSR 過濾含有8 個以上連續相同堿基數的序列并使用cutadapt 去除引物。 可讀序列通過（UCHIME Algorithm，http：//www.drive5.com/usearch/manual/uchime_algo.html）與全長注釋數據庫進行比對[18]，檢測嵌合體序列，并最終去除其中的嵌合體序列（http：//www.drive5.com/usearch/manual/chimera_formation.html）[19]，得到高質量數據。后續數據分析參考進行alpha 多樣性分析、Beta 多樣性分析以及在門、屬水平統計各樣本的群落組成。

1.7 數據分析

所有試驗數據均包含至少3 次生物學重復，以平均值±標準差（SD）的方式呈現。 應用IBM SPSS 24.0 統計軟件進行單因素方差統計分析和LSD 多重比較，顯著差異性水平定為P＜0.05，圖片繪制采用Origin 2019 進行。

2 結果與分析

2.1 復合益生菌對感染產氣莢膜梭菌后的白羽肉雞生長性能的影響

將5 個組白羽肉雞分別飼喂被產氣莢膜梭菌感染后的白羽肉雞，在21 d 記錄并計算出每組的平均日采食量（ADFI）和平均日增重（ADG），以料肉比（F/G）評估每組白羽肉雞的生長狀況并與傳統抗生素金霉素制劑進行比較，見圖1。 結果顯示，在產氣莢膜梭菌感染的情況下，日糧中添加金霉素制劑和復合益生菌均可降低白羽肉雞的料肉比。 CKB 組、CJK2 組、CJK3 組的料肉比相比于CHE 組顯著降低（P＜0.05）， 且隨著日糧中復合益生菌添加水平的上升白羽肉雞料肉比呈下降趨勢，CJK3 組料肉比達到最低。

圖1 不同組白羽肉雞生長性能的比較Fig. 1 Comparison of growth performance of different groups of white feather broilers

2.2 復合益生菌對感染產氣莢膜梭菌后的白羽肉雞腸道形態的影響

本研究結果中每組隨機剖檢白羽肉雞5 羽，每羽選取10 根走向平直且形態完整的絨毛計算絨隱比。 結果發現，添加金霉素制劑和復合益生菌后，相比于對照組，腸絨毛發育良好，斷裂和腸絨毛損傷減少， 見圖2。 在有產氣莢膜梭菌攻毒感染的情況下，CKB 組、CJK1 組、CJK2 組、CJK3 組與CHE 組相比均能提高絨毛高度，降低隱窩深度，從而提升絨隱比，改善腸道健康度。 CKB 組、CJK2 組、CJK3 組與CHE 組相比絨隱比提升效果顯著 （P＜0.05），CJK3 組提升絨隱比的效果最佳，且和金霉素制劑質量分數為50 μg/g 時的效果沒有顯著差異，見圖3。

圖2 不同組白羽肉雞腸道組織形態Fig. 2 Intestinal morphology of white-feathered broilers in different groups

圖3 不同組白羽肉雞腸道組織絨毛高度與隱窩深度比值Fig. 3 Ratio of villus height to crypt depth in intestinal tissue of whitefeather broilers in different groups

2.3 益生菌對感染產氣莢膜梭菌后的白羽肉雞腸道菌群的影響

2.3.1 α 多樣性分析 分析表1 可知， 各分組樣本的有效序列數在72046～81880 間， 有效序列數目較高，樣品的覆蓋度（coverage）達到0.999，則測序結果對測序樣品的覆蓋度較好，各組間OUT 數目沒有顯著差異（P>0.05）。 分析各試驗組與對照組之間的豐富度和多樣性指數， 發現CJK3 組、CKB 組的Chao1、Ace 指數均低于CHE 組，CKB、CJK1、CJK2、CJK3 組的Shannon 指數均高于CHE 組，CJK1、CJK2、CJK3 組的Simpson 指數均高于CHE 組 （P＜0.05），CJK1、CJK2、CJK3 組的Simpson 指數均高于CKB 組（P＜0.05）。 表明產氣莢膜梭菌感染白羽肉雞后，在基礎飼糧中添加復合益生菌可提高腸道菌群多樣性，降低腸道菌群的豐富度。

表1 α 多樣性指數Table 1 α-diversity index

2.3.2 β 多樣性分析 β 多樣性用于分析組間與組內各樣本間微生物群落組成的差異性與相似性，本試驗由NMDS（Stress=0.122）（圖4（a））和PCoA 法分析（見圖4（b））發現，組間樣本明顯分開，且各組內樣本緊密靠近。 各試驗組與空白組之間距離相差較大，表明試驗分組合理，金霉素制劑和復合益生菌都會對白羽肉雞腸道菌群造成一定影響。

圖4 NMDS 分析圖（a）、PCOA 分析圖（b）Fig. 4 NMDS（a） and PCoA（b） analysis

2.4 腸道菌群組成及優勢菌群相對豐度分析

對產氣莢膜梭菌攻毒感染后白羽肉雞腸道菌群進行分析后，發現在門水平分類單元中，相對豐度前7 位的為厚壁菌門 （Firmicutes）、 擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、軟壁菌門（Tenericutes）、放線菌門（Actinobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、藍藻菌門（Cyanobacteria），見圖5。為探究不同添加劑量的復合益生菌與金霉素制劑對白羽肉雞腸道菌群結構的影響，分析了不同劑量的復合益生菌和金霉素制劑組與空白組的相對豐度差異以及不同劑量的復合益生菌與金霉素制劑組的相對豐度差異，見表2。 結果發現，與CHE 組相比，CJK2 組變形菌門相對豐度顯著升高，CJK1、CJK2、CJK3 組軟壁菌門相對豐度顯著下降（P＜0.05）；CKB組厚壁菌門相對豐度顯著升高，軟壁菌門相對豐度顯著下降（P＜0.05）。 與CKB 組相比，CJK1 組擬桿菌門相對豐度顯著升高， 厚壁菌門相對豐度顯著下降，CJK2 組變形菌門相對豐度顯著升高（P＜0.05）。

表2 門分類單元下相對豐度前7 位細菌的變化Table 2 Changes in relative abundance of top 7 bacteria phylum taxa

圖5 門水平腸道菌群組成Fig. 5 Composition of gut flora at Phyla level in treatment and control groups

在屬水平分類單元中， 糞桿菌屬（Faecalibacterium）、另枝菌屬（Alistipes）、變形桿菌屬（Proteus）、Fournierella、腸球菌屬（Enterococcus）等的相對豐度最高，見圖6。定義屬水平上相對豐度前10 位的菌群為優勢菌群， 分析比較不同劑量的復合益生菌和金霉素制劑組與空白組的相對豐度差異及不同劑量的復合益生菌與金霉素制劑組的相對豐度差異，見表3。 結果發現，與CHE 組相比CJK2 組變形桿菌屬、Clostridiales相對豐度顯著升高，CJK3 組腸球菌屬相對豐度顯著升高，CJK1、CJK2、CJK3 組Fournierella、罕見小球菌屬相對豐度均顯著升高、Lachnospiraceae 相對豐度顯著下降（P＜0.05）；CKB 組Fournierella、腸球菌屬、布勞特氏菌屬、Ruminococcaceae 相對豐度顯著升高、Lachnospiraceae相對豐度顯著下降 （P＜0.05）。 與CKB 組相比，CJK1 組另枝菌屬相對豐度顯著升高，CJK2 組變形桿菌屬、Clostridiales相對豐度顯著升高、Ruminococcaceae 屬相對豐度顯著下降，CJK1、CJK2 組腸球菌屬、 布勞特氏菌屬相對豐度顯著下降，CJK1、CJK2、CJK3 組Fournierella 屬相對豐度顯著下降、罕見小球菌屬相對豐度顯著升高（P＜0.05）。

表3 屬分類單元下相對豐度前10 位細菌的變化Table 3 Changes in relative abundance of the top10 in genera taxa

圖6 屬水平腸道菌群組成Fig. 6 Composition of gut flora at Genera level in treatment and control groups

3 討論

復合益生菌作為一種綠色健康環保的飼料添加劑，在提升白羽肉雞生長性能、減緩由于抗生素的添加導致的菌群失調等方面發揮著重要作用。 產氣莢膜梭菌對白羽肉雞的健康構成重大威脅[4]，特別是白羽肉雞感染產氣莢膜梭菌后會引起以腸道黏膜出血性壞死為主要特征的消化道傳染病，具有較高的發病率和死亡率，對禽類養殖業造成了嚴重損失[20]。因此，作者通過在白羽肉雞基礎日糧上添加不同劑量的復合益生菌，研究其對產氣莢膜梭菌感染后的白羽肉雞生長性能、腸道形態及腸道菌群的影響，并與傳統抗生素金霉素制劑進行比較。 研究結果顯示，飼喂復合益生菌組相比于對照組料肉質量比發生了不同程度降低，這與以往益生菌對畜禽生長性能的影響相似[21]。 隨著復合益生菌組劑量的上升白羽肉雞的料肉質量比呈現出下降趨勢，高劑量（500 mg/kg）、中劑量（200 mg/kg）的復合益生菌與空白組相比均存在顯著差異（P＜0.05），表明復合益生菌對于白羽肉雞的生長具有明顯促進效果。 此外，對比不同劑量的復合益生菌與金霉素制劑組之間的料肉比， 復合益生菌與抗生素作用效果類似，能夠改善消化道對營養物質的利用能力，從而提高了白羽肉雞的生長性能[22]，達到抗生素的替代效果。

腸道的優化發育對于營養吸收和家禽抵抗疾病尤其重要[23]。 腸絨毛高度反應小腸吸收營養物質的面積大小， 隱窩的深淺代表化學消化功能的強弱。 病原菌感染腸道后，引起絨毛高度降低和隱窩深度增加，降低絨隱比[24]。 產氣莢膜梭菌感染后，腸道生理機能發生改變， 白羽肉雞表現為腹瀉等癥狀。 在基礎日糧上添加不同劑量的復合益生菌飼喂產氣莢膜梭菌感染后的白羽肉雞后與對照組相比，復合益生菌組與金霉素制劑組絨毛高度與隱窩深度的比值均有不同程度升高，且復合益生菌添加質量分數為200、500 mg/kg 時， 作用效果與金霉素制劑組相似，能顯著提高絨毛高度與隱窩深度的比值（P＜0.05），絨隱比比值越大，消化吸收能力就越強[25]。本研究結果表明，飼喂高、中、低劑量的復合益生菌可提升絨毛高度，降低隱窩深度，提升絨毛高度與隱窩深度的比值。 這一研究結果與大多數添加復合益生菌能提高絨隱比的研究類似[26]。因此，復合益生菌飼喂產氣莢膜梭菌感染后的白羽肉雞能增強其消化功能。

畜禽腸道微生物對維持宿主健康起重要作用[27]。結果顯示，飼喂復合益生菌后白羽肉雞腸道菌群在門分類水平上厚壁菌門和擬桿菌門占比較高，該研究結果與以往益生菌對產氣莢膜梭菌感染后的白羽肉雞的研究結果相似[28]。 軟壁菌門細菌增多會降低畜禽生長性能[29]，與空白組相比，飼喂復合益生菌、金霉素制劑后軟壁菌門相對豐度均顯著下降（P＜0.05）， 推測治療后白羽肉雞料肉比的下降和絨隱比的上升可能是因為軟壁菌門相對豐度下降。 在屬分類水平上，10 個優勢腸道菌群屬的相對豐度在飼喂復合益生菌后發生了不同程度變化。 分析產氣莢膜梭菌感染白羽肉雞屬水平相對豐度變化，在屬水平上， 發現Fournierella 屬相對豐度均顯著升高，Lachnospiraceae 屬相對豐度均顯著下降 （P＜0.05）。研究發現Lachnospiraceae 與人類潰瘍性結腸炎相關[30]，因此推測復合益生菌飼喂產氣莢膜梭菌感染后的白羽肉雞可通過降低Lachnospiraceae 屬相對豐度達到白羽肉雞壞死性腸炎的防治效果。 研究發現，罕見小球菌屬隨著白羽肉雞壞死性腸炎的加重呈下降趨勢[31]，飼喂復合益生菌后感染產氣莢膜梭菌的白羽肉雞腸道菌群中罕見小秋菌屬細菌相對豐度顯著升高（P＜0.05），則飼喂復合益生菌能治療白羽肉雞壞死性腸炎。 腸球菌屬的屎腸球菌能顯著降低肉雞料肉比[32]，與對照組相比，金霉素制劑與高劑量復合益生菌（500 mg/kg）飼喂的白羽肉雞腸球菌屬相對豐度均顯著升高，進一步表明腸球菌屬能改善白羽肉雞生長性能。

4 結語

作者利用金霉素制劑和由枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌組成的復合益生菌分別飼喂產氣莢膜梭菌感染后的白羽肉雞，比較生長性能、腸道形態和腸道菌群結構的變化。 結果證實，復合益生菌對于感染產氣莢膜梭菌后的白羽肉雞生長性能、腸道形態和腸道菌群結構的影響與金霉素制劑相似，尤其是復合益生菌添加質量分數為500 mg/kg 時飼喂感染產氣莢膜梭菌的白羽肉雞后，有效降低了白羽肉雞料肉質量比， 促進了白羽肉雞的快速生長發育，且能夠促進腸道對營養物質的消化吸收和改善白羽肉雞腸道菌群健康。 在當前我國面臨飼料中禁抗的關鍵節點，本研究結果利用不同質量濃度的復合益生菌飼喂感染致病菌后的白羽肉雞并評估生長性能、腸道形態和腸道菌群結構，為復合益生菌應用于白羽肉雞養殖提供理論依據。