青稞蕨麻酵素發酵工藝優化及其品質評價

文華英，王傅玉，張玉紅*

（1.西藏自治區農牧科學院 農產品開發與食品科學研究所，西藏 拉薩 850000；2.西藏農牧學院 食品科學學院，西藏 林芝 860000）

食用植物酵素是以植物為原料，經微生物發酵制得的含有特定生物活性成分可食用的酵素產品[1]，具有美容養顏、降脂、解酒、促進消化等[2-3]功效。以原料種類為劃分依據可分為包括谷物酵素、水果酵素、蔬菜酵素和藥食同源植物酵素類酵素等在內的單一型酵素和復合型酵素[4]。研究表明，經過乳酸菌發酵不僅提高酵素的黃酮等功能性成分含量和人體吸收率[5-9]，還增加芳香化合物含量[10]改善風味。藥食兩用植物酵素兼具食藥兩用特點，經微生物發酵溶出功效酶、多酚、有機酸和多糖等多種活性成分，能降低活性氧引起的機體傷害[11]。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是酵素的功效酶之一，可催化超氧陰離子自由基（O2-·）歧化成分子氧和過氧化氫[12]，是生物體內O2-·的天然消除劑，是抗氧化酶防御系統的第一道和最重要的一道防線[13]，在應對氧化應激中起關鍵作用[14]，保護生物體細胞。

青稞（Hordeum vulgareL.）為大麥屬禾谷類作物[15]，富含β-葡聚糖、多酚等功能因子，具有抗氧化、抗腫瘤、降糖、抗心血管疾病等多種生物活性，因此青稞具有改善人體生理功能的潛力[16]。蕨麻（Potentilla anserinaL.），藏文中又稱“延壽草”、“仙人果”和“戳瑪”等，是食藥兩用植物，為薔薇科委陵菜屬植物鵝絨委陵菜的塊根，具有悠久的食用歷史，在我國主要分布在青藏高原地區[17-18]。多糖、黃酮和皂苷等活性物質賦予蕨麻顯著的抗缺氧、抗氧化、增強免疫力和保肝等功效[19-21]。目前，對青稞食飲品的研究有青稞酒類、青稞面包、青稞蛋糕、能浸泡出功能成分的烘焙青稞、通過藏靈菇發酵富集青稞中β-葡聚糖和γ-氨基丁酸等[22-28]，對蕨麻也有蕨麻酸奶、蕨麻蘇打餅干、未發酵的蕨麻復合飲料等[29-31]研究，而酵素類飲品的研究較少報道。

該研究以16株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）為研究對象，對其酸、糖耐受性進行分析，選取一株耐受性能優良的發酵菌株，并以篩選菌株為發酵劑，青稞、蕨麻為主要原料制備青稞蕨麻酵素。以超氧化合物歧化酶（SOD）酶活性為響應值，采用單因素試驗及響應面試驗對其發酵工藝條件進行優化，并對其理化指標及抗氧化活性進行分析，以期為研發含高抗氧化性的青稞蕨麻酵素功能飲品提供參考，豐富青稞和蕨麻資源應用的多樣性，為開發具備抗氧化功能的食藥同源型酵素提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

青稞和蕨麻：購自拉薩市場；試驗涉及的16株植物乳桿菌由西藏自治區農牧科學院農產品開發與食品科學研究所保存，分別為LL1-5、LL1-6、LL2-3、LL2-4、LL3-3、LL3-4、LL4-5、LL5-2、LL5-3、LL5-4、LL6-1、LL6-2、LL6-6、LL7-1、LL7-3和LL7-4。

1.1.2 培養基

MRS瓊脂培養基、MRS肉湯培養基：北京陸橋技術股份有限公司。

1.1.3 試劑

無水葡萄糖（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；甜酒曲：安琪酵母股份有限公司；可滴定酸檢測試劑盒：上海撫生實業有限公司；氨基酸含量檢測試劑盒、還原糖含量檢測試劑盒、SOD酶活性檢測試劑盒、鐵離子還原/抗氧化能力（ferric ion reducing/antioxidant power，FRAP）法檢測試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；1,1二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基（DPPH·）測定試劑盒、抑制與產生超氧陰離子（O2-·）自由基測定試劑盒、羥自由基（·OH）測定試劑盒、植物總酚檢測試劑盒、植物類黃酮檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-7502PCS紫外-可見光分光光度計：上海欣茂儀器有限公司；K6600-B酶標儀：北京凱奧科技發展有限公司；PH400 pH計：科邦檢測集團有限公司；LRH-250生化培養箱：上海齊欣科學儀器有限公司；TGL-16MS臺式高速冷凍離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；TS-5000Z日本INSENT味覺分析系統：北京盈盛恒泰科技有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 青稞蕨麻酵素加工工藝流程及操作要點

操作要點：

原料準備：挑選籽粒飽滿軟硬適中的青稞40 g，清洗干凈后加入約2/3質量的無菌水浸泡24 h，煮至爆腰后控干晾涼至28 ℃備用。干蕨麻洗凈后晾干，用粉碎機粉碎后過100目篩，并稱取20 g蕨麻粉與青稞混合。

拌曲糖化：向青稞蕨麻混合物中接入甜酒曲[32]（0.15 g甜酒曲/10 g干物料），拌曲搭窩，在30 ℃下密封糖化1.5 d。

加糖滅菌：添加一定量的糖可為微生物提供合適的碳源[33]并提升發酵產品的口感，向糖化結束后的半固體物料中補充18 g白砂糖和150 g無菌水，85 ℃下保溫2 h滅菌，晾涼至室溫。

接種發酵：按3%（V/V）接入篩選菌株，混勻后在35 ℃條件下發酵5 d。

離心滅菌：發酵結束后紗布過濾，室溫條件下4 500 r/min離心10 min后分離取上清液，60 ℃巴氏殺菌30 min后即得成品。

1.3.2 發酵劑的篩選

（1）植物乳桿菌種子液的制備

將-80 ℃條件下保存的16株植物乳桿菌解凍后于MRS平板上劃線，挑取單菌落入MRS液體培養基中，在30 ℃條件下恒溫靜置活化16～18 h，重復活化2～3次后制備成107～108CFU/mL的菌懸液備用。

（2）耐酸能力測定和耐糖能力測定

用2 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH配制不同pH值（3.0、3.5、4.0）的MRS液體培養基，用無水葡萄糖配制不同含糖量（25%、30%、35%）的MRS液體培養基。將上述菌懸液以1%（V/V）的接種量分別接種于上述培養基中，30 ℃靜置培養24 h，測定OD600nm值，以未處理的MRS液體培養基為對照，按照以下公式計算存活率：

式中：A為生長在酸化或糖化處理的MRS液體培養基中植物乳桿菌的OD600nm值；B為生長在未處理的MRS液體培養基中植物乳桿菌的OD600nm值。

（3）生長曲線和產酸曲線測定

菌懸液以1%（V/V）接種量接種到MRS液體培養基中，30 ℃靜置培養48 h。生長曲線的取樣時間為：前16 h內，每隔2 h取樣一次，16～48 h內，每隔4 h取樣一次測定菌液OD600nm值；產酸曲線的取樣時間為：前8 h內，每隔2 h取樣一次，8～48 h內，每隔4 h取樣一次測定pH值。

1.3.3 青稞蕨麻酵素發酵工藝優化

單因素試驗：采用單因素輪換法分別考察蕨麻添加量（2.4%、4.8%、7.2%、9.6%、12.0%）（以干青稞和糖水的質量計）、發酵時間（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）、發酵溫度（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）對青稞蕨麻酵素SOD酶活性的影響。

響應面試驗：在單因素試驗的基礎上，選取蕨麻添加量（A）、發酵時間（B）、發酵溫度（C）為自變量，以SOD酶活性（Y）為響應值，設計Box-Behnken試驗對青稞蕨麻酵素發酵工藝條件進行優化，因素與水平見表1。

表1 發酵條件優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation conditions optimization

1.3.4 分析檢測

（1）理化指標和體外抗氧化能力檢測

總酸含量、氨基酸含量、還原糖含量、總酚含量、類黃酮含量、SOD酶活性、鐵離子還原/抗氧化能力、DPPH·清除能力、抑制O2-·能力、·OH清除能力：均采用相應試劑盒進行檢測。

（2）電子舌檢測

進樣體積25 mL，數據采集時間120 s，采集周期1 s，清洗時間為10 s。電子舌所得所有數據均是以人工唾液（參比溶液）為標準的絕對輸出值，電子舌測試人工唾液的狀態，模擬人口腔中只有唾液時的狀態。其中參比溶液的輸出值為無味點（tasteless），參比溶液（reference）由氯化鉀和酒石酸組成味覺值。每份樣品按照平行測試5次，進行分析處理。導出數據時，將響應值轉化成味覺值，開展后續分析。

1.3.5 數據處理

每個試驗重復3次，利用Design-Expert 8.0軟件進行響應面設計，Origin 2021軟件作圖，SPSS 21統計軟件對數據進行統計處理和顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 發酵劑的篩選

2.1.1 耐酸能力測定不同菌株對pH值的耐受性試驗檢測結果見圖1。

圖1 不同菌株對pH值的耐受性Fig.1 Tolerance of different strains to pH

由圖1可知，低酸環境對16株植物乳桿菌的生長有明顯抑制作用。pH 4.0條件下，16株菌株存活率為37.38%～61.05%，其中菌株LL6-1的存活率最高，為61.05%，與其余菌株有顯著差異（P＜0.05）；其次為菌株LL7-4和LL6-6，其存活率分別為58.21%、58.18%。pH 3.5條件下，16株菌株存活率為11.0%～30.34%，其中菌株LL6-1的存活率最高，為30.34%，與其余菌株有顯著差異（P＜0.05）；其次為菌株LL6-2和LL7-4，其存活率分別為29.53%、29.08%。pH 3.0條件下，16株菌株存活率為1.51%～4.26%，其中菌株LL7-4、LL6-2、LL7-3和LL6-1較高，均＞4.00%，4株菌的存活率無顯著差異（P＞0.05）；綜上可知，菌株LL6-1的耐酸能力較高。

2.1.2 耐糖能力測定

不同菌株對葡萄糖含量的耐受性試驗結果見圖2。

圖2 不同菌株對葡萄糖含量的耐受性Fig.2 Tolerance of different strains to glucose contents

由圖2可知，葡萄糖含量為25%時，16株菌株存活率為26.85%～29.76%，其中菌株LL6-1和LL1-6存活率較高，分別為29.76%、29.40%，二者無顯著差異（P＞0.05）。葡萄糖含量為30%時，菌株存活率為18.48%～21.37%，其中菌株LL6-1、LL5-2和LL4-5存活率較高，分別為21.37%、21.35%和21.08%，三者無顯著差異（P＞0.05）。葡萄糖含量為35%時，16株菌存活率為12.10%～19.00%，其中菌株LL5-2、LL6-1和LL7-4存活率較高，分別為19.00%、18.64%、18.13%，三者無顯著差異（P＞0.05）。綜上可知，菌株LL6-1的耐糖能力較高。因此，選擇耐酸和耐糖能力均較強的菌株LL6-1為發酵劑。

2.1.3 生長曲線和產酸曲線測定

菌株LL6-1的生長曲線和產酸曲線見圖3。由圖3可知，菌株LL6-1無生長停滯期，直接進入對數生長，培養20 h進入生長穩定期直至48 h，可見其生長速度較快；此外，隨著菌株LL6-1的生長，0～16 h內菌液的pH值呈持續下降趨勢，當培養16 h時，pH值降至4.0，16～48 h趨于平穩，最終降至3.74，產酸能力較強。

圖3 菌株LL6-1的生長曲線和產酸曲線Fig.3 Growth curve and acid production curve of strain LL6-1

2.2 青稞蕨麻酵素發酵工藝條件優化

2.2.1 單因素試驗結果

利用單因素試驗考察蕨麻添加量、發酵時間和發酵溫度3個因素對酵素SOD酶活性的影響，結果見圖4。

圖4 發酵條件優化單因素試驗結果Fig.4 Results of single factor tests for fermentation conditions optimization

由圖4A可知，當蕨麻添加量為2.4%～12.0%時，SOD酶活逐漸增加；當蕨麻添加量為9.6%時，SOD酶活達到最大值，為4 915.57 U/mL；當蕨麻添加量＞9.6%時，SOD酶活有所下降。因此，確定最適蕨麻添加量為9.6%。由圖4B可知，當發酵時間為1～4 d時，SOD酶活性逐漸增加；當發酵時間為4 d時，SOD酶活性達到最大，為10 718.21 U/mL；當發酵時間＞4 d時，SOD酶活性逐漸下降。隨著發酵時間的延長，體系中有機酸酸含量增加pH值降低，降低了SOD酶活性，與程楊等[23]結果一致。因此，確定最適發酵時間為4 d。圖4C可知，當發酵溫度為15～30 ℃時，SOD酶活性逐漸增加；當發酵溫度為30 ℃時，SOD酶活性達到最高值，為6 626.32 U/mL；當發酵溫度＞30 ℃，SOD酶活性有所下降，這與程楊等[34]的研究結果基本一致。因此，確定最適發酵溫度為30 ℃。

2.2.2 響應面試驗結果與方差分析

在單因素試驗的基礎上，選取蕨麻添加量（A）、發酵時間（B）、發酵溫度（C）為自變量，以SOD酶活性（Y）為響應值，利用Box-Behnken設計3因素3水平響應面試驗，試驗設計與結果見表2，方差分析見表3。

表2 發酵條件優化響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface tests for fermentation conditions optimization

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

通過響應面回歸分析，獲得各因素對SOD酶活性的二次回歸方程：

Y=1 112.07+3.93A-11.38B+7.16C-18.36AB-4.71AC-5.53BC-

335.28A2-154.75B2-158.44C2

由表3可知，該二次方程模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P值=0.465 6＞0.05），決定系數R2=100%，調整決定系數R2adj=100%，表明該模型擬合程度良好，可用該模型推測試驗結果。由P值可知，一次項、二次項及交互項均對SOD酶活性的影響極顯著（P＜0.01）。由F值可知，影響SOD酶活性的各因素主次順序為：發酵時間（B）＞發酵溫度（C）＞蕨麻添加量（A）。

響應曲面坡度越陡，等高線越密集，表明交互作用顯著。各因素之間交互作用對SOD酶活性影響的3D響應曲面見圖5。由圖5可知，蕨麻添加量（A）、發酵時間（B）、發酵溫度（C）因素之間交互作用均極顯著（P＜0.05）。這與方差分析結果一致。

圖5 各因素間交互作用對超氧化歧化酶酶活性影響的響應曲面Fig.5 Response surface plots of interaction between various factors on the superoxide dismutase activity

2.2.3 驗證試驗

利用Design-Expert 8.0軟件分析得到青稞蕨麻酵素的最佳發酵工藝條件為：蕨麻添加量9.62%、發酵時間3.96 d、發酵溫度30.11 ℃，在此優化條件下，青稞蕨麻酵素的SOD酶活性預測值為1 112.38 U/mL。為方便操作，將發酵條件修正為：蕨麻添加量9.6%、發酵時間4 d和發酵溫度30 ℃，試驗重復3次，SOD酶活性實際值為1 112.07 U/mL，實際值接近預測值，說明模型有效，此酵素的SOD酶活性符合QB/T5323—2018《植物酵素》[34]規定的SOD酶活性≥15 U/L的要求。

2.3 酵素的理化指標及抗氧化活性分析

酵素的理化指標及抗氧化活性檢測結果見表4。由表4可知，青稞蕨麻酵素總酸含量為3.93%，滿足液態食用植物酵素總酸含量0.8 g/100 g的要求[35]。除了含有氨基酸和還原糖，該酵素還含有多酚和類黃酮活性物質，說明其有一定抗氧化功能，其DPPH·、O2-·和·OH清除或抑制能力以及鐵離子還原/抗氧化能力分別為1 710.18 μg Trolox/mL、777.17 U/L、1 701.31 U/mL和6.39 μmol/mL，表明青稞蕨麻酵素具有抗氧化活性。

表4 酵素的理化指標及抗氧化活性檢測結果Table 4 Determination results of physicochemical indexes and antioxidant activities of Jiaosu

2.4 酵素的電子舌分析

對照無味點[36]分析青稞蕨麻酵素的味覺特征，電子舌味覺分析雷達圖見圖6。

圖6 電子舌分析雷達圖Fig.6 Radar map of electronic tongue analysis

由圖6可知，青稞蕨麻酵素的咸味和豐富度（鮮味回味）低于無味點，苦味回味和澀味回味接近無味點，表明品嘗該酵素時不能嘗出咸味和豐富度（鮮味回味），且很難嘗出苦味回味和澀味回味。酸味、苦味、甜味、澀味和鮮味高于無味點，說明這5味是該酵素的味覺指標，其中酸味最突出，苦味次之，若食用需增加甜味改善口感。

3 結論

本研究以青稞、蕨麻為主要原料制備酵素，以SOD酶活性為評價指標，確定最優發酵工藝條件為蕨麻添加量9.6%、發酵時間4 d、發酵溫度30 ℃。在此優化條件下，SOD酶活性為1 112.07 U/mL?？偹?、還原糖、氨基酸、總酚、類黃酮含量分別為3.93%、29.22 mg/mL、1.06 μmol/mL、3.03 mmol/L、184.91 mg/L。此外，其DPPH·、O2-·和·OH清除或抑制能力以及鐵離子還原/抗氧化能力分別為1 710.18 μg Trolox/mL、777.17 U/L、1 701.31 U/mL和6.39 μmol/mL，表明青稞蕨麻酵素具有抗氧化活性。本研究不僅豐富了青稞和蕨麻酵素產品種類，還為植物乳桿菌發酵制備抗氧化功能的青稞蕨麻酵素提供數據支持。