外泌體負載的KV11通過VDAC1和自噬機制對角膜新生血管的抑制作用

陳文倩 杜瑋 于文貞

北京大學人民醫院眼科 北京大學人民醫院眼視光中心 北京大學人民醫院眼病與視光醫學研究所 視網膜脈絡膜疾病診治研究北京市重點實驗室 北京大學醫學部眼視光學院,北京 100044

角膜是重要的屈光介質之一,無血管是其維持光學透明的主要原因之一[1-2]。但在缺氧、炎癥、創傷等情況下,角膜緣血管網的新生血管容易生長到角膜內,對角膜的透光性造成損害,從而導致視力下降,稱為角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)[3-4]?，F有的CNV治療方法存在一定缺陷和局限性,如糖皮質激素誘導的青光眼、抗血管內皮生長因子(vascular endothelial growth cell,VEGF)藥物對于成熟CNV效果較差、光動力療法對周圍角膜和角膜緣干細胞造成損害等[2,5]。CNV治療方法的部分有效性和相關不良反應提示我們,需要探索新的CNV治療方法。Kringle結構域廣泛存在于纖溶酶原和載脂蛋白中,在抑制血管生成中發揮關鍵作用,尤其是Kringle V(KV)[6-10]。KV可抑制胃癌、肝細胞癌和CNV等的形成[11-13],KV來源的十一肽KV11(YTMNPRKLFDY)對視網膜新生血管具有明顯抑制作用[14-15]。然而,短肽存在不穩定、生物膜滲透性較差等缺點[16-18]。因此,需要一種藥物載體協助KV11在體內穩定發揮抑制血管生成的作用。外泌體(exosome,EXO)是各種細胞分泌的直徑為30～150 nm的胞外囊泡[19-20],可以作為藥物的微載體直接將藥物遞送入細胞,增強藥物穩定性,延長藥物半衰期[21-22]。Gao等[23]研究發現了一種名為CP05的錨定肽,可以靶向EXO膜標記蛋白CD63,從而負載藥物。Dong等[24]利用CP05將KV11負載到EXO上,發現該系統可以通過侵襲性較低的方式較好地治療視網膜新生血管。然而,EXO-KV11對CNV的作用及其機制尚不清楚。本研究擬探討EXO負載抗新生血管短肽KV11在CNV中的作用和相關機制,以期為EXO-KV11可能的臨床應用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞及動物來源 原代人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)購自浙江美森科技有限公司。8周齡SPF級健康雄性SD大鼠100只,體質量180～220 g,購自北京華阜康實驗動物技術有限公司[許可證號:SCXK(京)2019-0008]。其中10只大鼠不做任何處理,為正常對照組;其余大鼠均經角膜堿燒傷構建CNV模型。本研究經北京大學人民醫院動物倫理委員會批準(批文號:20210019),所有動物操作均符合視覺與眼科學協會及北京大學動物保護與使用委員會的規定。

1.1.2主要試劑及儀器 短肽KV11(YTMNPRKLFDY)、KV11(CP05)(YTMNPRKLFDYCRHSQMTVSRL)、FITC標記的KV11(CP05)(蘇州強耀生物科技有限公司);ECM培養基(美國Sciencell公司);總EXO提取試劑(細胞培養基)、Bis-Tris預制膠、MOPS SDS電泳緩沖液、MES SDS電泳緩沖液、RIPA溶液(美國Thermo公司);0.22 μm、0.45 μm NC膜(德國Merck Millipore公司);蛋白酶抑制劑混合物(蘇州新賽美生物科技有限公司);電轉緩沖液、BCA蛋白定量試劑盒(北京蘭博利德生物技術有限公司);TBS封閉液(美國LI-COR公司);兔抗四跨膜蛋白30(tetraspanin 30,CD63)多克隆抗體(25682)、兔抗電壓依賴性陰離子通道1(voltage-dependent anion channel 1,VDAC1)多克隆抗體(55259)、兔抗半胱氨酸蛋白酶3(caspase 3)多克隆抗體(19677)、鼠抗β-actin單克隆抗體(66009)(武漢Proteintech公司);兔抗蛋白質激酶R樣內質網激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)單克隆抗體(C33E10)、兔抗自噬接頭蛋白1(sequestosome-1,SQSTM1/p62)單克隆抗體(D10E10)(美國Cell Signaling Technology公司);兔抗血小板內皮細胞黏附分子1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1,CD31)多克隆抗體(ab281583)、兔抗自噬微管相關蛋白輕鏈3B(microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B,LC3B)單克隆抗體(ab192890)(美國Abcam公司);CruzFluorTM790標記小鼠抗兔IgG(sc-516253)、CruzFluorTM790標記小鼠IgG κ結合蛋白(sc-516181)(美國Santa Cruz公司);異硫氰酸熒光素標記的右旋糖酐(FITC-dextran,相對分子質量2 000 000)(德國Sigma公司);異氟烷(深圳瑞沃德生命科技有限公司)。Olympus BX41倒置顯微鏡(日本Olympus公司);Apogee A-50微流式細胞儀(美國Apogee公司);石蠟切片機、透射電子顯微鏡JEM-1400(德國Leica公司);Nanosight NS300納米跟蹤分析儀(英國Malvern公司);裂隙燈顯微鏡(日本拓普康公司);Odyssey Clx顯影儀(美國LI-COR公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 HUVECs用ECM完全培養基于37 ℃、5%CO2培養箱中培養,當細胞生長至70%融合時,將細胞消化常規傳代或低溫保存。取第3～6代HUVECs用于后續實驗。

1.2.2免疫熒光染色法鑒定細胞 取細胞爬片,4%多聚甲醛固定30 min,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)洗3次,每次5 min;滴加5%Triton X-100,室溫下孵育15 min,甩干載玻片上的液滴,滴加封閉液,室溫下孵育1 h;甩干載玻片上的封閉液,加CD31抗體50 μl,4 ℃孵育過夜;PBS洗3次,每次5 min;加入熒光二抗50 μl,室溫下避光孵育1 h;PBS洗3次,每次5 min;加入50 μl DAPI染核10 min,PBS洗3次,每次5 min;抗熒光猝滅劑封片,熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3HUVECs源EXO的提取和鑒定 實驗前將胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)以100 000×g超速離心16 h以耗竭FBS源EXO。通過總EXO分離試劑盒(細胞培養基)分離HUVECs來源的EXO。將HUVECs在T75中培養48～72 h,收集培養液,2 000×g離心30 min,棄去細胞和碎片。將上清液與1/2體積的總EXO分離試劑在4 ℃下孵育過夜。將混合物在4 ℃下10 000×g離心1 h。每毫升上清生成的EXO沉淀用10 μl生理鹽水重懸,并采用納米粒子跟蹤分析、透射電子顯微鏡觀察EXO的濃度和大小形態,采用Western blot實驗進行EXO標志物鑒定。BCA檢測EXO蛋白質量濃度約為2 μg/μl。

1.2.4EXO-KV11的合成和鑒定 FITC標記的KV11(CP05)與EXO在4 ℃下避光孵育過夜。通過配備488 nm激發光的Apogee A-50微流式細胞儀檢測EXO負載KV11的效率。Apogee參考混合珠由折射率為1.42且直徑為180、240、300、590、880、1 300 nm非熒光二氧化硅微球和折射率為1.59且直徑為110 nm和500 nm的綠色熒光乳膠球組成。使用Apogee參考混合珠進行校正,樣品上樣進行檢測,采樣速度為0.75 μl/min,樣品體積不小于150 μl,采樣時間為180 s。EXO濃度和熒光陽性事件數(n)根據樣品體積、細胞儀流速自動測量。采用中角光散射和488 nm熒光觸發通道,并定義帶有FITC熒光、直徑為30～180 nm的顆粒為EXO-KV11(FITC)陽性事件。

1.2.5大鼠角膜堿燒傷誘導CNV模型的建立 采用2.5%異氟醚麻醉大鼠。直徑為3 mm的圓形濾紙片浸于1 mol/L NaOH溶液中30 s,吸水紙吸去多余液體,燒灼大鼠角膜中心30 s(第0天),用15 ml生理鹽水充分清洗結膜囊以去除殘余的NaOH溶液。采用隨機數字表法隨機將堿燒傷角膜大鼠分為EXO-KV11組30只、KV11組30只和生理鹽水組30只(本課題組體外實驗結果表明,單純EXO組與生理鹽水組指標差異無統計學意義,因此動物實驗排除了單純EXO這一對照組)。從堿燒傷后第1天開始,各組分別每隔1 d給予結膜下注射100 μl EXO-KV11(25 μg)、KV11(25 μg)或生理鹽水。在第1、4、7、14天,裂隙燈顯微鏡下觀察CNV生長情況并拍照。

1.2.6大鼠CNV相對熒光面積定量分析 參照文獻[25]中的方法對裂隙燈顯微鏡下的角膜照片進行CNV定量分析。測量角膜緣血管長度(L)和角膜鐘時數(C),CNV面積=C/12×3.141 6[r2-(r-L)2],其中r=3 mm,為大鼠角膜半徑。為了進一步精確計算CNV面積,通過FITC-dextran心室灌注、角膜血管造影計算角膜熒光面積與角膜總面積的比值來定量分析CNV相對熒光面積[26]。采用氯胺酮(80 mg/kg)/噻拉嗪(10 mg/kg)麻醉大鼠,左心室灌注25 mg/ml FITC-dextran 1 ml;1 min后,摘取眼球并在4%多聚甲醛溶液中固定30 min。眼球后節組織分離后將大鼠角膜平均剪成4瓣平鋪在玻片上,熒光顯微鏡下觀察并拍照。采用Image Pro Plus 6軟件檢測CNV熒光面積與角膜總面積的比值,定量分析CNV相對熒光面積。

1.2.7蘇木精-伊紅染色觀察各組CNV管腔數量 每組選取6只大鼠,于14 d過量麻醉處死后摘取眼球,4%多聚甲醛固定24 h,置于55%乙醇中過夜,梯度乙醇(60%、70%、80%、90%、100%)脫水,二甲苯透明5 min,浸蠟1 h,石蠟包埋,4 μm厚連續切片,37 ℃烤片過夜。按照試劑盒說明書進行蘇木精-伊紅染色,觀察各組角膜形態和基質CNV數量。

1.2.8免疫組織化學法檢測大鼠角膜組織中CD31的表達分布 每組取8只大鼠,將組織石蠟切片置于60 ℃烤箱中烤片2 h,PBS浸洗后放入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液,100 ℃水浴30 min修復抗原;自然冷卻后于3%H2O2溶液中室溫孵育10 min,10%山羊血清溶液中室溫封閉30 min;滴加兔抗CD31一抗(1∶500),4 ℃孵育過夜;PBS浸洗3次,滴加山羊抗鼠HRP標記二抗(1∶100),室溫孵育30 min;PBS浸洗3次,滴加適當比例的HRP標記鏈霉卵白素,室溫孵育30 min,滴加DAB顯色液顯色15 s～3 min,顯微鏡下觀察組織呈褐色,立即放入水中中止反應,采用蘇木素染液復染核。切片用中性樹脂封片后于顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.9Western blot法檢測VDAC1和內質網應激、自噬及凋亡相關蛋白表達量 每組取5只大鼠,HUVECs和角膜組織的蛋白通過RIPA裂解液提取。制備好的蛋白樣品通過SDS凝膠電泳后電轉到0.22或0.45 μm的NC膜上,封閉液封閉1.5 h,分別加入CD63、VDAC1、PERK、p62、LC3B、caspase 3或β-actin(均1∶1 000稀釋)抗體,4 ℃下孵育過夜;TBST洗3次后分別用相應二抗常溫下避光孵育1 h,在Odyssey Clx顯影儀上顯影。采用ImageJ軟件定量分析條帶,以β-actin為內參,目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值;LC3B蛋白表達量=LC3BⅡ灰度值/LC3BⅠ灰度值。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 HUVECs形態觀察及表型鑒定

原代HUVECs傳代培養至第3～6代,細胞形態均勻一致,呈鋪路石樣。免疫熒光檢測結果顯示,第3代HUVECs高表達內皮細胞標志物CD31(圖1)。

圖1 HUVECs形態及CD31表達 A:第3～6代HUVECs呈鋪石路樣形態(×100,標尺=200 μm) B:HUVECs CD31染色陽性(×400,標尺=100 μm) C:DAPI染色見細胞核居于細胞中央(×400,標尺=100 μm) D:圖B和C的融合圖(×400,標尺=100 μm)Figure 1 Morphological observation of HUVECs and expression of CD31 A:The paving-stone pattern of primary HUVECs at passage 3-6 under a microscope (×100,scale bar=200 μm) B:HUVECs positive for CD31 staining (×400,scale bar=100 μm ) C:DAPI staining showed that the nuclei were in the center of cells (×400,scale bar=100 μm) D:Emerged images B and C (×400,scale bar=100 μm)

2.2 EXO的鑒定及其與KV11(CP05)的結合效率

通過透射電子顯微鏡、納米粒徑分析儀和Western blot法鑒定EXO,結果顯示提取的EXO為雙面凹的杯狀囊泡(圖2A);平均直徑為127 nm,濃度為(2.15×109±6.55×107)particles/ml(圖2B);EXO標志蛋白CD63陽性(圖2C)。Apogee流式檢測不同濃度比(EXO∶KV11=2∶1、1∶1、1∶2、1∶4)下EXO負載KV11的效率,結果表明當EXO∶KV11=1∶4(6.25 μg/ml∶25 μg/ml)時,結合效率最佳,為87.5%,后續實驗采用此濃度(圖2D)。

圖2 外泌體的形態及其與KV11(CP05)的結合效率 A:HUVECs來源的外泌體透射電子顯微鏡圖像(×100 000,標尺=200 nm) B:納米粒徑分析HUVECs來源的外泌體大小分布 C:Western blot分析HUVECs來源外泌體中CD63蛋白表達 D:Apogee流式檢測外泌體與FITC標記的KV11(CP05)不同濃度比下結合形成EXO-KV11(FITC)的效率[橙色方框圈出EXO-KV11(FITC)陽性事件] EXO:外泌體Figure 2 Morphology of exosomes and its binding efficacy with KV11 (CP05) A:Transmission electron microscopy image of HUVECs-derived exosomes (×100 000,scale bar=200 nm) B:Nano-particle size analysis of the size distribution of HUVECs-derived exosomes C:Expression of CD63 protein in HUVECs-derived exosomes by Western blot D:Apogee flow system analysis for the efficiency of exosomes binding to FITC-labeled KV11 (CP05) at different concentration ratios (orange box indicated EXO-KV11 (FITC) positive events) EXO:exosome;KV:kringle V

2.3 各組CNV不同指標及CD31表達情況比較

2.3.1各組大鼠角膜堿燒傷后不同時間點裂隙燈顯微鏡下CNV形成比較 堿燒傷1 d,各組角膜中央基質混濁,球結膜充血,角膜組織幾乎無新生血管長入;堿燒傷4 d,可見各組新生血管芽從角膜緣長入角膜;堿燒傷7 d,EXO-KV11組CNV面積小于KV11組和生理鹽水組;堿燒傷14 d,EXO-KV11組和KV11組CNV面積均小于生理鹽水組,EXO-KV11組CNV面積小于KV11組(圖3)。堿燒傷后7 d和14 d,各組CNV面積總體比較差異均有統計學意義(F=4.613、15.590,均P<0.05),其中堿燒傷后7 d,EXO-KV11組CNV面積小于KV11組和生理鹽水組;堿燒傷14 d,EXO-KV11組和KV11組CNV面積均小于生理鹽水組,EXO-KV11組CNV面積小于KV11組,差異均有統計學意義(均P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠角膜堿燒傷后7 d 和14 d CNV面積比較 (,mm2)Table 1 Comparison of CNV area after corneal alkali-burn injury in rats on days 7 and 14 among various groups (,mm2)

圖3 各組大鼠堿燒傷后不同時間點裂隙燈顯微鏡下圖像(×16) 堿燒傷1 d,各組大鼠角膜中央基質混濁,球結膜充血,角膜組織幾乎無新生血管長入;堿燒傷4 d,各組新生血管芽從角膜緣長入角膜;堿燒傷7 d,EXO-KV11組CNV面積小于KV11組和生理鹽水組;堿燒傷14 d,EXO-KV11組和KV11組CNV面積均小于生理鹽水組,EXO-KV11組CNV面積小于KV11組 箭頭示CNV EXO:外泌體Figure 3 Slit-lamp images of rat eyeballs at different time points after corneal alkali burns in each group (×16) On day 1 after alkali burn,cloudy central corneal matrix and congested bulbar conjunctiva were seen,and almost no new blood vessels grew in corneal tissue.On day 4 after alkali burn,neovascularization buds grew from the corneal limbus into the cornea could be seen in each group.On day 7 after alkali burn,the CNV area was smaller in EXO-KV11 group than in KV11 and normal saline groups.On day 14 after alkali burn,the CNV area was smaller in EXO-KV11 and KV11 groups than in normal saline group,and was smaller in EXO-KV11 group than in KV11 group The arrows showed CNV EXO:exosome;KV:kringle V

2.3.2各組大鼠CNV相對熒光面積比較 角膜堿燒傷后14 d,生理鹽水組新生血管已長入角膜中央,CNV熒光面積最大,新生血管密集,迂曲擴張;KV11組CNV相對熒光面積較生理鹽水組小,新生血管密度較稀疏,迂曲擴張程度較輕;EXO-KV11組CNV面積最小,新生血管密度稀疏,迂曲擴張程度最輕。角膜熒光鋪片定量分析結果顯示,生理鹽水組、KV11組和EXO-KV11組CNV相對熒光面積分別為(8.3±1.7)%、(5.2±1.6)%和(3.4±0.7)%,總體比較差異有統計學意義(F=11.735,P<0.01),其中KV11組和生理鹽水組CNV相對熒光面積均大于EXO-KV11組,生理鹽水組CNV相對熒光面積大于KV11組,差異均有統計學意義(均P<0.05)(圖4)。

圖4 各組CNV相對熒光面積比較 A:各組堿燒傷后14 d角膜熒光鋪片(FITC-dextran ×40,標尺=1 mm)(A1:EXO-KV11組;A2:KV11組;A3:生理鹽水組) B:CNV熒光面積與角膜總面積之比的定量分析 F=11.735,P<0.01.與EXO-KV11組比較,aP<0.05;與KV11組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗,n=8) 1:EXO-KV11組;2:KV11組;3:生理鹽水組 CNV:角膜新生血管Figure 4 Comparison of CNV fluorescence area among various groups A:Corneal fluorescence flat mounts on day 14 after alkali burn in different groups (FITC-dextran ×40,scale bar=1 mm) (A1:EXO-KV11 group;A2:KV11 group;A3:normal saline group) B:Quantitative analysis of the ratio of the CNV area to the total cornea area F=11.735,P<0.01.Compared with EXO-KV11 group,aP<0.05;compared with KV11 group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test,n=8) 1:EXO-KV11 group;2:KV11 group;3:normal saline group CNV:corneal neovascularization

2.3.3各組大鼠角膜組織形態學特征比較 堿燒傷后14 d,生理鹽水組基質內可見大量新生血管管腔;KV11組基質內新生血管管腔數量較生理鹽水組少;EXO-KV11組角膜結構趨于正常,少見新生血管管腔(圖5)。

圖5 各組大鼠角膜組織形態學特征比較(HE ×200,標尺=25 μm) A:角膜基質纖維趨于正常,少見血管管腔 B:角膜基質纖維紊亂,可見新生血管管腔 C:角膜基質纖維嚴重紊亂,可見大量新生血管管腔 圖6 各組CD31表達情況比較(DAB ×200,標尺=25 μm) A:EXO-KV11組可見少量CD31陽性細胞圍成的管腔 B:KV-11組CD31陽性細胞圍成的管腔增多 C:生理鹽水組可見大量CD31陽性細胞圍成的管腔 CD31陽性細胞呈棕褐色Figure 5 Comparison of corneal histomorphologic characteristics of rats among various groups (HE ×200,scale bar=25 μm) A:Corneal stromal fibers seemed normal,and vascular lumen was rare B:Corneal stromal fibers were disturbed,and neovascular lumens were visible C:Corneal stromal fibers were seriously disturbed,and a large number of neovascular lumens were seen Figure 6 Comparison of CD31 expression among different groups (DAB ×200,scale bar=25 μm) A:A few lumens surrounded by CD31-positive cells were seen in the EXO-KV11 group B:More lumens surrounded by CD31-positive cells were seen in the KV-11 group C:A large number of lumens surrounded by CD31-positive cells were seen in the normal saline group Brown color for CD31-positive cells

2.3.4各組CD31表達情況比較 角膜免疫組織化學染色結果顯示,堿燒傷后14 d,生理鹽水組角膜基質內可見大量CD31染色陽性細胞,細胞圍成大小不一的管腔結構;KV11組角膜基質內CD31染色陽性細胞圍成的管腔數量較生理鹽水組少,EXO-KV11組較KV11組少(圖6)。

2.4 各組VDAC1和內質網應激、自噬及凋亡相關蛋白表達量比較

Western blot檢測結果顯示,EXO-KV11組、KV11組、生理鹽水組和正常對照組大鼠角膜組織中VDAC1、PERK、p62、cleaved caspase 3相對表達量總體比較差異均有統計學意義(F=35.960、8.947、17.791、101.168,均P<0.01),其中EXO-KV11組VDAC1、PERK、p62、cleaved caspase 3相對表達量高于KV11組和生理鹽水組,差異均有統計學意義(均P<0.001)。各組LC3BⅡ/LC3BⅠ蛋白相對表達量總體比較差異無統計學意義(F=0.445,P=0.727)(表2,圖7)。

表2 各組大鼠角膜組織中VDAC1和內質網應激、自噬及凋亡相關蛋白表達量比較()Table 2 Comparison of the expression levels of VDAC1,endoplasmic reticulum stress and apoptosis-associated proteins in rat cornea among various groups ()

圖7 Western blot檢測角膜堿燒傷后各組角膜組織中VDAC1、PERK、p62、LC3BⅡ/LC3BⅠ、cleaved caspase 3的表達 1:EXO-KV11組;2:KV11組;3:生理鹽水組;4:正常對照組 VDAC1:電壓依賴性陰離子通道1;β-actin:β-肌動蛋白;PERK:蛋白質激酶R樣內質網激酶;p62/SQSTM1:自噬接頭蛋白1;LC3B:自噬微管相關蛋白輕鏈3B;cleaved caspase 3:活化半胱氨酸蛋白酶3Figure 7 Expressions of VDAC1,PERK,p62,LC3BⅡ/LC3BⅠ,and cleaved caspase 3 in corneal tissue after corneal alkali burn in different groups by Western blot 1:EXO-KV11 group;2:KV11 group;3:normal saline group;4:normal control group VDAC1:voltage-dependent anion channel 1;PERK:protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase;p62/SQSTM1:sequestosome-1;LC3B:microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B

3 討論

CNV可造成嚴重的視力損害,目前臨床上已有的CNV治療方式均存在一定不足[27],仍需進一步研究抗CNV藥物。

近年來,大量研究表明EXO作為天然發生的細胞外囊泡可以增加藥物遞送效率和穩定性[28-29]。有研究發現,CP05可以通過非共價鍵方式與EXO 4次跨膜蛋白CD63結合,通過多肽與CP05的融合可以使EXO負載多肽[30]。因此,本研究將CP05與KV11體外融合,并與EXO孵育形成EXO-KV11,結果顯示當EXO∶KV11=1∶4(6.25 μg/ml∶25 μg/ml)時,結合效率最佳,為87.5%,說明KV11能夠通過CP05與EXO高效結合。本研究中裂隙燈顯微鏡下眼前節照相定量分析結果表明,EXO-KV11能夠早于KV11抑制CNV;角膜熒光鋪片、CD31免疫組織化學染色和蘇木精-伊紅染色結果顯示,EXO-KV11對CNV的抑制效果優于KV11。

既往研究已證實,線粒體VDAC1是纖溶酶原來源KV的受體,KV通過激活VDAC1誘導血管內皮凋亡[31-32]。VDAC1定位于線粒體外膜,調節線粒體和細胞其他部分的代謝和能量交流,在線粒體介導的凋亡中起重要作用。其中,VDAC1參與內質網-線粒體交流,調節自噬和炎癥[33]。目前尚不明確KV11是否是KV結構域與VDAC1作用的有效激活片段。本研究結果顯示,EXO-KV11能顯著促進VDAC1、內質網跨膜感受器PERK的表達,活化凋亡蛋白caspase 3,表明EXO-KV11在CNV中能夠激活VDAC1,促進內質網應激和血管內皮細胞凋亡。

研究發現,自噬在內質網應激激活下起到促生存的作用[34],LC3BⅠ轉化為膜結合形式的LC3BⅡ表明自噬流的進行,自噬中晚期標志蛋白p62的表達水平增加表明自噬溶酶體降解過程受阻,自噬流受阻[35]。本研究結果顯示,EXO-KV11增加p62表達,而EXO-KV11組LC3BⅡ/LC3BⅠ比值與生理鹽水組比較差異無統計學意義,表明EXO-KV11阻滯自噬中晚期降解過程,自噬流受阻。因此,EXO-KV11誘導內質網應激導致錯誤折疊蛋白的堆積和自噬流消化錯誤折疊蛋白這一途徑的阻滯,導致內皮細胞穩態障礙,從而發生凋亡。值得注意的是,在抑制CNV中,KV11的表現與EXO-KV11截然不同,KV11不能改變VDAC1和PERK表達,表明KV11在CNV中不能激活VDAC1,不能通過PERK激活內質網應激;KV11下調了p62的表達,但KV11組LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值與生理鹽水組比較差異亦無統計學意義,表明KV11可能是從與EXO-KV11不同的途徑改變了自噬流的進程。同時,KV11活化caspase 3,促進了血管內皮細胞的凋亡。

綜上所述,本研究結果表明EXO-KV11通過激活VDAC1和阻滯自噬流等相關途徑抑制CNV,且EXO-KV11的抑制效果優于單獨的KV11短肽。盡管關于EXO-KV11抑制視網膜新生血管的實驗已有開展[24],但EXO-KV11對于新生血管的抑制機制仍不明確。鑒于VDAC1是KV的受體且VDAC1在線粒體-內質網交流及線粒體介導的凋亡中起到重要作用,以上結果提示EXO-KV11抑制CNV的作用機制可能與VDAC1的激活相關,內質網應激和自噬也參與其中,這為新生血管性眼病的治療靶點研究提供了新的思路和實驗基礎,VDAC1有望成為抑制新生血管的新靶點。本研究仍存在一定局限性,如EXO作為運輸藥物的載體,進入細胞后的運輸是否會影響藥物本身的作用途徑尚不明確,正如本研究發現EXO-KV11和KV11在內質網應激和自噬方面不同的分子機制,仍需進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在任何利益沖突

作者貢獻聲明陳文倩:設計實驗、實施研究、統計分析、起草文章;杜瑋:設計實驗、對文章知識性內容進行審閱和智力性內容修改;于文貞:直接參與選題、醞釀和設計實驗、對文章的知識性內容作批評性審閱及定稿