水凝膠制備人工角膜研究現狀及展望

張彬彬 綜述 王雁 審校

南開大學醫學院 天津市眼科醫院 天津市眼科學與視覺科學重點實驗室 天津市眼科研究所,天津 300020

角膜與淚膜一起形成眼部外屏障并保護眼部不受外界環境和病原體侵擾,同時角膜也是眼部重要的屈光介質。角膜化學/熱燒傷、單純皰疹性角膜炎、大泡性角膜病變、角膜潰瘍和Fuchs角膜內皮營養不良等角膜創傷和疾病都會影響角膜透明度,甚至造成視力喪失,是主要的致盲眼病。每年新報道的角膜盲病例超過150萬例[1],但由于供體組織短缺和移植手術費用高昂,可通過角膜移植治療的不到5%[2]。穿透角膜移植術、前板層角膜移植術、角膜內皮移植術等手術是治療角膜盲的主要方式。因角膜移植供體缺乏,研究者試圖通過組織工程學的方法構建人工角膜,如人造角膜假體、動物脫細胞的角膜組織(例如豬角膜)和人羊膜等。用于制造人工角膜的生物材料必須具有與天然角膜相似的物理、生化、生理、生物學特性。水凝膠由于其獨特的生物學特性現已成功應用于基于水凝膠的角膜接觸鏡、抗青光眼藥物的輸送、緩釋型抗血管內皮生長因子藥物的輸送、玻璃體填充替代物等[3-7]。本文就水凝膠結合3D打印在人工角膜制備方面的研究進展進行綜述。

1 水凝膠概念

水凝膠為高度水合的聚合物材料(按質量計>30%的水),其通過聚合物鏈之間的物理和化學交聯來保持結構完整性,通常分為化學和物理凝膠?；瘜W凝膠是指在支鏈之間通過邁克爾加成反應[9]、酶促反應等形成始終緊密相連的凝膠網絡,是永久和不可逆的。物理凝膠的形成是可逆的,是離子間相互作用、高分子鏈纏繞、氫鍵/或疏水作用力相互作用的結果[10-11]。水凝膠的形成包括2個關鍵步驟:(1)將細胞外基質(extracellular matrix,ECM)材料溶于蛋白質單體組分中;(2)由溫度或酸堿控制的中和作用,以誘導單體分子內鍵的自發重組,形成均勻的凝膠[12]。水凝膠具有理化性質可控、生物相容性好等特點。

2 水凝膠的來源

水凝膠來源廣泛,可以由天然的材料,如瓊脂糖和膠原蛋白組成,也可以由合成聚合物,如聚乙二醇、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)組成。

2.1 透明質酸

透明質酸(hyaluronic acid,HA)也稱為透明質酸鹽,是ECM的主要成分。這種非硫酸化的糖胺聚糖在細胞增生、生長、存活和分化中起關鍵作用[13]。其物理性質,如黏度、彈性、硬度、形狀和結構可以通過化學修飾[14]。HA廣泛分布在皮膚、軟骨和腦等組織中,并且在生長發育、傷口愈合和疾病中起著重要作用[15]。Fiorica等[16]首次將HA水凝膠與聚天酰胺衍生物[α,β-poly(N-2-hydroxyethyl) (2-aminoethylcarbamate)-d,l-aspartamide,PHEA-EDA]化學交聯,作為羊膜的替代品,用于遞送人角膜緣上皮細胞,其結果證明了HA/PHEA-EDA水凝膠作為角膜緣干細胞移植載體支架在角膜損傷治療中的可行性。HA以其生物降解性、生物相容性、無毒性和非免疫原性等在骨關節炎手術、眼科手術、整形外科手術、組織工程和藥物輸送中得到了廣泛應用[17]。

2.2 明膠

明膠具有較好的溶解性、低免疫原性的特點,包含許多促進細胞附著的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列以及適合細胞重構的基質金屬蛋白酶靶序列[18-19];但明膠溶液本身對溫度敏感,在低溫條件下易自發形成凝膠,為了增加明膠的穩定性和提高抗張能力,需要對明膠進行改良,如添加甲基丙烯酸酐。2000年,Van Den Bulcke等[20]首次報道了應用甲基丙烯酸酐與明膠反應,修飾明膠的氨基側鏈,生成甲基丙烯?；髂z(gelatin methacrylate,GELMA),并將GELMA溶于水中,以Irgacure2959為光引發劑,在紫外線光的照射下發生交聯反應,制備出GELMA水凝膠。GELMA水凝膠因其獨特的光交聯特性、可控的力學性能以及良好的生物相容性,已成為具有廣泛應用前景的生物聚合物材料。

2.3 海藻酸鈉

海藻酸鈉是從褐藻中提取的多糖,常用于細胞包封和組織移植,海藻酸鹽被認為是一種生物相容性較好的材料[21],并且可以通過Ba2+、Zn2+或Ca2+進行離子交聯,但如何保持交聯前后形態的完整性和增強結構的穩定性是需要考慮的問題,Seok等[22]通過將海藻酸鈉和PVA混合再進行凍干處理彌補了這一不足。海藻酸鈉現已應用于食品、紡織、印刷和制藥等多種行業[23]。

2.4 脫細胞生物水凝膠

哺乳動物組織由300多種ECM蛋白和多種ECM修飾酶組成,ECM結合生長因子和其他ECM相關蛋白,介導細胞之間的相互作用和生化信號傳遞[24]。水凝膠所具有的三維結構與ECM極為相似,ECM主要由水、纖維蛋白(如膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白)和蛋白聚糖(如HA等)組成,是細胞生長微環境的關鍵組成部分,并形成一個復雜的三維網絡[25]。

通過不同的脫細胞方法可以從組織中有效去除細胞核成分,同時保留有益于細胞生長的成分,如生長因子、活性蛋白等,因此脫細胞外基質(decellularized extracellular matrix,DECM)以其獨特的組成和結構為細胞提供了一個原生的細胞微環境,適宜細胞生長[26]。DECM凝膠被認為是一種具有潛力的生物材料,既可以單獨使用,也可以與組織工程或再生醫學領域的其他生物制劑結合使用。

3 基于水凝膠用于角膜替代物的探索

人工角膜的合成必須要考慮角膜天然的生物特性,例如生物力學(黏彈性、應力松弛、蠕變和各向異性)、透氧性、透明度以及與宿主細胞的相容性等。由于角膜結構的復雜性,水凝膠人工角膜的設計目前多為板層或局灶性修復植片,如Shirzaei Sani等[27]設計了一種基于明膠的黏附生物材料—GelCORE(角膜再生凝膠),該凝膠材料暴露于波長450～550 nm的可見光后短時間進行光交聯。光交聯完成后,可以形成牢固黏附于角膜組織的固體透明水凝膠,既可用于傷口的對合,又可用于角膜基質缺損的快速和長期修復。但單獨使用明膠材料的不足在于無法提供一個足夠的支撐力,以及無法保證在溫度變化的情況下保持明膠的性狀。為克服這一缺點,Chen等[28]以膠原蛋白和PVA為原料制作互穿聚合物網絡水凝膠,在一定程度上提高了凝膠的機械能力。為了評價水凝膠植入角膜基質遠期的效果,Zheng等[29]以聚乙二醇和聚丙烯酸制備30～40 μm水凝膠薄片植入兔角膜基質,觀察了最長16個月的效果,結果表明水凝膠薄片保持了較好的透明性,但其他一些并發癥,如角膜上皮缺損、混濁等有待解決。

研究證明,與聚合物材料相比,以DECM為材料制備的人工角膜具有更高的透明性,更有利于細胞的增生和生長[30]。Uyanklar等[31]將牛角膜脫細胞化制作支架材料,再以GELMA水凝膠重懸牛角膜基質細胞,與脫細胞支架在不同紫外光強度下交聯,評估混合角膜支架材料的透明度和再細胞化的問題,結果顯示所得混合角膜材料的透明度有了大幅度提高。Wang等[32]利用脫細胞的豬角膜基質制作水凝膠,并以1-環已基-2-嗎啉乙基碳二亞胺對甲苯磺酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺為交聯劑用于兔角膜局灶性淺層缺損的修復,術后角膜上皮在3 d內完全再生,術后12周角膜上皮和基質的厚度恢復,未見明顯炎癥反應,進一步證明了脫細胞水凝膠作為工程支架用于角膜修復的安全性和有效性。

4 基于凝膠生物墨水的3D打印人工角膜

3D打印也被稱為增材制造或快速制造,在過去的十余年中,一些關鍵專利的到期以及技術進步和成本降低,例如消費者級3D打印機的出現為3D打印的普及提供了技術支持,推動了3D打印在再生醫學領域的廣泛應用[33],該技術已成功應用于骨科、脊柱外科、頜面外科、神經外科、心臟外科以及其他學科相關科室[34]。3D生物打印的目標是制造支架來修復或替換受損的組織和器官[35]。目前,3D打印形式主要有噴墨、擠出和立體光刻等。

噴墨式打印分為熱擠壓和電壓式2種類型。在熱噴墨生物印刷中,將一種可包含細胞的預聚體溶液(稱為生物墨水)裝入墨盒中,墨盒被放置在由電腦控制的打印頭內,打印頭內的熱量產生的氣泡會噴射出少量的墨水滴。液滴的大小可隨油墨黏度、脈沖頻率和應用溫度梯度的變化而改變[36];壓電噴墨生物墨水的工作原理是在生物墨水的壓電晶體上施加不同的電位,從而產生從噴嘴噴出生物墨水滴所需的壓力。噴墨生物印刷的主要優點是其制作速度快和設備的價格低廉[37]。

擠壓生物打印是噴墨生物印刷的先進版本,使用氣動(氣壓)或機械(螺桿或活塞)系統來分發生物墨水。使用氣動(氣壓)通過連續的空氣壓力將墨水從噴嘴或針頭擠壓出來形成連續不斷的長絲,因此可以盡可能保證產品的完整性[38]。

立體光刻基于液態的光敏樹脂,通過光源(例如紫外光或激光)的選擇性聚合以產生所需的圖案[39]。打印過程中光會根據計算機輔助設計(computer aided design,CAD)模型選擇性地聚合樹脂,新的一層被連續打印在之前的層上,最后一個連續的3D打印對象被復制出來。立體光刻技術具有打印速度快、精度高等優點,但每種打印機各有優勢和不足,需要權衡考慮。

生物油墨是3D生物打印的重要組成部分,對3D打印的成功與否至關重要。生物油墨作為印刷材料必須具有一定的特性,如生物相容性(植入后不會引起任何免疫或不良反應)、可打印性(作為打印材料)和堅固性(抵抗環境的物理力量)。但生物墨水的選擇還需要考慮包括黏度、屈服應力和動態頻率下的響應等一系列因素。水凝膠因其出色的溶脹特性和與組織的相容性而被認為是最有希望的墨水材料[40]。

用于3D生物打印的生物墨水中通常添加人組織來源或動物來源的細胞,一般選取具有干細胞活性的細胞,如角膜緣上皮干細胞、人類脂肪組織衍生干細胞或角膜來源基質細胞等[41-43],以期能夠選擇最佳的打印材料,進而提高打印角膜與受體的相容性。3D打印可以從不同的空間維度構造立體圖案,角膜的真實數據,如角膜曲率、大小,可以通過角膜地形圖等臨床檢查設備獲取,再通過CAD軟件建模,最后將圖片轉化為計算機可識別的G代碼文件,通過3D生物打印機進行打印。為了盡可能地減小打印過程對細胞的損傷并提高細胞的遠期存活率,通常選用噴墨或擠出式打印方式[44]。

Isaacson等[45]使用雙擠壓3D生物打印機打印角膜基質結構,驗證了以生物墨水為原料打印角膜基質的可行性,還原角膜表面形貌很難由單一的打印機完成,Zhang等[46]的實驗充分利用了擠出式打印機和數字光處理打印機的各自優點,以海藻酸鈉和GELMA分別打印了角膜的中央部分和周邊部分,更加準確地模擬了天然角膜的曲率和厚度。Kilic等[43]以負載人角膜基質細胞的GELMA水凝膠為材料進行3D打印,打印后的角膜替代物具有出色的透明性、足夠的機械強度和較高的細胞生存能力,進一步證明了GELMA水凝膠與3D打印制備人工角膜的可行性和優越性。3D打印的優勢在于批量生產精準制造,Kutlehria等[47]使用預先制作的6～12個角膜模具,利用擠出式打印機在模具內進行連續打印,達到了高通量制備人工角膜的目的,不僅保證了打印效果,而且節省了時間。

5 展望

水凝膠作為一種生物相容性良好的組織材料,已經在各個行業得到推廣應用,尤其在組織工程領域,更是展示出了其作為生物材料潛在的應用價值。人工角膜的制備是一個精細的系統工程,既要有穩定的支架結構,又要兼顧角膜的生理功能,應用于臨床還有一段很長的路要走。但水凝膠與3D生物打印的結合為人工角膜的制備提供了現實可能,尤其伴隨著智能材料、4D打印時代的到來,更是為這一目標的實現增添了新的動力。相信隨著水凝膠材料不斷改進和科技的迅猛發展,其將在組織工程和人工角膜制備領域扮演重要角色,助推人工角膜合成技術的快速發展,真正造福于人類。

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