自然發酵酸面團發酵過程中微生物菌群多樣性分析及細菌功能預測

楊文馨，安飛宇，曹愷欣，烏日娜，3*

（1.沈陽農業大學 食品學院，遼寧 沈陽 110866；2.遼寧省食品發酵技術工程研究中心，遼寧 沈陽 110866；3.沈陽市微生物發酵技術創新重點實驗室，遼寧 沈陽 110866）

自然發酵酸面團，是我國特色傳統面食發酵劑，有著悠久的歷史和豐富的功能特性，在活性干酵母出現的幾千年前就已經被廣泛地應用于面制品中[1]，通過酸面團所制成的面制品也備受人們的喜愛[2]。酸面團中富含多種微生物，是一個復雜的微生態環境，其中主要包含酵母菌、乳酸菌以及霉菌[3-4]，通過各種微生物的協同作用使酸面團發酵制品具有更好的風味及質構[5-7]，也更有利于人們的腸道健康。酸面團中的微生物具有多種功能特性[8-11]，對酸面團制品的感官品質以及營養價值有重要的影響[12-14]。

近年來，隨著測序技術的不斷進步，高通量測序技術應運而生，其通過對堿基測序和數據收集，可同時完成大量脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）模板的測序，具有高通量、高精度、高速、低費用等特點，被廣泛應用于全面解析樣品中的微生物群落結構[15-16]。目前，關于通過高通量技術對酸面團發酵時期的細菌和真菌菌群多樣性的研究較少。于靜等[17]通過傳統分離培養的方法對新疆地區囊用酸面團的微生物多樣性進行分析，發現有7種乳酸菌和9種酵母菌，優勢真菌和細菌分別為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）；李曉敏等[18]利用高通量測序技術對中國5個省份酸面團的菌群結構和風味物質進行分析，發現釀酒酵母與風味物質之間呈正相關性。

本研究利用高通量測序研究不同發酵階段自然發酵酸面團中的微生物菌群多樣性，并運用PICRUSt對細菌群落的基因功能進行預測，為后期更加全面了解自然發酵酸面中細菌菌群多樣性提供理論依據，并為優良發酵功能菌種的篩選提供了數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

酸面團：從遼寧省沈陽、鞍山、本溪、丹東、桓仁和內蒙古通遼共6個地區分別采集不同發酵時期（12 h、2 d、4 d、6 d）共計24份自然發酵酸面團成品樣品。同時，分別取50 g同一發酵時間的自然發酵酸面團樣品進行混合，編號為D1、D2、D3、D4。D1樣品為發酵前期（12 h），D2、D3樣品為發酵中期（2 d、4 d），D4樣品為發酵后期（6 d）。

1.1.2 試劑

DNA提取試劑盒：美國OMEGA公司；AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒：美國AXYGEN公司；Fastpfu DNA Polymerase：北京TransGen公司；QIA quick聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物及擴增體系：北京鼎國昌盛有限公司；Illumina MiSeq platform：美國Illumina公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

PCR儀：美國Applied Biosytems公司；DYY-12電泳儀：北京六一生物儀器有限公司；UVP GDS-8000凝膠成像儀：上海精密科學有限公司；Allegra V-15R高速臺式冷凍離心機：德國Eppendorf公司；MISEQ測序儀：美國Illumina公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA提取、PCR擴增及高通量測序

使用DNA提取試劑盒從酸面團樣品中提取微生物菌群基因組DNA，以其為模板，采用引物515F（5'-GTGCCGCMGCCGCGG-3'）和907R（5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3'）對細菌16S rRNA V3-V4區基因序列進行PCR擴增；采用引物SSU0817F（5'-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3'）和1196R（5'-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3'）對真菌18S rRNA基因進行PCR擴增。PCR擴增體系（30 μL）：Phusion Master Mix（2×）15 μL，上下游引物（2 μmol/L）各3 μL，基因組DNA（1 ng/μL）10 μL，雙蒸水（ddH2O）2 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55/53 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共循環29次；72 ℃再延伸10 min后10 ℃保存。每個樣品進行3次重復試驗。相同樣品的PCR擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。在Illumina MiSeq平臺上對合格的PCR擴增產物進行雙端測序（2×300），按上海美吉生物醫藥科技有限公司的標準操作規程進行操作。

1.3.2 微生物菌群多樣性分析及細菌菌群基因功能性預測

采用Usearch對測序結果進行可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類分析，對相似性≥97%的OTU進行生物信息統計，并使用UCHIME鑒定并去除嵌合序列[19]，從而獲得有序序列。用核糖體數據庫項目（ribosomal database project，RDP）分類器以0.8的置信度閾值[20]對OTU代表序列進行分類學分析，在各個分類水平統計樣本群落的組成。利用Alpha多樣性評估樣品的微生物菌群多樣性。采用Unifrac進行Beta多樣性分析，比較樣品間的差異。根據16S rRNA序列結果，運用PICRUSt預測細菌菌群基因功能[21]。

2 結果與分析

2.1 高通量測序結果

自然發酵酸面團樣品微生物菌群的高通量測序結果見表1。

表1 自然發酵酸面團樣品微生物菌群高通量測序結果Table 1 High-throughput sequencing results of microflora in spontaneously-fermented sourdough samples

由表1可知，通過高通量測序共得到124 184條細菌有效序列，堿基數為56 380 785 bp，平均堿基長度為396.53 bp；共得到146 223條真菌有效序列，堿基數為58 771 418 bp，平均堿基長度為401.93 bp。真菌和細菌平均堿基長度與設計引物擴增長度接近，質控合格，故可進行后續分析[22]。

2.2 微生物菌群多樣性分析

2.2.1α-多樣性分析結果

自然發酵酸面團樣品微生物菌群的Alpha多樣性分析結果見表2。

表2 自然發酵酸面團樣品微生物菌群的Alpha多樣性分析結果Table 2 Alpha diversity analysis results of microflora in spontaneously-fermented sourdough samples

由表2可知，細菌OTU數大于真菌OTU數，說明細菌菌群多樣性大于真菌菌群，同時也表明自然發酵酸面團的優勢菌群是細菌。Coverage值可反映測序的深度[23]，各樣品的Coverage值均＞0.999，說明數據能真實反映樣品中微生物的情況。Ace指數、Chao1指數和Shannon指數值與Alpha多樣性呈正相關，而Simpson指數值與Alpha多樣性呈負相關[24]。隨著發酵時間的延長，真菌和細菌菌群的Chao1指數、Ace指數值均呈先減小后增大的趨勢，在發酵后期達最大值，說明在發酵后期，細菌和真菌菌群的豐度最大。細菌和真菌菌群的Shannon指數值均隨發酵時間延長而增大，細菌菌群的Simpson指數呈減小趨勢，而真菌菌群的Simpson指數在發酵后期顯著減小，說明細菌和真菌菌群的多樣性隨發酵時間延長而升高。

2.2.2 Venn圖分析

Venn圖通過統計OTU的數量，可以直觀顯示出不同樣本之間的重疊情況及組成的相似性[25]。不同發酵時期自然發酵酸面團中細菌及真菌群落的OTU分布Venn圖見圖1。由圖1a可知，不同發酵時期自然發酵酸面團共有的細菌OTU有12個，分別屬于藍藻門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）及變形菌門（Proteobacteria）；由圖1b可知，不同發酵時期共有的真菌OTU有9個，均屬于子囊菌門（Ascomycota），說明其可能是自然發酵酸面團的優勢菌群。整體來看，無論是細菌還是真菌，發酵前期和中期微生物群落組成都較為相似，而發酵后期的微生物多樣性增加，說明面團自然發酵過程中，微生物多樣性與發酵時間有著密切關系。

圖1 基于操作分類單元自然發酵酸面團樣品中細菌（a）及真菌（b）菌群的Venn圖Fig.1 Venn diagram of bacteria (a) and fungi (b) community in spontaneously-fermented sourdough samples based on operational taxonomic unit

2.3 微生物菌群結構分析

2.3.1 門分類水平

基于門水平自然發酵酸面團樣品中微生物菌群結構見圖2。

圖2 基于門水平自然發酵酸面團樣品中細菌（a）及真菌（b）菌群結構Fig.2 Bacteria (a) and fungi (b) community structure in spontaneously-fermented sourdough samples based on phylum level

由圖2a可知，從不同發酵時期自然發酵酸面團樣品中共檢測到5個細菌門，包括3個共有菌門，分別為藍藻門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）。在發酵前期（D1），絕對優勢細菌門為藍藻門（89.28%）；在發酵中期（D2～D3），優勢細菌門（平均相對豐度＞1.00%）為厚壁菌門（53.38%～65.28%）；在發酵后期（D4），絕對優勢細菌門為變形菌門（77.71%），藍藻細菌門較少，另外少量擬桿菌門（Bacteroidetes）在發酵后期出現，對面團的發酵過程影響較小。整體來看，藍藻細菌門波動較大，發酵初期大量存在，發酵后期僅存在少量，說明其可能為原材料中的雜菌。

由圖2b可知，從不同發酵時期自然發酵酸面團樣品中共檢測到13個真菌門，子囊菌門（Ascomycota）在發酵過程中占絕對優勢，相對豐度一直＞99%，說明子囊菌門對自然發酵酸面團的影響較大。

2.3.2 屬分類水平

基于屬水平自然發酵酸面團樣品中微生物菌群結構見圖3。

圖3 基于屬水平自然發酵酸面團樣品中細菌（a）及真菌（b）菌群結構Fig.3 Bacteria (a) and fungi (b) community structure in spontaneously-fermented sourdough samples based on genus level

由圖3a可知，從不同發酵時期自然發酵酸面團樣品中共檢測到34個細菌屬，包括9個優勢細菌屬（平均相對豐度＞1.00%），分別為未分類的藍藻門（norank_c__Cyanobacteria）、乳球菌屬（Lactococcus）、未分類的γ-變形菌綱（unclassified_c__Gammaproteobacteria）、norank_f__Mitochondria、明串珠菌屬（Leuconostoc）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、魏斯氏菌屬（Weissella）、沙雷氏菌屬（Serratia）、腸球菌屬（Enterococcus）。在發酵前期（D1），絕對優勢細菌屬為未分類的藍藻門（89.28%）。在發酵中期（D2～D3），優勢細菌屬為乳球菌屬（50.97%～52.43%），菌群結構較為相似，相對豐度變化幅度不大，說明發酵菌群趨于穩定。酸面團中的乳酸菌可將小分子糖轉化為酸類化合物[26]，產生較柔和的酸味，發酵代謝中還產生醇，與酸類代謝物反應生成酯，由此使面團具有獨特的酯香和醇香[27]，另外D3時期還檢出了明串珠菌屬和乳球菌屬。在發酵后期（D4），多種菌屬開始被檢出，絕對優勢細菌屬為未分類的γ-變形菌綱。酸面團菌群研究中很少出現未分類的γ-變形菌綱，而在發酵后期大量檢出，說明其可能是后期產生的雜菌，另外發酵后期檢出的致病菌有沙雷氏菌屬（0.22%～5.50%）和腸球菌屬（0.04%～1.34%），說明面團發酵時間不宜過長，時間過長會增加致病菌產生的風險。

由圖3b可知，從不同發酵時期自然發酵酸面團樣品中共檢測到12個真菌屬，包括3個優勢真菌屬（平均相對豐度＞1%），分別為未分類的酵母目（Saccharomycetales_unclassified）、漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、鐮刀菌屬（Fusarium）。各個發酵時期隸屬于子囊菌門的未分類的酵母目（95.51%～99.77%）對酸面團的發酵有著重要影響。在發酵后期，優勢真菌屬漢遜酵母屬（22.58%）也被檢出。

2.4 PICRUST功能預測

基于OTUs利用PICRUSt預測細菌菌群基因的功能，結果見圖4。由圖4可知，細菌群落功能多數集中和分布在能量產生和轉化、轉錄、無機離子轉運和代謝、碳水化合物轉運和代謝、氨基酸轉運和代謝等。

3 結論

本研究從遼寧及內蒙古不同地區采集自然發酵酸面團，通過高通量測序對其發酵過程中的微生物多樣性分析發現，在門水平上，共檢測到5細菌門，不同發酵時期絕對優勢菌門不同，發酵前期（D1）為藍藻門（Cyanobacteria），中期（D2～D3）為厚壁菌門（Firmicutes），后期（D4）為變形菌門（Proteobacteria）；共檢測到13個真菌門，子囊菌門（Ascomycota）在各個發酵時期均為優勢真菌門。屬水平上，共檢測到34個細菌屬，發酵前期絕對優勢菌屬為未分類的藍藻細菌門（norank_c__Cyanobacteria），中期為乳球菌屬（Lactococcus），后期為未分類的γ-變形菌綱（unclassified_c_Gammaproteobacteria）；共檢出12種真菌屬，未分類的酵母目（Saccharomycetales_unclassified）在各個發酵時期均為絕對優勢菌屬，后期漢遜酵母屬（Hanseniaspora）也被大量檢出。通過PICRUSt對細菌群落的基因功能進行預測，結果顯示，酸面團在自然發酵過程中細菌群落的基因功能主要有能量物質的產生及轉化，轉錄、無機離子無機離子轉運和代謝等。本研究進一步了解了酸面團在不同自然發酵階段微生物演替模式，為后續研究酸面團中微生物間相互作用提供科學依據，為篩選優良的發酵菌種資源提供數據參考。