參芪復方含藥血清對高糖環境下大鼠骨髓EPCs的影響*

何敏慧 高 泓 謝紅艷 謝春光△

研究發現,當血管內皮損傷后,雖然周圍的成熟內皮細胞可通過分裂增殖對其進行修復,但這一作用非常有限,而EPCs才是發揮血管內皮損傷修復的主要力量[1],EPCs通過動員、歸巢、轉化等一系列過程完成血管內皮損傷的修復[2]。調控EPCs干預糖尿病大血管損傷進程的思路成為近年研究熱點。研究發現,通過提高EPCs數量和功能,可以有效改善糖尿病大血管損傷[3]。參芪復方由人參、黃芪、生地黃、天花粉、山萸肉、丹參、制大黃組成,具有益氣養陰、活血化瘀的功效;臨床應用20余年,是具有糖尿病大血管保護作用的臨床有效驗方[4]?，F代藥理研究證實參芪復方中大補元氣的人參、黃芪,祛瘀生新的丹參對活化EPCs有重要意義,在其他復方對EPCs研究中,也證實滋陰調脾補腎的山藥、山萸肉、生地黃占有重要席位[5]。為了明確研究參芪復方是否對能夠保護血管內皮的EPCs具有促進和保護的作用,本實驗擬采用離體實驗的研究方法,觀察高糖環境下大鼠骨髓源性EPCs的遷移、增殖作用。

1 材料

1.1 動物選擇體質量120～140 g SD(Sprague-Dawley)大鼠,SFP(Specific pathogen free)級,本實驗SD大鼠均于成都達碩生物科技有限公司處購買,實驗動物生產許可證號:SCXK(川)2020-0030。

1.2 藥物D-(+)葡萄糖(sigma,德國,批號:LC26022V);參芪復方中藥飲片由成都中醫藥大學附屬醫院藥劑科提供,參芪復方凍干粉由四川百草精工生物科技有限公司加工。

1.3 試劑EGM-2培養基(lonza,美國,批號:0001056859);Histopque-1083(sigma,德國,批號:RNBJ9540);FN(MCE,中國,批號:103747);Anti-CD34 antibody(abcam,英國, 批號:GR3240236-18);Anti-VEGF Receptor 2 antibody(abcam,英國,批號:GR3320191-9);CCK-8試劑盒(biosharp ,中國,批號:BS350B);結晶紫(碧云天,中國) ;Transwell(Corning,美國,批號:15421051)。

1.4 儀器流式細胞儀(Thermo Fisher Scientific,美國);低速冷凍離心機(四川蜀科儀器有限公司,中國);二氧化碳培養箱(上海力申科學儀器有限公司,中國);熒光顯微鏡(奧靈巴斯,日本);酶標儀(biobase,中國)。

1.5 方法

1.5.1 參芪復方含藥血清制備將適應性喂養3 d后的12只體質量(200±20)g的SPF級雄性SD大鼠隨機分為2組,各6只:①含藥血清組:以參芪復方凍干粉灌胃1.44 kg·d,每天2次,連續灌藥7 d;②空白血清組:用等量的生理鹽水灌胃,每天2次,連續7 d。末次給藥1 h后,取血,離心,除菌,滅活,無菌分裝,放置-80℃保存備用。

1.5.2 EPCs的培養 鑒定大鼠麻醉處死后,取股骨、脛骨剪破,用PBS反復沖洗髓腔(操作保持無菌);細胞懸液用70 um Filter Unit過濾后,按1∶1的比例將Histopque-1083分離液與細胞懸液先后加入15 ml離心管中,離心,2000 r/min,20 min;取出中間云霧層的單個核細胞,用EGM-2培養基重懸細胞,1500 r/min離心10 min,操作2次;把細胞懸液接種FN包被的六孔板中,48～72 h進行第1次換液,從第2次換液起,每2～3 d換液1次,7～9 d可進行傳代。

收集純化后的原代EPCs,再用預冷的流式緩沖液調整細胞密度為5×106個/ml,將細胞懸液加入流式管中。再將Anti-CD34抗體(ab8158)、Anti-VEGF Receptor 2抗體(ab2349)加入流式管中,4 ℃避光孵育1 h。之后取400 g,離心5 min,然后重懸于冰冷的流式緩沖液,加入二抗,4 ℃避光孵育30 min。再取400 g,離心5 min,重懸于冰冷的流式緩沖液,進行洗滌,重復3次。上流式細胞儀分析。

1.5.3 構建高糖模型①分組。EGM-2培養基含糖5.5 mmol/L,將本底EGM-2培養基設為contrrol組;添加葡萄糖,用EGM-2培養基配制成含糖15 mmol/L、25 mmol/L、35 mmol/L、45 mmol/L、55 mmol/l培養基組[6]。按照分組提前備好含不同濃度葡萄糖的EGM-2培養基。②EPCs遷移能力檢測。首先分別在上室和下室中加入100 μl和600 μl EGM-2培養基于溫箱中平衡1 h,收集細胞后, 將EPCs用EGM-2培養基重懸,并計數。將平衡后的小室取出后去除培養基,按分組在上室中加密度為15000個/100 μl,200 μl細胞懸液,下室加入500 μl含10%FBS的培養基。培養24 h后,先將小室用4%多聚甲醛固定30 min,再用結晶紫染色,最后用PBS浸洗3遍,于倒置顯微鏡下任選5個視野觀察,計數遷移細胞數量。③EPCs活性增殖能力檢驗。用0.25%胰蛋白酶消化收集貼壁細胞,用EGM-2培養基重懸,并計數,按8000個/孔的密度接種至 96 孔板中,每孔100 μl EGM-2培養液。培養箱中過夜使細胞貼壁。根據分組分別換用上述正常培養基及含糖培養基,至培養箱中培養24 h。每孔加入CCK-8 10 μl,避光孵育1 h后,酶標儀檢測450 nm處吸光度(OD)值。

1.5.4 不同濃度參芪復方血清對高糖環境下EPCs增殖 遷移影響①分組及干預。選擇45 mM高糖刺激24 h后,1組設為control組,加入45 mM高糖+EGM-2培養基,其余3組分別在45 mM高糖+EGM-2培養基的基礎上加入終濃度為(5%、10%、15%)的參芪復方血清。分別培養24、48 h。按照分組提前備好含不同濃度參芪復方血清的高糖培養基。②EPCs遷移能力檢測。③EPCs活性增殖檢驗。

2 結果

2.1 EPCs的鑒定通過流式細胞儀檢測原代細胞培養至第11天表面標志物CD34和VEGFR-2的表達,所測細胞共同表達CD34、VEGFR-2的細胞占總細胞的96.4%。見圖1。

圖1 流式細胞檢測原代細胞表面標志物CD34/VEGFR-2

2.2 不同濃度葡萄糖刺激下EPCs遷移能力各組細胞隨著葡萄糖濃度的升高,細胞從上室遷移至下室的EPCs比例逐漸減少,正常培養基含糖量5.5 mM,作為contrrol組。與control組比15～55 mM遷移能力遞減,其中55 mM濃度時抑制最明顯(P<0.0001)。見圖2。

(注:****表示P<0.0001)

2.3 不同濃度葡萄糖刺激下EPCs活性增殖能力EPCs在不同濃度葡萄糖刺激24 h后,通過CCK-8檢測其活性增殖能力,顯示隨著葡萄糖濃度的升高,對其的抑制率也越來越高,其IC50=37.43。與control組比55 mM組抑制率最高。EPCs的增殖活性與葡萄糖濃度成負相關。見圖3。

圖3 不同濃度葡萄糖對EPCs的抑制

得知葡萄糖濃度與EPCs的遷移能力、增殖活性為負相關,選擇45 mM高糖細胞模型進行后續實驗;本實驗中葡萄糖對 EPCs的半數抑制率的有效濃度在37.43 mM,在45 mM時,與control組比,EPCs的遷移能力被抑制了80%左右,且45 mM、55 mM的遷移抑制,差異無統計學意義(P>0.05);結合高糖環境下EPCs增殖、遷移能力分析,45 mM是適合探究高糖環境對EPCs造成損傷的濃度。

2.4 高糖環境下不同濃度參芪復方血清對EPCs遷移能力影響在Transwell實驗中EPCs在45 mM高糖刺激+參芪復方血清干預24 h及48 h后。結果顯示:參芪復方可以一定程度恢復高糖對EPCs的遷移能力的抑制。高糖刺激+5%參芪復方血清干預24 h后,對EPCs的遷移能力改善最佳。見圖4。

(注:****表示P<0.0001,***表示P<0.001,**表示P<0.005,*表示P<0.05)

2.5 高糖環境下不同濃度參芪復方血清對EPCs增殖能力的影響髓源EPCs在45 mM高糖刺激24 h后,用5%、10%、15%的參芪血清干預24、48 h后。結果顯示:不同濃度參芪復方干預高糖環境下EPCs 24、48 h后,EPCs增殖能力均有所改善;干預48 h較24 h,改善更明顯,且干預48 h時,5%參芪復方濃度作用最佳。見圖5。

(注:****表示P<0.0001,***表示P<0.001,**表示P<0.005)

3 討論

EPCs作為保護血管內皮的重要角色,主要來源于骨髓;EPCs不同于其他祖細胞,而與干細胞相似,具有自我更新和多種分化的潛能[7,8]。1997年Asahara等人從外周血循環中分離出EPCs[9,10],并證實EPCs是參與血管生成的未分化細胞。當人體受到外傷、缺血、缺氧等外界環境刺激時,EPCs會從骨髓動員、遷移到循環血液中,參與受損組織的修復和再生[11]。多項證據表明糖尿病(DM)中EPCs數量減少和EPCs功能的各個方面受損, EPCs的功能改善可以使DM患者受益[12,13]。目前已經進行了使用 EPCs治療缺血性心臟病和嚴重外周動脈疾病的臨床試驗[14,15],但通過恢復EPCs的功能治療DM或是通過正常EPCs治療DM及其并發癥的臨床證據較少。通過恢復EPCs功能治療DM具有巨大潛力。

通過課題組前期對糖尿病大血管并發癥多維度的研究,臨床隨機對照試驗證明參芪復方能夠有效改善DM患者血糖控制水平[16]、調節血脂、顯著提高患者生活質量,并在改善DM患者胰島β細胞功能、增加餐GLP-1分泌、調節腸道菌群、改善微循環、降低DM患者炎癥反應及氧化應激水平、修復患者血管內皮損傷等各個方面發揮積極作用,能夠有效防控糖尿病大血管并發癥的發生發展[17]。參芪復方,用人參、黃芪以升陽運脾、補中益氣,營衛同守,血脈同固,助脾布散水谷精微,以升清降濁,補后天以養先天;用天花粉、生地黃以滋陰降火,共養肺脾腎陰,蓄真水之虧;山藥、山茱萸以健脾溫腎、養陰益氣;用酒制大黃、丹參以活血化濁、祛瘀生新。方中黃芪與山藥相配,補氣升陽助脾復運,天花粉與生地黃、山藥相配,肺脾腎及三焦之陰虧得以滋補,內蘊之火可以通降,全方君臣佐使相宜,養陰益氣,活血化瘀,從而防止糖尿病大血管損傷。

EPCs的遷移與數量直接關系到修復內皮損傷的血管新生與血管形成[18]。提高高糖環境下EPCs的增殖、遷移是EPCs能否順利完成糖尿病大血管并發癥血管損傷修復的關鍵之一。本研究結果發現,參芪復方干預高糖環境下EPCs 24、48 h時,均可改善EPCs增殖,與其濃度呈負相關。在參芪復方干預高糖環境下的EPCs 24 h時,對增殖、遷移均有改善,且參芪復方血清5%為最佳;當干預48 h時,同是5%對增殖能力的改善最佳,而各組遷移能力差異無統計學意義;改善高糖環境下EPCs增殖活性而言,干預48 h的組皆優于干預24 h的組。綜上,參芪復方可以明顯改善高糖環境下EPCs的遷移能力、增殖活性。提示參芪復方治療糖尿病大血管并發癥可能還與其改善EPCs的遷移能力、增殖活性有關。同時也為臨床從改善 EPCs 功能角度治療糖尿病血管并發癥提供了新的思路。