肺腺癌中FAT1的表達及其與免疫細胞浸潤關系的研究

丁晨 趙文浩 黃華 李永文 張展瑞 張芮豪 王亞楠 吳迪 陳琛 劉紅雨 陳軍

肺癌是全世界癌癥相關死亡的主要原因[1]。肺癌通常分為兩個主要類型：非小細胞肺癌（n o nsmall cell lung cancer,NSCLC）和小細胞肺癌，其中NSCLC約占肺癌患者的85%，分為肺鱗癌（squamous cell carcinoma,SCC）、肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）和大細胞肺癌。肺癌的發展通常伴隨著腫瘤細胞的侵襲和轉移，是肺癌病情嚴重程度和治療效果的重要影響因素。肺癌的發生和發展涉及多種分子、細胞和組織的相互作用，因此急需探索潛在的分子靶點，以改善肺癌的治療。

非典型性鈣黏蛋白1（FAT atypical cadherin 1,FAT1），是一種受體樣蛋白，屬于FAT家族的一部分，FAT家族包括FAT1、FAT2、FAT3和FAT4四種蛋白[2]。這一家族的蛋白在多種生物學過程中發揮重要作用，特別是在細胞黏附、細胞增殖、分化和組織發育方面[3]。FAT1是一種常見于上皮組織中的跨膜蛋白，其功能包括黏附分子和信號傳導受體[4,5]。FAT1還參與細胞-細胞黏附的形成，抑制FAT1的表達會導致細胞連接的不穩定性下降，進而破壞細胞的極性[3]。既往研究[6-10]表明，FAT1在不同類型的腫瘤中發揮著截然不同的作用，一般認為它在宮頸癌、頭頸鱗狀細胞癌、口腔癌和乳腺癌中發揮抑癌作用，其功能缺失可能促進腫瘤細胞的進展。FAT1功能喪失促進鱗狀細胞癌的發生、進展、侵襲性、干性和轉移[11]。FAT1通過激活Hippo信號傳導來抑制NSCLC細胞的腫瘤初始能力[12]。相反的是，FAT1可以調控急性髓系白血病的進展，被認為是急性髓系白血病的癌基因[13]。FAT1可通過調節膠質母細胞瘤的干細胞相關基因的表達來發揮致癌作用[14]。FAT1可促進肝細胞癌的增殖和遷移，并抑制細胞凋亡[15]。但是，FAT1對肺癌的影響以及機制尚不清楚，尚需進一步探索。進一步研究FAT1和肺癌之間的關系對于揭示肺癌的生物學機制和潛在治療靶點至關重要。在課題組之前的一項研究[16]中，我們揭示了FAT1突變作為NSCLC生物標志物，有助于識別不太可能從免疫檢查點抑制劑中持續臨床獲益的患者，從而有助于個體化免疫治療方案的制定。FAT1突變的NSCLC患者腫瘤突變負荷高、免疫應答細胞浸潤增加、免疫抑制細胞浸潤減少，同時具有更好的免疫原性和免疫治療效果[17]。腫瘤浸潤免疫細胞存在于癌癥的各個階段，在調控腫瘤生長中起著重要作用。然而，FAT1與腫瘤免疫細胞浸潤豐度的關系還不清楚，急需進一步研究。

此研究旨在通過多數據庫生信分析，闡明FAT1在LUAD中的表達、突變等情況，進一步探索其可能影響的通路及其和免疫浸潤細胞的關系，通過實驗驗證FAT1在LUAD細胞中的表達，探討其成為NSCLC治療的潛在分子靶點的可能性。

1 資料與方法

1.1數據獲取 本研究中有關LUAD患者的數據來源于癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas,TCGA）（https://cancergenome.nih.gov）和基因型-組織表達（Genotype-Tissue Expression,GTEx）數據庫，共納入了910個（513例LUAD樣本，397例癌旁樣本）樣本記錄，包括基因表達數據以及相應的臨床信息。

1.2基因突變分析 使用cBioportal（https://www.cbioportal.org）數據庫探討LUAD患者FAT1的基因改變[18]。為了獲得cBioportal中的基因變化，首先從TCGA數據庫獲得LUAD患者的體細胞突變數據，然后使用GISTIC算法推測出拷貝數變化，以及相對于所有樣本的mRNA表達z-score（log RNA Seq V2 RSEM）。最后選取患者集作為所有樣本，輸入FAT1，得到LUAD患者中FAT1基因突變比例和類型。此外，通過“maftools”包繪制瀑布圖來展示FAT1高表達組和低表達組患者的基因表達情況。

1.3差異基因分析和通路富集分析 使用“limma”包[19]，對FAT1高表達組與低表達組的基因進行差異分析，采用Log2|FC|＞1為截斷值，計算兩組之間的差異基因。使用“clusterProfiler”包，對這些差異基因進行GO功能分析以及京都基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）分析。此外，使用基因集c2.cp.kegg.v7.4.symbols.gmt進行基因富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA），探究FAT1潛在參與的通路。

1.4免疫細胞浸潤分析 使用ESTIMATE以及單樣本GSEA（single-sample GSEA,ssGSEA）計算TCGA LUAD患者中的免疫評分和免疫細胞浸潤豐度。

1.5免疫組織化學染色 組織芯片包含91對原發性LUAD組織和相應的癌旁組織，購買于賽維爾生物公司（武漢，中國）。對組織芯片進行脫蠟，脫水，然后用1×EDTA在98 °C處理10 min修復抗原。載玻片在3%過氧化氫溶液中孵育以阻斷內源性過氧化物酶。用10%山羊血清封閉后，將組織與抗FAT1（Abcam,ab190242,1:500）在4 °C下孵育過夜。用PBS沖洗后，載玻片與生物素偶聯的二抗孵育，洗滌，并與HRP偶聯的鏈霉親和素孵育。對載玻片進行復染時，采用蘇木素染色法。細胞染色強度分為四個等級，即陰性（得分為0分）、淡黃色（得分為1分）、棕黃色（得分為2分）和棕褐色（得分為3分）。根據陽性細胞百分比進行評分，分為四個等級：≤25%得1分，26%-50%得2分，51%-75%得3分，＞75%得4分。最終評分結果是兩項評分相乘。為避免偏倚，兩位病理學家獨立對每個樣本進行評分。

1.6細胞培養和蛋白質免疫印跡法 細胞系H1650、H1975、A549、H1299、PC9和BEAS-2B購自中科院典藏生物資源保藏中心。這些細胞系在含有10%胎牛血清的DMEM（諾普賽，PM150210）培養基、37 °C和5%CO2的濕潤培養箱中培養。蛋白質免疫印跡法：正常肺上皮細胞系和不同LUAD腫瘤細胞系進行培養后，提取細胞總蛋白，BCA法定量各細胞系總蛋白濃度。每個樣本取20 μg蛋白，用SDS-PAGE電泳后轉膜，含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，抗FAT1抗體（Abcam,ab190242,1:1000）、抗GAPDH抗體（Proteintech,60004-1-Ig,1:1000）作為一抗，4 °C下一抗孵育過夜，使用TBST洗膜3次，每次10 min，將膜與抗兔/小鼠IgG（Abclone，抗兔：AS014；抗鼠：AS003）二抗在室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，在膜上顯影條帶，并使用Syngene G-Box GeneSnap軟件（Syngene,Cambridge,UK）讀取顯影后條帶。

1.7統計分析 所有的分析都是通過R語言4.3.0來進行。Wilcox秩和檢驗用于比較癌和癌旁組織間的基因表達水平，Kaplan-Meier結合Log-rank檢驗來比較不同組間的總體生存率，FAT1免疫反應評分與LUAD患者臨床病理特征的關系使用卡方檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1基因突變分析 使用cBioportal（https://www.cbioportal.org）數據庫，探究FAT1的基因結構和轉錄變化。通過圖1我們發現，14%的患者存在FAT1基因突變，錯義突變是FAT1基因的主要改變形式，其次為深度缺失。

圖1 基因突變分析。cBioportal數據庫中LUAD患者FAT1基因的突變頻率（A）及突變類型（B）。Fig 1 Gene mutation analysis.Alteration frequency (A) and types of alterations (B) in the FAT1 gene in LUAD patients from the cBioportal database.FAT1: FAT atypical cadherin 1;LUAD: lung adenocarcinoma.

2.2FAT1在LUAD細胞系和癌組織中表達較高 采用TCGA和GTEx數據庫對513例LUAD組織和397例正常肺組織的FAT1mRNA表達水平進行對比，結果顯示，FAT1基因在LUAD組織中的表達水平顯著高于正常肺組織，差異具有統計學意義（P＜0.0001）（圖2A）。進一步驗證FAT1mRNA在同一樣本中的癌組織和癌旁組織有著明顯的表達差異，癌組織高于癌旁組織（P＜0.0001）（圖2B）。通過蛋白質免疫印跡法檢測LUAD細胞系H1650、H1975、A549、H1299、PC9和正常肺上皮細胞系BEAS-2B中FAT1蛋白的表達，結果表明LUAD細胞系中的FAT1蛋白的表達明顯高于正常肺上皮細胞系（P＜0.01）（圖2C）。對91對LUAD和癌旁組織進行了免疫組織化學染色，表1總結了這個隊列患者的臨床特征，通過對癌癥患者癌組織和正常癌旁組織的FAT1基因表達水平進行比較分析，發現FAT1基因在癌組織中的表達顯著上調（P＜0.0001）（圖2D）。在高評分組中患者年齡＞60歲的比例更高（P＜0.001），然而在T分期和臨床分期中，患者比例并無明顯差異。

表1 FAT1免疫反應評分與LUAD患者臨床病理特征的關系Tab 1 Relationships between the immunohistochemistry results of the FAT1 and clinicopathological characteristics in LUAD patients

圖2 FAT1在肺腺癌細胞系和癌組織中表達較高。A：TCGA數據庫中FAT1在癌和癌旁組織中的表達情況；B：FAT1在同一癌和癌旁組織中的表達情況；C：蛋白質免疫印跡法顯示正常肺上皮細胞和肺腺癌細胞系中FAT1蛋白的表達差異；D：免疫組織化學染色顯示在肺腺癌組織芯片中，FAT1在癌組織的表達顯著高于癌旁組織（放大倍數：上，×100；下，×200）。Fig 2 FAT1 is highly expressed in lung adenocarcinoma cell lines and cancer tissues.A: Expression levels of FAT1 in cancer and adjacent tissues from TCGA dataset;B: Expression levels of FAT1 in the same cancer and adjacent tissues;C: Western blot showing the differential expression of FAT1 protein in normal lung epithelial cells and lung adenocarcinoma cell lines;D: Immunohistochemical staining demonstrating significantly higher expression of FAT1 in cancer tissues compared to adjacent lung tissues (magnification: upper,×100;lower,×200).**P＜0.01;****P＜0.0001.

2.3FAT1與LUAD患者的預后不良相關 以FAT1表達量的中位數為截斷值，將TCGA 數據庫中LUAD患者分為高、低表達兩組，Kaplan-Meier plotter在線分析繪制LUAD患者的總體生存期曲線。結果顯示，TCGA數據庫中FAT1的表達量與LUAD患者的總體生存期顯著相關，高表達FAT1患者的總體生存期顯著低于低表達患者（P＜0.05）（圖3）。

圖3 FAT1高、低表達組之間的Kaplan-Meier生存分析Fig 3 Kaplan-Meier survival analysis between high and low FAT1 expression groups

2.4FAT1的通路富集分析 為了探索FAT1可能參與的功能通路，對FAT1高表達和低表達組進行了差異分析，得到1452個差異基因（圖4A）。為了探究這些基因的潛在生物學功能，對其進行了GO以及KEGG分析，GO分析結果顯示主要富集在抗菌免疫應答、突觸后膜電位的調節、雌激素代謝過程、消化等通路（圖4B）。KEGG結果顯示這些差異基因主要與中性粒細胞胞外殺菌網形成、系統性紅斑狼瘡、酒精中毒等通路相關（圖4C）。GSEA結果顯示在FAT1低表達組，這些差異基因主要與移植物抗宿主病、核糖體、產生IgA的腸道免疫網絡、抗原加工和呈遞、金黃色葡萄球菌感染等通路相關聯（圖4D）。在FAT1高表達組，這些差異基因主要與尼古丁成癮、系統性紅斑狼瘡、酒精中毒、中性粒細胞胞外殺菌網形成、細胞外基質受體相互作用等通路相關聯（圖4E）。

圖4 FAT1的通路富集分析。A：火山圖展示了癌和癌旁組織之間的差異基因；B：直方圖展示了差異基因的GO分析結果；C：柱狀圖展示了差異基因的KEGG分析結果；D：差異基因分別在FAT1低表達組和高表達組的GSEA分析結果。Fig 4 Pathway enrichment analysis of FAT1.A: Volcano plot showing differential genes between cancer and adjacent tissues;B: Histogram presenting the Gene Ontology (GO) analysis results of differential genes;C: Bar chart displaying the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG) analysis results of differential genes;D: Gene set enrichment analysis (GSEA) results for differential genes in both FAT1 low and high expression groups.

2.5FAT1與免疫細胞浸潤和免疫檢查點的表達密切相關腫瘤微環境對腫瘤的發生發展至關重要。我們進一步評估了20余種類型免疫細胞在FAT1高、低表達兩組之間的浸潤豐度差異，結果顯示，活化B細胞、活化CD8+T細胞、骨髓來源抑制性細胞、單核細胞在FAT1高表達組浸潤豐度更低，而中性粒細胞、II型輔助性T細胞在FAT1高表達組浸潤豐度更高（P＜0.05）（圖5A）。我們對免疫檢查點相關基因在FAT1高、低表達組之間的表達水平進行了比較，結果顯示CD276、TNFRSF14、TNFRSF18、LAG3、PDCD1、TNFSF4的表達水平在兩組之間具有明顯差異（圖5B），提示FAT1的表達與LUAD的發生發展及治療相關。

圖5 FAT1與免疫細胞浸潤和免疫檢查點的表達密切相關。A：箱式圖展示了免疫細胞在FAT1高、低表達組的表達水平；B：箱式圖展示了免疫檢查點相關基因在FAT1高、低表達組的表達水平。Fig 5 FAT1 is closely related to immune cell infiltration and expression of immune checkpoints.A: Box plots illustrating the expression levels of immune cells in FAT1 expression high and low groups;B: Box plots showing the expression levels of immune checkpoint-related genes in FAT1 expression high and low groups.ns: not significant.*P＜0.05;**P＜0.01;***P＜0.001.

3 討論

肺癌的發病率和致死率在全球范圍內居高不下，對公共衛生構成嚴重威脅[20]。FAT1是一種受體樣蛋白，它在肺癌等多種癌癥中引起了廣泛的關注。FAT1基因編碼的蛋白在細胞黏附、細胞增殖等過程中發揮著重要的作用[21]。目前的研究證明FAT1在多種癌癥中發揮癌基因或抑癌基因的作用。因此，闡明FAT1和肺癌之間的關系具有重要意義。

在這項研究中，我們發現FAT1在LUAD組織和癌旁組織之間表達存在顯著差異。這表明FAT1的表達水平可能與LUAD進展有關。這一發現對深入了解FAT1的生物學功能以及其在LUAD發展中的作用方面具有重要意義。Kaplan-Meier生存分析結果顯示，FAT1低表達患者具有更好的預后，這一發現為FAT1作為潛在的肺癌治療靶點提供了依據。通過cBioportal數據庫的分析，研究發現FAT1基因在LUAD組織中存在頻繁突變，其中錯義突變是主要的變化形式，提示FAT1基因可能在肺癌發生發展中扮演重要角色，錯義突變可能對其功能產生負面影響。FAT1在細胞間黏附和間質的調控中發揮作用，影響腫瘤細胞與周圍環境的相互作用。這可能對腫瘤微環境的結構和組織產生影響，影響免疫細胞的浸潤。FAT1突變可能是對免疫治療沒有持久臨床獲益的NSCLC患者的預測性生物標志物[16]。分析表明FAT1的表達水平與程序性死亡配體1（programmed death ligand 1,PD-L1）的表達呈正相關，這可能與腫瘤對免疫治療的響應有關[22]。了解FAT1與免疫治療效果之間的關系有助于預測患者的治療反應。深入研究FAT1在腫瘤微環境免疫浸潤中的機制，有望為開發新的腫瘤治療策略提供重要的信息。

這項研究探討了FAT1基因在肺癌中的作用，包括其表達水平、基因變異以及免疫調控。然而，需要注意的是，盡管我們的研究從多個方面探究了FAT1在LUAD中的表達和功能，但它仍存在一些局限性。首先，這是一項基于數據庫和體外實驗的研究，尚未涉及到體內動物實驗或臨床試驗。因此，雖然我們發現了FAT1與不良預后的關聯，但其具體機制尚需進一步研究，尤其需要深入了解FAT1在體內動物模型中的作用。其次，由于數據僅涉及FAT1基因的表達，我們并未深入探討與FAT1相關的分子信號通路。最后，該研究局限于LUAD，不同類型的肺癌和其他癌癥類型中FAT1的作用仍需要更廣泛的研究?？傊?，這些發現不僅有助于深化對肺癌發展機制的理解，還為開發針對FAT1的治療方法提供了新的線索，具有潛在的臨床應用前景。本研究為肺癌的治療和生存率預測提供了信息，有望為未來的癌癥研究和治療提供有力支持。

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.

Author contributions

Liu HY and Chen J designed the research studies.Ding C,Zhao WH,Huang H and Zhang ZR performed the experiments.Chen C,Wang YN,Wu D,Zhang RH and Li YW analyzed data.Ding C and Huang H wrote the manuscript.Liu HY provided financial support.Liu HY and Chen J supervised the project.All authors made comments on the manuscript.