角膜緣干細胞缺乏動物模型建立方法研究進展

郭笑霄 綜述 李新宇 審校

華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院眼科,武漢 430030

角膜緣干細胞缺乏(limbal stem cell deficiency,LSCD)是由于角膜緣干細胞(limbal stem cell,LSC)數量減少和/或功能異常導致的角膜上皮穩態失衡,臨床上表現為角膜上皮細胞結膜化、持續或反復的角膜上皮缺損,可伴有角膜新生血管、眼表炎癥反應或角膜瘢痕的形成,最終可導致角膜盲[1]。根據病因,LSCD分為獲得性LSCD和遺傳性LSCD兩大類,目前在我國眼表化學燒傷和熱燒傷是LSCD的首要病因。根據角膜上皮結膜化的受累范圍是否為全周累及,LSCD可分為部分性和完全性兩大類。根據臨床檢查發現的角膜和角膜緣受累程度,LSCD國際共識進行了臨床分期,其中病變未累及視軸或角膜中央直徑5 mm區域為LSCD Ⅰ期,累及角膜中央直徑5 mm區域為LSCD Ⅱ期,累及全角膜為LSCD Ⅲ期。LSCD的分類及分期對于選擇治療方式和設計手術方案至關重要[1]。目前,LSCD的治療主要是通過手術行角膜緣干細胞移植(limbal stem cell transplantation,LSCT),由于LSCT需要切取健康的角膜緣組織進行移植,該治療方式本身會對供給處角膜緣造成創傷;此外,對于單次LSCT未能治愈的LSCD,需多次重復手術,而健康的角膜緣組織來源比較受限。因此,利用培養的LSC進行移植也被推薦用于LSCD的治療[2-4],但遠期效果并不明確,依然面臨著諸多挑戰[5]。因此,需要進行更為全面的基礎研究,對LSCD的發生機制及發展演變過程進行更為深入的探索。而建立理想的動物疾病模型是對LSCD進行細胞水平和分子水平研究以及評價新的治療措施必不可少的方法和手段。近年來,國內外許多研究對LSCD的造模方法進行了報道,涉及了不同動物種類、不同干預方式。本文綜述了近年來LSCD研究常用的動物模型,總結分析動物模型的建立方法、優缺點以及用于研究LSCD的動物和類型選擇,以期為后續研究人員構建合適模型提供參考。

1 LSCD動物模型的建立方法

1.1 機械法造模

1.1.1手術刀等工具刮削造模 1971年,Davanger等[6]首次提出LSC位于角膜緣組織Vogt柵欄內,早期研究LSCD的方法主要通過機械方法去除角膜緣組織。手術切除角膜緣上皮,鈍刀片、鈍鏟或新月形刀去除角膜緣組織都曾被用于制作LSCD模型[7-10]。

Gipson等[8]最早開始利用鈍刀片刮除角膜上皮及角膜緣組織,用于研究角膜上皮的遷移愈合情況。劉先寧等[11]用機械法進行新西蘭白兔LSCD造模,研究者提出了2種造模方法:(1)單純去除角膜緣內外寬約2 mm、深100～150 μm的角膜緣淺板層組織;(2)在上述方法的基礎上去除中央角膜深100～150 μm的淺板層組織。該研究顯示,單純去除角膜緣淺板層組織的動物模型成功率為40%,造模成功需耗時(29.5±1.3)d;而角膜緣聯合角膜中央淺板層組織共同去除的造模成功率為100%,造模成功需耗時(15.8±0.8)d;因此,2種方法都證實了機械法進行兔LSCD造模的可行性,此外角膜緣聯合中央角膜淺板層組織去除既可提高造模成功率,又可縮短造模時間。隨后,柯紅琴等[12]也采用角膜緣聯合中央角膜淺板層組織的方法對日本大耳白兔進行造模,該團隊切除了厚100～150 μm的角膜緣內1 mm、外2 mm的角膜緣淺板層以及厚約100 μm的中央角膜淺板層組織,在手術2周時造模成功率為12.5%,但在5周時可提高到87.5%。

以上2個研究團隊使用了相同的方法造模,但是造模成功率和成模時間有明顯差異。分析產生差異的可能原因為:(1)不同的研究團隊、不同的操作者在造模過程中操作細節有差異;(2)2個團隊使用的動物品種不同,而不同物種的角膜厚度可能存在一定差異。據報道,日本大耳白兔的中央角膜厚度為(382.0±25.1)μm[13],而新西蘭白兔中央角膜厚度為(356.8±25.6)μm[14]。故在切除相同厚度的淺板層角膜緣組織的情況下,新西蘭白兔損失的角膜組織更多,可能對模型的成功有一定影響。

為了對角膜緣及中央角膜進行規則地切削并保證切削后角膜表面的平整性,藺琪等[15]先借助9 mm環鉆標記并去除新西蘭白兔中央角膜上皮,然后再向周邊薄板層剖切至角膜緣外1 mm,深度達淺基質層,為0.1～0.2 mm,并環形剪除,該研究造模成功率為84.2%,較劉先寧等[11]研究的造模成功率稍低,這可能與中央角膜切削深度不同有關。

此造模法應用的時間較久,建模方法成熟,可靠性高;對基質的損傷小,角膜基質微環境保存良好。該系列方法缺點包括:(1)鈍刮刀等機械去除角膜上皮的方法易導致損傷不均勻,尤其近角膜緣處。該方法的改良可以參考藺琪等[15]提出的環鉆劃界加板層切除法,以期得到更平整的角膜。(2)手術中不可避免地殘留有LSC和角膜上皮細胞,殘留細胞借助于基底層重建了完整的角膜上皮層,致使一部分動物模型制作失敗[9,16]。(3)對術者的技巧要求高,增加了可重復性難度。在進行角膜緣切除術時,可能導致基質損傷、前房穿孔,造成嚴重的機械損傷。

1.1.2旋轉毛刺工具造模 使用旋轉毛刺工具(AlgerBrush Ⅱ)是目前制作角膜損傷的首選方法[17-19]。Li等[20]將AlgerBrush Ⅱ旋轉毛刺作為誘導新西蘭白兔LSCD的造模工具,同時與手術和化學法進行了比較,結果發現旋轉毛刺工具造模更安全、更有效。其具體方法:每次清創前在距角膜緣約1.5 mm處進行全周結膜切開,使用1 mm尖頭鉆的AlgerBrush Ⅱ進行360°角膜緣切除,然后使用2.5 mm圓頭鉆去除剩余的角膜上皮,或直接用2.5 mm圓形鉆頭360°去除淺層角膜緣及整個角膜上皮;最后用生理鹽水沖洗眼表,使用潤濕的棉簽去除眼表的碎屑。但是,Afsharkhamseh等[21]利用毛刺旋轉工具制作小鼠LSCD模型時,發現必須經過多次重復清創,才能徹底地去除角膜緣細胞。

此造模法的優點是操作相對簡單、一致性較好、穩定時間較長[16]。相比機械刮削工具損傷更均勻,同時可以去除基底膜;相比化學造模法,對角膜基質層或其他眼內結構的損傷小,術后出現炎癥和瘢痕的可能性小,更有利于結果的判讀及評估[22]。其缺點是有細胞殘留可能,需反復多次清創;同時,毛刺的速度、放置的角度、施加在角膜上的壓力以及停留的時間等因素對于實驗結果影響較大,這也可能是不同研究結果之間存在差異性的潛在原因之一[23]。

1.2 灼燒法造模

通過灼燒破壞角膜緣組織是建立熱損傷誘導LSCD的一種方法。Majo等[24]為了模擬小鼠的LSCD,對野生型小鼠的角膜緣組織進行灼燒,由于灼燒的不可控性,導致角膜緣上皮及基質層完全受損,甚至傷及睫狀體。隨后,Afsharkhamseh等[16]將灼燒法進一步改進并與AlgerBrush Ⅱ工具相結合,建立C57BL/6J小鼠LSCD模型。該研究利用AlgerBrush Ⅱ去除角膜緣和中央角膜上皮后,使用一種可調節的電燒灼器對角膜緣進行受控熱損傷,并通過研究得出致角膜損傷但又不穿孔的最佳溫度為(50±1)℃。其具體操作方法是把一根彎曲的長約1.5 cm的實心銅線一端綁在灼燒器上,形成一個細且鈍的尖端,使其加熱150 ml的水,通過測量水溫來間接測量尖端的溫度,然后作用于角膜緣2～3 s來誘發角膜緣損傷。

此造模方法較為復雜,操作難度較大;并且由于灼燒導致的熱損傷可加重角膜混濁的程度,模型的損傷也更嚴重,故此模型更適合用于模擬基質損傷及愈合反應等研究。

1.3 化學法造模

1.3.1堿燒傷法造模 化學性燒傷角膜組織是制作LSCD實驗模型的常用方法之一,尤其是使用堿性試劑[25-26]。其主要原理是破壞角膜緣和角膜上皮及其基底層,使殘留的LSC不能再次建立完整的角膜上皮層。

NaOH是化學造模法中常用的一種試劑,目前常用于眼表灼傷的NaOH濃度主要為1 mol/L和0.5 mol/L,處理時間為20、30、45和60 s,濃度和時間根據模型動物角膜厚度會有一定區別[27]。盧建民等[28]利用圓形濾紙片對新西蘭白兔進行角膜緣干細胞缺損模型的制備。具體方法:全身麻醉后,將直徑8 mm圓形濾紙片用1 mol/L NaOH浸濕,瀝干后覆蓋于角膜中央1 min,生理鹽水沖洗角膜表面和結膜囊3 min,再用無菌干棉球吸干,虹膜復位器刮拭角膜表面,去除全部角膜上皮層。出現角膜深實質層水腫、混濁呈瓷白色,虹膜紋理窺不清及角膜緣缺血視為造模成功。郭濱等[29]將18只新西蘭白兔隨機分為3個組,分別用外徑為16 mm、內徑為8 mm的1 mol/L NaOH溶液浸泡的環形濾紙在角膜緣貼附60 s并結膜囊內滴入30 s、角膜緣貼附30 s并結膜囊內滴入30 s、僅角膜緣貼附30 s,結果發現結膜囊滴入NaOH溶液的組均不同程度地出現了角膜穿孔、眼球萎縮、瞼球粘連等并發癥;而僅進行角膜緣堿燒傷的兔在第4周行激光掃描共聚焦顯微鏡檢查發現角膜緣柵欄結構消失、角膜結膜化,角膜上皮中出現杯狀細胞。研究證明了環形濾紙浸潤NaOH溶液燒傷角膜緣組織,可以成功構建LSCD動物模型,同時也表明聯合結膜囊滴入NaOH溶液可導致廣泛的組織損傷及壞死。不同物種之間對堿燒傷造模引起的LSCD特征中存在一定差異。Kethiri等[30]通過單眼滴入1 mol/L NaOH溶液進行堿燒傷30 s,然后用生理鹽水沖洗,并將C57BL/6小鼠和新西蘭白兔的LSCD堿燒傷模型與化學燒傷誘導的人LSCD角膜進行比較,結果顯示小鼠和兔角膜新生血管發生率分別為50%和67%,而人角膜全部出現新生血管;小鼠和兔角膜均有67%可能出現基質炎癥反應,而人角膜則全部出現炎癥表現;三者分別有50%、50%和83%的角膜中存在杯狀細胞。研究數據表明,小鼠、兔和人在堿燒傷造模引起的角膜血管化程度、炎癥和杯狀細胞形成等結果中存在顯著差異。因此,在利用動物模型獲取LSCD結果類推到人眼時,要注意這些差異的影響。

Zhang等[27]利用NaOH燒傷法造模,同時與機械法切除角膜緣及角膜上皮制作的完全性兔LSCD模型進行了比較,結果表明堿燒傷組的角膜混濁、新生血管化程度較機械切除組嚴重,適合用于與新生血管相關的研究;而角膜緣機械切除聯合上皮刮除對角膜基質的損傷較小,角膜基質的微環境保存良好,更適合于研究干細胞的分化、轉化、干細胞相互作用、微環境及干細胞替代療法。

KOH溶液與NaOH同為強堿性物質,也是常被用于造模的化學試劑品之一。Li等[3]采用1 mol/L KOH溶液浸泡后的直徑4 mm的圓形濾紙灼燒顳上方角膜30 s,隨后立即用100 ml生理鹽水沖洗,建立兔部分性LSCD模型;高晴琴等[31]也用了同樣的方法建立新西蘭白兔部分性LSCD模型,除麻醉意外死亡的實驗兔外,所有實驗動物均造模成功,且在觀察的2個月時間內,未出現角膜穿孔情況。該研究團隊還將此方法用于建立C57小鼠的LSCD模型,將直徑為3 mm的圓形濾紙片用1 mol/L KOH溶液浸潤后,作用于中央角膜表面30 s,用20 ml生理鹽水充分沖洗,麻醉后順利蘇醒的24只小鼠,僅2只分別在第7天和第14天出現了角膜穿孔,其余22只發生不同程度完全性LSCD,誘導成功率為92%[31]。

堿燒傷法造模的優點是操作簡單,易實施,病因與臨床病例的吻合度較高;但此方法的一個重要缺點是結果的不可預測性,因為難以控制化學損傷的深度及程度,存在對深層基質或周圍組織造成溶解、穿孔或損傷的風險,難以保證模型的統一以及避免堿燒傷的后續影響。

1.3.2苯扎氯銨造模 化學灼傷和機械去除角膜緣組織誘導動物獲得的LSCD模型,均屬于急性角膜破壞,對局部組織損傷過重,伴隨較重的炎癥反應。然而,對于需要研究眼表慢性及長期損傷形成LSCD的模型并不合適,可考慮采用目前研究較多的苯扎氯銨溶液造模。

苯扎氯銨是滴眼液中常用的防腐劑,由于存在細胞毒性,長期使用含防腐劑的外用藥物是多種眼表疾病的潛在風險,往往導致角膜上皮、內皮、結膜以及支配神經出現不同程度的損傷[32]。Pauly等[33]系統地研究了長期給予不同劑量的苯扎氯銨溶液對大鼠眼表的毒性作用,觀察到了角膜上皮侵蝕、炎癥反應以及新生血管的形成。Lin等[34]將苯扎氯銨配置成不同濃度的滴眼液點眼,分別為0.1%、0.25%、0.5%,每天4次,持續28 d,結果顯示使用0.5%的苯扎氯銨溶液成功誘導BALB/c小鼠出現了LSCD的典型表現,包括角膜新生血管、基質炎癥反應和彌漫的上皮缺損等,證實了長期給予防腐劑苯扎氯銨可以誘導BALB/c小鼠LSCD。

此造模法雖然操作簡單,但造模周期較長,時間和經濟成本較高,比較適合于需要探索LSCD慢性發展及機制演變過程的研究。此外,該造模方法所造成的病變部位難以完全集中在角膜緣及角膜,可能造成整個眼表結構的損傷。

1.3.3硫芥子氣造模 硫芥子氣是一種能對人體皮膚、呼吸道及眼等器官產生損害的烷化劑,可以液滴態、霧態、蒸氣態長期儲存,損傷眼部時可導致角膜上皮反復糜爛、延遲不愈,故也被用于LSCD的研究[35-36]。Kadar等[36]將新西蘭白兔眼暴露于10 μl純度超過95%的硫芥子氣蒸氣中4 min,在暴露后的4 h～4周的不同時間點對眼進行組織學和分子生物學評估,結果發現與角膜中央上皮的損傷不同,LSC在硫芥子氣暴露后的急性期并未受到損傷,而是在暴露2周后,干細胞逐漸丟失,表現出LSCD的典型癥狀,這表明與硫芥子氣眼部毒性相關的LSCD并非源自直接的細胞毒性,而是由于角膜緣基質的病變致使微環境異常,從而導致細胞損傷。此造模方法目前實際應用較少,主要用于再現士兵在戰爭中眼部損傷情況的相關研究。

1.4 化學+手術切除法造模

手術切除角膜緣可以與正庚醇、甲醇等有機溶劑相結合,首先利用有機溶劑去除角膜上皮,再通過手術去除角膜緣[37]。Chen等[7]使用正庚醇聯合機械方法進行全角膜上皮清除,發現不同持續時間的正庚醇處理方法可導致不同程度的角膜結膜化及血管化。Avila等[38]用此方法建立了新西蘭白兔的LSCD模型,具體操作是先用正庚醇去除角膜上皮,然后全周板層切除角膜緣上皮;為確保完全破壞角膜和角膜緣上皮,3周后重復上述步驟。術后1個月所有眼均出現中至重度角膜新生血管,伴表面不規則及角膜混濁,造模成功率為100%。隨后,Sitalakshmi等[39]用同樣的方法建立兔完全性LSCD模型,術后2～3周,角膜表面逐漸不規則、基質混濁,角膜結膜化導致上皮屏障不良,熒光素染色呈陽性;印跡細胞檢查示結膜杯狀細胞存在于角膜表面。

此造模法的優點是使用正庚醇去除角膜上皮是一種簡單、易行、有效的方法,正庚醇處理后的角膜無上皮細胞殘留,基質面光滑,細胞結構完整規則,適于干細胞貼附、移植等相關研究;缺點是角膜緣環形切除的厚度可能與正庚醇去除上皮的厚度不一致,導致中央出現一個較高的角膜淺基質島,使新生血管難以長入角膜中央,多沿周邊環形生長,故可能對模型的評分和確立產生一定影響[15]。

1.5 基因敲減法造模

除了上述方法造模外,還可以將攜帶Pax6敲低基因的小鼠模型用于研究角膜上皮傷口愈合及其對無虹膜相關LSCD的潛在影響[40];也有研究者研究斑馬魚模型中與角膜營養不良有關的其他基因[41]。由于LSCD的遺傳病因較少,由突變引起的LSCD表型可能不那么嚴重;并且轉基因動物難以生產和飼養,故遺傳模型的使用率較低。

LSCD動物模型不同造模方法、優缺點、適用范圍、具體方法、動物種類等信息詳見表1。

表1 LSCD動物模型

2 LSCD模型的動物選擇

關于LSCD模型動物的選擇要求包括:(1)所選的動物應盡量與人體的生理學、解剖學、基因學等特點相近;(2)要考慮實驗動物的倫理、來源、經濟成本、飼養難度以及造模操作難度等問題;(3)動物的建模周期、重復性、成功率、死亡率等因素應控制在最佳水平;(4)在建立動物模型后,能夠比較全面地模擬人類疾病發生和發展過程以及病理生理變化是要考慮的重要因素。

目前,研究LSCD的動物模型主要限于少數哺乳動物,如小鼠、大鼠、兔和山羊等。其中,兔是常選動物之一,并且也常用于研究其他眼表疾病,如淚膜、結膜、角膜疾病等[12,16,21,31,39]。分析其原因:(1)兔的角膜大小與人類相似,因此有利于成功造模和手術操作。(2)兔性情溫順,極少傷人,在制作LSCD模型時更易操作和觀察,拍攝照片時也更加清晰。因此,兔是建立角膜疾病動物模型的首選動物[16]。但是,Ti等[42]在建立完全性LSCD兔模型時,發現鼻側的新生血管多于其他方向,考慮與兔眼存在瞬膜有關;因此在用兔眼造模時,建議去除瞬膜,避免影響操作及觀察記錄。

其次,小鼠也是制作LSCD模型的常選動物之一[17,22,25,34]。小鼠經濟且容易獲得,既能模擬人類的表型,又能持續足夠長的時間,適合用于研究疾病的病理生理學以及新療法的評估;同時,小鼠可供選擇的抗體較兔齊全,有利于在同類研究中的比較。缺點是小鼠眼球較小,進行操作、測量新生血管面積及照相的難度較大;尤其在使用化學試劑誘導LSCD造模時,堿液可能會累及小鼠結膜,導致瞼球粘連等病變,故利用化學法造模時不適合選取小鼠作為動物模型。另外,值得注意的是,小鼠角膜緣缺乏柵欄狀結構,并且角膜緣起始處前彈力層的位置與人類不同,因此在類推到人類時要注意這些差異的影響[43-44]。

另外,山羊也被用于建立LSCD模型,但山羊造模價格昂貴,體型較大,活動度大,麻醉時可能導致效果不理想,必須在全身麻醉聯合球周麻醉下進行,給實驗操作帶來一定難度,因此使用山羊做此類研究較少[45-46]。

除了哺乳動物模型外,水生動物斑馬魚和兩棲動物非洲爪蟾也用于LSCD的相關研究。其中,非洲爪蟾的角膜形態和發育在很大程度上與人類相似[47-48],這使其成為研究角膜上皮、干細胞等角膜疾病病理學的合適模型,主要用于發育機制、再生、細胞重編程及細胞克隆等方面的研究[49-50]。

3 LSCD模型的類型選擇

根據LSCD角膜上皮結膜化的受累范圍,可將LSCD分為部分性及完全性兩大類。部分性LSCD的特征是角膜上皮部分結膜化,留有部分功能正常的角膜緣以產生正常的角膜上皮細胞;完全性LSCD是指角膜緣360°干細胞丟失,角膜表面完全被結膜上皮覆蓋。

根據目前的研究報道,完全性LSCD模型的研究要多于部分性[17,51-54]。但是制作完全性LSCD模型在控制病變部位、觀察實驗結果以及檢驗治療效果時,因其較重的眼表損傷,往往具有一定的局限性,尤其在利用角膜化學傷誘導LSCD時,往往角膜損傷范圍較大合并嚴重的角膜基質混濁,甚至出現角膜潰瘍、穿孔等導致造模失敗。例如,郭濱等[29]應用不同堿燒傷方法制作兔完全性LSCD模型時,由于NaOH在角膜緣停留時間過長,6眼全部出現角膜穿孔、眼球萎縮而造模失敗;Ma等[55]在研究骨髓間充質干細胞重建大鼠化學燒傷眼表模型時發現,36%的大鼠因出現了嚴重的前房積膿、前房積血或角膜穿孔而造模失敗。

而建立的部分性LSCD模型,角膜容易暴露便于觀察,眼前節照相時動物配合情況相對較好,操作時易精確控制部位和時間,成功率高。其中,化學法是制作部分性LSCD模型的常用方法之一。例如,高晴琴等[31]在制作兔部分性LSCD模型時,采用堿燒傷造模方法,作用于顳上方角膜。造模后2個月時,2只新西蘭白兔角膜新生血管累及2個象限,其余10只均累及1個象限,平均累及(1.17±0.39)個象限。同時,動物模型的損傷比較局限,相比于完全性LSCD,能更早地進入無充血、角膜上皮化的炎癥穩定階段,便于獲取眼表改善、視覺改善等陽性指標,有利于客觀定量評價治療效果。在研究LSCD微環境重建,如角膜緣微環境細胞的移植時,更適合采用仍存有部分自體LSC的部分性LSCD模型[31]。

4 結語

LSC位于角膜緣上皮基底層的特殊結構“Vogt柵欄”處,屬于成體單能干細胞,是正常角膜上皮細胞增生和分化的來源[56-57]。臨床上,角膜直接損傷或角膜干細胞微環境破壞均有可能導致LSCD的發生。建立理想的LSCD動物模型是研究LSC的生理、病理以及觀察體外構建的角膜組織移植效果的基礎。

文中系統闡述給予不同的方法(機械法、灼燒法、化學法、化學+手術法、基因敲減等)建立的LSCD動物模型,以及LSCD動物種類的選擇及制作類型的選擇。機械法應用時間較久,建模方法成熟,可靠性高,但具有侵入性,可能會導致基質損傷、前房穿孔等嚴重并發癥,對操作者個人技巧要求較高。其中,使用旋轉毛刺工具造模是目前推薦制作角膜損傷的首選方法,損傷均勻創傷小,結果可控性強,但對于工具的使用需要一定的經驗。灼燒法造模表型穩定,但操作復雜,熱損傷的可控性差?；瘜W方法破壞角膜組織是一種快速、操作簡單的方法,且病因與臨床病例的吻合度較高,但損傷的深度及范圍控制困難,難以保證模型的統一,需在操作精確度方面進一步改進?；瘜W+手術法在上述造模手段的基礎上進一步改進,研究結果也證明其可行,此方法造?；|表面光滑,細胞結構完整,但易形成角膜中央基質島,影響新生血管生長?；蚯脺p法由于操作較為復雜,造模動物難以產生和飼養而相對應用較少。

綜上所述,LSCD動物模型用于相關研究多年,提升了臨床及科研人員對LSCD的理解、研究和治療。但是,目前造模方法眾多,許多研究在進行LSCD診斷時對角膜印跡細胞學檢查應用不足,導致各研究造模質量參差不齊。因此,仍需要進一步深入探索,建立更理想、更完善的動物模型為LSCD的基礎及臨床研究提供更有價值的幫助。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突