高產酯酶格氏乳球菌的ARTP-UV復合誘變選育及發酵條件優化

蔡嶺肸，陳曉松，鄒 偉，2*，湯秀娟，3

（1.四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓 644000；2.釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000；3.樂山職業技術學院，四川 樂山 614000）

酯酶既能催化酯鍵水解又能使其合成，基于此特性也被稱為酯合成酶和酯分解酶[1]。酯酶是催化白酒香氣成分形成與香味物質轉化的主要酶類[2]。它在細胞內參與各類催化反應，廣泛分布在動植物和微生物中，常被運用于食品業、醫藥、化工等領域[3-4]，其中微生物源的酯酶運用得最多[1]。

目前對產酯酶微生物研究主要集中在酵母和霉菌等真菌，對細菌研究較少[5-6]。產酯酶的霉菌主要有傘枝犁頭霉[7]、紅曲霉[8]、黑曲霉和根霉[9]等。細菌是白酒生產發酵中的一類重要產酯酶微生物，但目前對酯化細菌的研究主要集中在葡萄球菌、單胞菌和放線菌[10-11]。

酯酶在食品領域，通常運用于酒類、醬油和食醋等釀造食品以催化產生酯類等呈香物質[12]。白酒在我國已有上千年的歷史，根據其不同的風味口感，可分為包括濃香型、醬香型、清香型在內的十二種香型[13-14]。白酒的風味成分主要有醇類、酸類、酯類、酮類、萜類和含硫化合物等，它們氣味各異且相互影響[15]。在白酒釀造過程中，菌群的相互作用會對白酒的風味產生極大的影響[16]。白酒的發酵源于各種微生物的協同作用[17]，白酒中的風味物質主要來源于微生物的代謝生長、生物酶促反應、非酶促反應等。微生物代謝生成的酯酶能使有機酸縮合，生成己酸乙酯、乙酸乙酯等白酒的主體香氣成分[18]。微生物源的酯酶具有較高的酯化能力，能夠提高白酒中酯類物質（乙酸乙酯、己酸乙酯）的含量，從而明顯提升白酒的品質和風味[19]。白酒發酵前中期產生的酸類和醇類由酯酶催化生成酯類物質[20-21]。因此酯酶廣泛運用于白酒行業，為白酒提酯增香[22-23]，以改善傳統白酒酯香味不足的缺陷[6]。謝恩舉等[24]利用產酯酶己酸菌液與酶制劑一同加入窖池發酵，極大的提升了濃香型白酒的產量和風味，創造了客觀的經濟效益。

常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變技術由于其安全可靠，操作簡單的特點，是近二十年來為改善微生物的某些效應常用的方法[25]。它是通過高純度的氦氣為載體氣流，利用高活性等離子體流作用于微生物，使其遺傳物質發生突變，從而改變某些特性的方法[26]。紫外（ultraviolet，UV）誘變技術使用的紫外線是一種物理誘變劑，它能使脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）分子間（內）的交聯嘧啶形成嘧啶二聚體造成堿基對轉換，修復后造成差錯和缺失，導致微生物遺傳物質的改變[27-28]。李豪等[29]通過ARTP-UV誘變枝孢菌（Cladosporium），使其產纖維素酶的能力提高了36.14%。將這兩種技術進行復合運用，能得到更加可靠穩定的誘變效果，是目前相關研究常用的復合誘變方法。

本研究以實驗室前期篩選保藏的產酯酶菌株格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）S5-4為出發菌株，通過多輪次ARTP-UV復合誘變，選育高產酯酶傳代穩定的突變菌株，對突變菌株進行耐受性試驗，并通過單因素試驗優化培養基組分，采用單因素及響應面試驗優化突變菌株發酵條件，提升突變株的產酯酶能力，從而達到提升白酒的風味和品質的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）S5-4：實驗室前期篩選保藏。其酯酶酶活為（15.74±0.03）U/mL，已保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為GDMCC No：63054。

1.1.2 試劑

三丁酸甘油酯、聚乙烯醇（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；牛肉膏、蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；氯化鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸銨（均為分析純）：成都市科隆化學品有限公司。

1.1.3 培養基

篩選培養基[30]：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，3%聚乙烯醇-三丁酸甘油酯乳化液20%，霉菌素25 μg/mL，自然pH。121 ℃滅菌20 min。

種子培養基[31]：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，自然pH。121 ℃滅菌20 min。

發酵培養基：葡萄糖20 g/L，牛肉膏20 g/L，氯化鈉5 g/L，pH 7.0。121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

ARTP-P常壓室溫等離子體誘變儀：無錫源清天木生物科技有限公司；SW-CJ2D超凈工作臺：上海蘇凈實業有限公司；HZ150L型恒溫培養搖床：武漢瑞華儀器設備有限責任公司；LS-50HJ立式壓力蒸汽滅菌鍋：江陰濱江醫療設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 出發菌株S5-4的活化及菌懸液制備

將在實驗室保藏的格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）S5-4從甘油管中移到種子培養基中，置于搖床35℃、150r/mim培養活化24 h。連續活化兩代后作為出發菌株。

將斜面培養基上保存的出發菌株S5-4，接種于種子培養基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養至對數期，得到菌株S5-4種子液。吸取5 mL的菌株S5-4種子液于離心管中，于5 000 r/min條件下離心10 min。棄去上清液，沉淀加入4 mL 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）混勻，同樣條件下再次離心，反復3次。最后用PBS重懸，得到菌株S5-4菌懸液，調整菌懸液OD600nm值為0.6～1.0。

1.3.2 酯酶活力的測定

酯酶活力的測定采用滴定法。具體操作如下：3%聚乙烯醇-三丁酸甘油酯乳化液4 mL與0.025 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.5）5 mL于錐形瓶中混勻，然后在40 ℃水浴鍋中預熱5 min，再加入1 mL提前制備好的粗酶液，反應15 min后加入15 mL體積分數為95%乙醇，滴加2～3滴酚酞指示劑，最后用0.05 mol/L的NaOH標準溶液滴定，空白組加入等量滅菌后的無菌水[32]。酯酶酶活計算公式如下：

式中：U為酯酶酶活，U/mL；V1為粗酶液消耗NaOH溶液的體積，mL；V2為空白對照消耗NaOH溶液的體積，mL；n為稀釋倍數；t為反應時間，h。

酯酶酶活定義：在一定條件下，每分鐘催化三丁酸甘油酯水解生成1 μmol正丁酸的量，定義為一個酶活力單位（U/mL）。

1.3.3 ARTP-UV復合誘變

（1）ARTP誘變

將制備好的菌懸液用移液槍取10 μL于金屬載片上，再將滴有菌液的金屬載片置于誘變儀載物臺，將參數設置為：射頻功率130 W、工作氣流為10 L/min。室溫常壓下，誘變處理時間分別為0 s、10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s、70 s、80 s、90 s、100 s、110 s、120 s、130 s。將已誘變的載片置于裝有1 mL PBS的離心管中，并調整菌懸液濃度為10-1～10-3。取100μL將其涂布于篩選培養基上，各梯度3組平行。于37℃恒溫培養48 h后再進行菌落數統計，并計算致死率[33]。選擇致死率在90%[31]左右的誘變時間再對目的菌株按照上述同樣方法進行ARTP誘變處理，所得到的菌懸液涂布于篩選培養基平板上，37 ℃培養5 d，測量菌落直徑（d）及透明圈直徑（D），選擇D/d較大的菌落再進行紫外誘變[34]。致死率[33]計算公式如下：

（2）紫外誘變

將經ARTP誘變后得到的酯酶酶活較高的突變菌株，制備成菌懸液。吸取5 mL的菌懸液于無菌培養皿，并置于磁力攪拌器上，距紫外燈50 cm處進行照射。照射時間設置為0、10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s、70 s、80 s、90 s、100 s、110 s、120 s、130 s、140 s、150 s。照射結束后，在超凈工作臺內關燈避光穩定10 min。吸取1 mL培養皿內已誘變的菌懸液，調整濃度梯度為10-1～10-3備用。取100 μL涂布于篩選培養基上，各梯度3組平行。37 ℃培養48 h后統計菌落數，并計算致死率。以致死率為90%[31]的時間對目的菌株進行UV誘變處理，所得菌懸液涂布于篩選培養基，37 ℃培養3 d后，測量菌落直徑（d）和透明圈直徑（D），得出D/d值[34]。再將所得到的突變菌株用上述方法測定其酯酶活力，判斷誘變效果，選出高產酯酶的突變菌株。

（3）多輪次ARTP-UV復合誘變

菌懸液經一次ARTP誘變后，將篩選出產酯酶活力最高的突變株再進行一次UV誘變，這個過程稱為一輪ARTP-UV復合誘變。為篩選出穩定且產酯酶活力高的菌株，將原始菌株S5-4按照上述誘變方法進行第一輪的復合誘變，篩選出高產酯酶的突變菌株。第一輪復合誘變得出產酯酶活力最高的突變株，按上述方法進行第二輪ARTP-UV復合誘變，再次得出產酯酶活力最高的突變菌株。連續進行三輪ARTP-UV復合誘變，篩選出產酯酶活力最高的菌株作為此次誘變篩選得到的菌株。

1.3.4 突變菌株遺傳穩定性

將經過復合誘變篩選出高產酯酶的突變株在發酵培養基斜面上連續培養15代，并不斷地測定其產酯酶能力。將這些不同傳代次數間的產酯酶能力高低進行不斷地比較，得出相應的結果。當同一菌株連續傳代5次，其產物產量無明顯差異，則認為該菌株已具有良好的遺傳穩定性[31]。

1.3.5 突變菌株生理耐受性

（1）溫度和pH耐受性試驗

將原始菌株和突變菌株活化后，接種至發酵培養基。分別在不同的溫度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50 ℃）、不 同 的 初 始pH 值（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）條件下，于180 r/min培養3 d后，分別測定OD600nm值，測定原始菌株和突變菌株的溫度和pH耐受性。

（2）葡萄糖耐受性試驗

將原始菌株和突變菌株接種至不同葡萄糖質量濃度（10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L、70 g/L、80 g/L）的發酵培養基，保持培養基其余條件均不變。置于搖床180 r/min、28 ℃培養3 d，分別測定OD600nm值，測定原始菌株和突變菌株的葡萄糖耐受性。

（3）乙醇耐受性試驗

將原始菌株和突變菌株接種至發酵培養基，以發酵培養基質量（100%）計，向發酵培養基中加入不同體積分數的乙醇（0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%）；乙醇添加前過0.22 μm的濾膜除菌，每組3個平行。在28 ℃、180 r/min條件下培養3 d，取OD600nm值的平均值，以測定原始菌株和突變菌株乙醇的耐受性。

（4）丁酸和己酸耐受性試驗

將原始菌株和突變菌株接種至發酵培養基，以發酵培養基質量（100%）計，分別向發酵培養基中加入不同質量濃度的丁酸（0、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L）和己酸（0、1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L）。測定發酵液的OD600nm值，確定原始菌株和突變株在不同丁酸和己酸質量濃度下的生長情況。

1.3.6 突變株液態發酵培養基優化

將液態發酵培養基以不同的碳源（葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、玉米粉、乳糖）添加量為20 g/L；不同的氮源（牛肉膏、硝酸銨、硫酸銨、蛋白胨、酵母粉）添加量均為10 g/L；不同的無機鹽（K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、MnSO4、NaCl）添加量均為5 g/L。培養基成分確定后，再將最佳碳源和最佳氮源添加量分別設置為5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L，最佳無機鹽的添加量分別設置為1 g/L、3 g/L、5 g/L、7 g/L、9 g/L。于37 ℃、180 r/min培養2 d后，測定突變株的酶活，用以確定最佳培養基組分及其添加量[35]。

1.3.7 突變菌株發酵條件優化

（1）單因素試驗

測定突變菌株在不同接種量（1%、3%、5%、7%、9%）、不同發酵時間（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d）、不同轉速（140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min、220 r/min）、不同發酵溫度（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃）、不同初始pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）條件下發酵48 h后測定產酯酶的高低，以確定突變菌株液態發酵產酯酶的最佳條件。

（2）響應面試驗

在單因素試驗基礎上，將對突變菌株的產酯酶酶活力影響較大的發酵時間（A）、發酵溫度（B）、初始pH值（C）為自變量，酯酶酶活力為響應值（Y），設計3因素3水平的Box-Behnken試驗，采用Design-Expert 13.0軟件進行結果分析，Box-Behnken試驗因素與水平見表1。

表1 發酵條件優化Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for fermentation conditions optimization

1.3.8 數據處理

采用Excel 2021、Design-Expert 13.0、IBM SPSS Statistics 27.0、Origin 2021進行數據分析和繪圖。

2 結果與分析

2.1 ARTP-紫外復合誘變

2.1.1 ARTP-紫外復合誘變致死曲線

原始菌株S5-4經ARTP和紫外誘變將其進行培養后計菌落數，通過計算后得出不同時間段突變株的致死率，并將其制成致死曲線見圖1。由圖1可知，隨著誘變時間的增加，出發菌株S5-4的致死率也在增加。前40 s ARTP誘變致死率與紫外誘變致死率增加趨勢基本相同，致死率隨時間急速增加。之后致死率增加速度放緩，ARTP誘變致死率在80 s時達到90%，并緩慢增長；紫外誘變致死率在110 s時達到94%，并持續增加。由于較高的致死率是保證誘變菌株有效突變的前提，一般認為致死率在90%左右是最為合適的誘變時間[36-37]。因此，ARTP與紫外誘變最合適的時間分別設置為80 s和110 s。

圖1 不同ARTP和UV誘變處理時間下出發菌株S5-4的致死率曲線Fig.1 Lethal rate curves of original strain S5-4 under different time treated by ARTP and UV mutation

2.1.2 ARTP-UV復合迭代誘變

原始菌株S5-4經三輪次的ARTP-UV復合誘變后，通過測定酯酶酶活來選育高產菌株，三輪次ARTP-UV復合誘變的酯酶酶活測定結果見圖2。由圖2可知，突變菌株既有正向突變（即酶活提升）又有逆向突變（即酶活下降）?；趯嶒災康?，應篩選正向突變菌株作為下一次突變的出發菌株，輪次迭代誘變選育出產酶較高且遺傳穩定的突變株。

圖2 ARTP-UV復合迭代誘變突變株酯酶酶活力Fig.2 Esterase activities of mutant strains ARTP-UV compound iterative mutagenesis

由圖2a和圖2b可知，第一輪ARTP誘變中菌株AR1-7酶活力最高，為（20.28±0.02）U/mL，其他突變株酶活力都在（15.05±0.04）～（19.48±0.02）U/mL。因此，以菌株AR1-7作為UV誘變的出發菌株，通過透明圈法共篩選了31株透明圈較大的突變株。對這31株菌的酶活進行測定，得出突變菌株ARUV1-18酶活力最高，為（22.51±0.02）U/mL，其余突變株酶活力在（16.35±0.02）～（21.69±0.02）U/mL。將經第一輪復合誘變得出酶活最高突變菌株ARUV1-18，制成菌懸液，進行第二輪的ARTP-紫外復合誘變。

由圖2c可知，菌株ARUV1-18經第二次ARTP誘變后，突變菌株AR2-18酶活力最高，為（23.14±0.06）U/mL；其次是菌株AR2-16，酶活力為（22.49±0.02）U/mL。因此，選擇菌株AR2-18進行第二次紫外誘變。

由圖2d可知，突變菌株ARUV2-29酶活力最高，為（25.19±0.04）U/mL，其余突變株酶活力值均在（21.66±0.02）～（24.90±0.03）U/mL。以突變株最高酶活為原則，選擇突變菌株ARUV2-29進行第三輪的復合誘變。

由圖2e和圖2f可知，經三輪ARTP-UV復合誘變后，少部分突變株的酶活仍在正向增加和逆向減少。大部分突變株酶活升高呈現出趨于穩定的趨勢，逐漸平穩達到高點。從總體情況來說，三輪復合誘變作用于菌株對其產酯酶能力具有一定的累加效應。從此次誘變效果來看，經三輪誘變后，菌株的產酯酶能力已達到較好且穩定的效果。在第三輪ARTP-UV復合誘變的菌株中，菌株ARUV3-26酶活力為（25.88±0.02）U/mL，相比于初篩提高了64.42%；并且其余突變株酶活力也在（22.67±0.03）～（25.41±0.06）U/mL。因此，選用突變株ARUV3-26進行下一步遺傳穩定性測試。

2.1.3 突變菌株ARUV3-26遺傳穩定性

通過突變株ARUV3-26傳代15次并依次測定其產酯酶活力的結果見圖3。由圖3可知，總體趨勢為酯酶活力在第1次（（25.48±0.08）U/mL）傳代到第2次（（23.69±0.02）U/mL）傳代出現了明顯的下降，第2次直至第15次傳代的酯酶活力雖有小幅度的波動但總體是趨于平穩（酯酶活力范圍在（23.51±0.02）～（23.56±0.02）U/mL）。因此傳代穩定后突變菌株ARUV3-26的酶活，相比于原始菌株L.garvieaeS5-4的初始酶活[（15.74±0.03）U/mL]提升了49.36%～49.68%；由此可知，突變菌株ARUV3-26經傳代測試15代后，表現出良好的穩定性。KONG F等[35]對分解甲醛的Pseudomonas putidaW1進行誘變所獲得突變株進行傳代穩定性測試，在第4次到第5次傳代時降解率下降了5%，隨后在第10次傳代后表現出良好的遺傳穩定性。

圖3 突變菌株ARUV3-26遺傳穩定性測試Fig.3 Genetic stability experiment of mutant strain ARUV3-26

2.1.4 突變菌株ARUV3-26耐受性試驗

由圖4a可知，原始菌株S5-4與突變菌株ARUV3-26在20～50 ℃時OD600nm值隨溫度上升呈現出先升后降的趨勢，在溫度為35 ℃時OD600nm值達到最高，此時原始菌株S5-4 OD600nm值為8.10±0.07，突變菌株ARUV3-26 OD600nm值為8.37±0.03?？傮w來看，整個溫度范圍內兩株菌有良好的生長情況，其中在溫度35 ℃時為最佳。由圖4b可知，隨pH值在1～10的范圍內變化，兩株菌的OD600nm值都呈現出先升后降的趨勢，都在pH為6.0時達到峰值，此時原始菌株S5-4 OD600nm值為5.84±0.05，突變菌株ARUV3-26 OD600nm值為6.84±0.05，且突變菌株ARUV3-26高于原始菌株S5-4，說明突變菌株ARUV3-26 pH耐受性也較原始菌株S5-4高。由圖4c可知，葡萄糖質量濃度在10～80 g/L時，OD600nm值隨葡萄糖質量濃度升高呈現出先升后降的趨勢。其中原始菌株S5-4的OD600nm值在葡萄糖質量濃度為40 g/L時OD600nm值達到峰值8.12±0.01；突變菌株ARUV3-26的OD600nm值在葡萄糖質量濃度為50g/L時達到峰值8.79±0.01。因此在培養時也應將葡萄糖質量濃度分別設置為40 g/L和50 g/L。由圖4d可知，乙醇體積分數為0～10%時，隨乙醇體積分數升高兩株菌的OD600nm值不斷降低，在10%時達到最低值。但突變菌株ARUV3-26的OD600nm值高于原始菌株S5-4的OD600nm值，說明突變菌株ARUV3-26耐受乙醇能力高于原始菌株S5-4。由圖4d、圖4f可知，隨丁酸和己酸的質量濃度增加，OD600nm值不斷降低。但當丁酸質量濃度為20 g/L時，原始菌株S5-4幾乎不生長，而突變菌株ARUV3-26的生長情況良好；當己酸質量濃度為5g/L時，兩株菌都停止生長，但己酸質量濃度為1～4 g/L時，突變株ARUV3-26的OD600nm值高于原始菌株S5-4。

圖4 原始菌株S5-4和突變菌株ARUV3-26耐受性試驗結果Fig.4 Tolerance tests results of original strain S5-4 and mutant strain ARUV3-26

2.2 突變菌株ARUV3-26產酯酶培養基優化

探究不同的碳源及最佳碳源添加量、不同的氮源及最佳氮源添加量、不同的無機鹽及最佳無機鹽添加量對突變菌株ARUV3-26產酯酶活力的影響，結果見圖5。由圖5a可知，突變菌株ARUV3-26以葡萄糖為碳源時，產酯酶活力最高，為（25.63±0.02）U/mL。因此，最佳碳源為葡萄糖。由圖5b可知，突變株ARUV3-26以蛋白胨為氮源時，酯酶酶活最高，為（26.65±0.02）U/mL。因此，最佳氮源為蛋白胨。由圖5c可知，突變株ARUV3-26以NaCl為無機鹽時，酯酶酶活力最高，為（25.65±0.021）U/mL。因此，最佳無機鹽為NaCl。由圖5d可知，當葡萄糖添加量為5～20 g/L時，酯酶酶活力隨之增高；當葡萄糖添加量為20 g/L時，酯酶酶活力最高，為（26.75±0.03）U/mL；當葡萄糖添加量＞20 g/L之后，酯酶酶活力有所下降。因此，最佳葡萄糖添加量為20 g/L。由圖5e可知，當蛋白胨添加量為5～15 g/L時，酯酶酶活力隨之增高；當蛋白胨添加量為15 g/L時，酯酶酶活力最高，為（26.65±0.03）U/mL；當蛋白胨添加量＞15 g/L之后，酯酶酶活力有所下降。因此，最佳蛋白胨添加量為15 g/L。由圖5f可知，當NaCl添加量為1～5 g/L時，酯酶酶活力隨之增高；當NaCl添加量為5 g/L時，酯酶酶活力最高，為（27.65±0.03）U/mL；當NaCl添加量＞5 g/L之后，酯酶酶活力有所下降。因此，最佳NaCl添加量為5 g/L。

圖5 培養基成分對突變株ARUV3-26產酯酶酶活的影響Fig.5 Effects of medium composition on activities of esterase produced by the mutant ARUV3-26

2.3 突變菌株ARUV3-26產酯酶培養條件優化

2.3.1 單因素試驗

突變菌株ARUV3-26產酯酶培養條件優化單因素試驗結果見圖6。

圖6 不同培養條件對突變株ARUV3-26產酯酶酶活的影響Fig.6 Effects of different culture conditions on activities of esterase produced by mutant ARUV3-26

由圖6a可知，突變菌株ARUV3-26隨接種量增加，酯酶酶活呈現先上升后下降趨勢，但幅度不大。接種量為1%～5%時，酯酶活力隨之增加；接種量為5%時，酯酶活力達到最高，為（27.63±0.02）U/mL；接種量＞5%之后，酯酶活力隨之下降。因此，最適接種量為5%。由圖6b可知，突變菌株ARUV3-26隨發酵時間的增加呈現出先增后減的趨勢，且變化幅度較大。當發酵時間為1～3 d時，酯酶活力隨之增加；當發酵時間在3 d時，酯酶活力達到最高，為（27.60±0.02）U/mL；當發酵時間＞3 d之后，酯酶活力隨之下降。因此，最適發酵時間為3 d。由圖6c可知，轉速影響菌株代謝，隨著轉速增加突變株ARUV3-26酯酶活力先增后減，趨勢明顯。當轉速為140～180 r/min時，酯酶活力隨之增加；當轉速為180 r/min時，酯酶活力達到最高，為（28.69±0.02）U/mL；當轉速＞180 r/min之后，酯酶活力隨之下降。因此，最適轉速為180 r/min。極端的溫度和pH會導致菌株受到脅迫作用，從而影響其生長代謝，使酶活下降。由圖6d可知，當發酵溫度不斷升高，突變株ARUV3-26酯酶活力先升后降。當發酵溫度為25～35 ℃時，酯酶活力隨之增加；發酵溫度為35 ℃時，此時酶活最高[（28.65±0.02）U/mL]；當發酵溫度＞35 ℃之后，酯酶活力隨之下降。因此，最適發酵溫度為35 ℃。由圖6e可知，隨著pH的增加，突變株ARUV3-26酯酶活力先增后減。當pH值為6～7時，酯酶活力隨之增加；pH值為7時，酶活最高達到（29.64±0.02）U/mL；當pH值＞7之后，酯酶活力隨之下降。因此，最適pH值為7。

2.3.2 響應面試驗

在單因素試驗基礎上，以對試驗結果影響最大的3個因素：發酵時間（A）、發酵溫度（B）、初始pH值（C）作為自變量，以酯酶酶活力作為響應值（Y），設計響應面分析試驗。發酵條件優化Box-Behnken試驗設計及結果見表2，回歸模型方差分析見表3。

表2 發酵條件優化Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments for fermentation conditions optimization

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

通過Design-Expert 13.0對表2中的數據進行分析，得到擬合方程如下：

由表3可知，模型的P＜0.000 1，該模型極顯著。失擬項P=0.214 5＞0.05，不顯著。由此可知，該二次回歸方程擬合度良好，能較好地進行響應面預測。決定系數R2=0.997 2，調整決定系數R2adj=0.993 7，預測決定系數R2pre=0.970 2，這表明擬合程度良好，可以采用此模型預測突變株的酯酶酶活力。由P值可知，一次項A、B、C，交互項AB、AC，二次項A2、B2、C2對結果影響極顯著（P＜0.01），交互項BC對結果影響顯著（P＜0.05）。由F值可知，3個因素對酯酶酶活力影響的大小順序為：A（發酵時間）＞B（發酵溫度）＞C（初始pH值）。

發酵時間、發酵溫度和初始pH值交互作用對突變株ARUV3-26產酯酶能力影響的響應面及等高線見圖7。由圖7可知，AB、AC交互作用對結果影響極顯著（P＜0.01），BC交互作用對結果影響顯著（P＜0.05），這與表3方差分析結果一致。

圖7 各因素間交互作用對酯酶酶活力影響的響應面及等高線Fig.7 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on esterase activities

經Design-Expert 13.0軟件分析，突變菌株ARUV3-26最優發酵條件為發酵時間3.133 d，發酵溫度30.133 ℃，初始pH值為7.133。在此條件下，酯酶活力預測值為30.830 U/mL。再根據實際操作條件，調整最優發酵條件為：發酵時間3.0 d、發酵溫度30 ℃、初始pH值為7.0。在此優化條件下，進行3次平行驗證試驗，酯酶活力實際值為（30.67±0.17）U/mL，與預測值十分接近。上述試驗結果表明該方程擬合性好，模型準確。

3 結論

本研究采用實驗室前期篩選出的菌株格氏乳球菌S5-4，進行三輪ARTP-紫外復合誘變。篩選出一株高產酯酶的突變株ARUV3-26，酶活力為（25.88±0.02）U/mL比初始酶活提高了64.42%。經15代傳代測試后，突變株酶活穩定在（23.51±0.02）～（23.56±0.02）U/mL，與初始菌株相比提高49.36%～49.68%。突變株ARUV3-26與原始菌株L.garvieaeS5-4相比，突變株ARUV3-26的溫度耐受性、pH耐受性、葡萄糖耐受性、乙醇耐受性、丁酸和己酸耐受性均有一定的提升。單因素試驗優化液體發酵培養基條件，確定的最優發酵培養基為：葡萄糖20 g/L，蛋白胨15 g/L，NaCl 5 g/L。通過單因素試驗和響應面優化突變株ARUV3-26的發酵條件，所得到最佳的發酵條件為：發酵時間3.0 d、發酵溫度30 ℃、初始pH值為7.0。此時突變株ARUV3-26產酯酶酶活力為（30.67±0.17）U/mL，比原始菌株S5-4的產酯酶能力提高了30.45%。本研究為產酯酶細菌的選育與培養提供參考。