鴨坦布蘇病毒單克隆抗體的制備和治療效果分析

王丹娜,烏 蘭,李 三

[ 兆豐華生物科技(南京)有限公司北京生物醫藥科技中心,北京 大興 102600 ]

鴨坦布蘇病毒病是由鴨坦布蘇病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)引起一種急性、病毒性傳染病,發病鴨主要出現角弓反張、站立不穩和癱瘓,而產蛋鴨感染后則出現產蛋率下降、卵泡破裂出血和卵黃性腹膜炎等[1-2]。2010年,我國南方地區鴨群首次發生了鴨坦布蘇病毒病,隨后,全國各地陸續出現關于該病的相關報道[3-4]。目前,DTMUV已在我國全國范圍內廣泛流行,嚴重威脅著養鴨業的健康發展[5-6]。DTMUV屬于黃病毒科、黃病毒屬的單股正鏈RNA病毒,其基因組約為11 000 bp,可編碼1個大多聚蛋白,在自身和宿主細胞酶的作用下,可分為3種結構蛋白(E、prM和C)和7種非結構蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。E蛋白位于DTMUV表面,包括了DTMUV的主要中和表位,可誘導機體產生中和抗體[7]。

由于坦布蘇病毒病滅活疫苗或弱毒疫苗的廣泛應用,該病已經在我國大部分地區得到有效防控,但在我國部分地區免疫鴨群中仍在流行,主要是由于DTMUV疫苗毒株與新流行毒株交叉保護性較差,保護不夠全面[8-10]。因此,迫切需要一種新技術、新思路來彌補疫苗免疫存在的不足。具有中和活性的單克隆抗體[11-14]被認為是一種具有廣闊應用前景的治療鴨坦布蘇病毒病的方式。本試驗旨在制備和篩選出對DTMUV具有高度中和作用的單克隆抗體,不僅在生產實踐中可用于緊急預防和治療DTMUV感染,還可以用于研制抗獨特型抗體疫苗和進行中和表位鑒定,減少甚至阻斷DTMUV在國內的傳播流行。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑 pET-30a質粒、大腸桿菌(Escherichia.coli)DH 5α感受態、E.coliBL 21(DE3)感受態和T4連接酶,均購自寶日醫生物技術(北京)有限公司;限制性內切酶EcoR I和XhoI,均購自New England Bio Labs公司;質粒小提試劑盒,購自愛思進生物技術(杭州)有限公司;辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)標記的山羊抗小鼠IgG,購自KPL公司;蛋白質分子量Marker,購自富酶泰斯生物技術(深圳)有限公司;DAB顯色液,購自北京中杉金橋公司;完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑,均購自Sigma公司;TRIzol、反轉錄試劑盒和pMD-18T載體,均購自Invitrogen公司;膠回收試劑盒,購自天根生化科技(北京)有限公司;鎳柱親和層析純化柱,購自南京金斯瑞生物科技有限公司;TrueBlue,購自武漢純度生物科技有限公司;低熔點瓊脂糖,購自Solarbio公司;鴨A型肝炎病毒、呼腸孤病毒、新城疫病毒、細小病毒、H9亞型禽流感病毒和BHK21細胞(乳倉鼠腎細胞),均來自兆豐華生物科技(南京)有限公司北京生物醫藥科技中心。

1.2 主要儀器和設備 CO2細胞培養箱、Multiskan SkyHigh 酶標儀購和生物安全柜,均購自Thermo Fisher;倒置顯微鏡,購自日本Olympus;離心機,購自 Eppendorf;蛋白質電泳儀,購自美國伯樂。

1.3 實驗動物 SPF級BALB/c小鼠,6周齡,雌性,購自斯貝福(北京)生物技術有限公司,生產許可證號:SCXK(京)2019—0010。

1.4 DTMUVE基因的PCR擴增 本試驗所用DTMUV河北株(HB)分離自某發生產蛋下降鴨群的病死鴨。根據GenBank中登錄的DTMUVE基因序列,設計并合成1對特異性引物,即PEF:5′-AT-GAATTCTTCAGCTTCTGGGGATGCAG-3′(劃線部分為引入EcoR Ⅰ)和PER:5′-ATCTCGAGTAAGGC-ATTGACATTTACTGCC-3′(劃線部分為引入XhoⅠ)。RNA的提取參照TRIzol說明書進行,反轉錄反應總體積為20 μL:RNA 8 μL,dNTP 2 μL,隨機引物2 μL,于99 ℃變性5 min,冰中快速冷卻,再加入反轉錄酶AMV 1 μL,5×AMV 緩沖液4 μL,超純水3 μL,42 ℃ 作用60 min,然后75 ℃ 15 min。以反轉錄產物cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系(100 μL):10×Ex-Taq緩沖液10 μL,2.5 mmol/L dNTP 6 μL,cDNA 2 μL,引物各1 μL,Ex-TaqDNA聚合酶0.5 μL,超純水79.5 μL。PCR反應條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1.5 min,32個循環,72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。

1.5 E蛋白的表達和純化 利用膠回收試劑盒純化與預期大小相符的DTMUVE基因PCR擴增產物,并連接至pMD-18T載體,轉化至E.coliDH5α感受態,質粒小提試劑盒提取質粒,限制性內切酶EcoR I和XhoⅠ進行雙酶切鑒定,與預期相符的質粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行核苷酸序列測定,陽性重組質粒命名為“pMD-E”。將重組質粒pMD-E和質粒pET-30a分別經EcoR I和XhoⅠ雙酶切,利用膠回收試劑盒分別回收E基因和酶切后的pET-30a。在T4連接酶作用下,將E基因連接至pET-30a載體,連接產物轉化E.coliDH5α感受態,質粒小提試劑盒提取質粒,經EcoR I和XhoⅠ雙酶切,1%瓊脂糖凝膠電泳下觀察鑒定結果,鑒定正確的重組質粒命名為“pET30-E”。將重組質粒pET30-E轉化E.coliBL21(DE3),37 ℃振蕩培養至對數生長期時,加入終濃度為1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)進行誘導,十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析誘導產物。將誘導的蛋白菌體離心,加入8 mol/L尿素溶解沉淀,離心取上清,按照鎳柱親和層析純化柱說明書進行E蛋白的純化。

1.6 雜交瘤細胞株的獲得 將經純化的E蛋白與等體積弗氏不完全佐劑混合、乳化,按照E蛋白100 μg/只的劑量腹腔注射6周齡雌性BALB/c小鼠,間隔2周,將E蛋白與弗氏完全佐劑等體積混合、乳化,按照E蛋白100 μg/只的劑量加強免疫,間隔3周,再按照加強免疫劑量免疫1次,間隔2周,尾靜脈采血,采用酶聯免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)測定E蛋白抗體水平。無菌取小鼠的脾臟,分離脾細胞,在聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)作用下將脾細胞與SP2/0細胞進行融合。利用建立好的ELISA方法檢測融合細胞上清中E蛋白抗體,以SP2/0細胞上清作為陰性對照,將抗體陽性的細胞孔及時亞克隆至雜交瘤細胞生長孔,篩選至抗體陽性率達100%為止。

1.7 單克隆抗體的制備和鑒定 將滅菌的石蠟油經腹腔注射小鼠,1周后再注入雜交瘤細胞,生成腹水后抽取腹水。利用Western blot進行腹水中的E蛋白單克隆抗體的鑒定,將表達的DTMUV E蛋白和pET-30a空載體誘導的蛋白(作為空白對照)進行SDS-PAGE,轉印至硝酸纖維素膜,以1 000倍稀釋的腹水為一抗,5 000倍稀釋的HRP標記山羊抗小鼠IgG為二抗。利用間接免疫熒光法對DTMUV、鴨A型肝炎病毒、呼腸孤病毒、新城疫病毒、細小病毒和H9亞型禽流感病毒感染的細胞進行檢測。

1.8 蝕斑減少中和試驗(Plaque reduction neutralization test,PRNT) 利用Protein G親和層析柱對單克隆抗體進行純化。以非中和的同型對照單克隆抗體作為陰性對照。將純化的單克隆抗體連續10倍倍比稀釋加入到約100 PFU的DTMUV中,并在37 ℃孵育1 h,然后將混合物(200 μL/孔)添加到BHK-21單層細胞中,37 ℃孵育1 h。去除上清,然后將300 μL 1%(W/V)低熔點瓊脂糖[2%(W/V)低熔點瓊脂糖和含4%(V/V)FBS的2×DMEM培養基按照1∶1等體積混合]鋪在細胞表面,37 ℃再培養4 d后,用TrueBlue進行染色,記錄蝕斑數,使用Reed-muench法計算50%蝕斑減少中和滴度(50% plaque reduction neutralization antibody titer,PRNT50)。

1.9 小鼠保護試驗 使用SPF級BALB/c小鼠評估制備的具有中和作用的單克隆抗體對DTMUV感染的保護效果。將105只BALB/c小鼠平均分為7個組,每組15只,第1～5組為治療組,第6組為攻毒對照組,第7組為空白對照組。第0天(在0 dpi)用100 PFU DTMUV HB株病毒液經腦內感染第1～6組小鼠,第7組注射相同體積的PBS;第1～5組分別于感染后1、2、3、4和5 d,將單克隆抗體按照20 mg/(kg·bw)劑量肌肉注射小鼠,連續觀察14 d,記錄小鼠的體重變化、臨床癥狀和死亡數量。收集感染小鼠的血清,同1.8操作,在BHK-21細胞中測定DTMUV蝕斑數并分析中和抗體水平。

2 結果

2.1 E蛋白的克隆、表達和純化 利用引物PEF和PER進行PCR擴增,瓊脂糖凝膠電泳觀察獲得約1 503 bp的特異條帶(圖1A),與E基因預期片段大小相同。E基因與載體pET-30a連接后制備重組質粒,經EcoR I和XhoⅠ雙酶切后,可見約5 700和1 500 bp的目的條帶(圖1B),與預期結果相符,表明成功獲得重組質粒pET30-E。pET30-E經IPTG誘導后的SDS-PAGE電泳結果顯示,與空白對照相比較,含重組質粒pET30-E的E.coliBL21(DE3)裂解后沉淀物中出現分子量約65 kDa的蛋白條帶(圖2A),與預期結果相符。經鎳柱親和層析純化后,在分子量約為65 kDa處出現唯一條帶(圖2B),與預期結果相符。

圖1 重組質粒pET30-E的鑒定

圖2 重組E蛋白的表達和純化

2.2 單克隆抗體的鑒定 經3次亞克隆,通過ELISA篩選獲得可穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株,獲得1株單克隆抗體,為4A1。Western blot結果顯示,4A1株單克隆抗體能與原核表達的65 kDa大小的E蛋白特異性結合(圖3),而與空白對照沒有發生反應,說明單克隆抗體針對目的E蛋白,排除了針對His標簽的可能性。間接免疫熒光結果顯示,4A1株單克隆抗體可以與DTMUV感染36 h后的BHK-21細胞發生免疫反應(圖4),而與鴨A型肝炎病毒、呼腸孤病毒、新城疫病毒、細小病毒和H9亞型禽流感病毒感染的BHK-21細胞無交叉反應(圖略)。

圖3 單克隆抗體的Western blot鑒定

圖4 單克隆抗體的間接免疫熒光鑒定(100×)

2.3 單克隆抗體4A1蝕斑減少中和試驗 結果顯示,PRNT50濃度為(0.32±0.10) μg/mL時,單克隆抗體4A1能有效中和DTMUV。

2.4 單克隆抗體4A1小鼠保護試驗 結果顯示,第6組小鼠在DTMUV人工感染4 d后開始表現厭食、精神沉郁和后肢癱瘓等典型臨床癥狀,在感染5 d后,小鼠開始出現死亡,總死亡率達60.0%(9/15);第1、2、3組分別在DTMUV感染1、2和3 d后使用單克隆抗體4A1治療,小鼠未見明顯的臨床癥狀,全部存活;第4、5組分別在DTMUV感染4和5 d后使用單克隆抗體4A1治療,小鼠的死亡率分別為20.0%(3/15)和53.3%(8/15)。

小鼠體重變化方面,第6組小鼠在DTMUV感染后4 d出現體重下降,并持續至感染后10 d,體重從降低原體重的5.42%變化至降低原體重的36.16%;第1～3組小鼠的體重無明顯變化,和第7組相比無差異;第4、5組小鼠體重分別減輕了原體重的1.50%～9.78%和2.12%～18.97%(圖5)。

圖5 各組小鼠體重變化

血清中DTMUV病毒滴度測定結果顯示,第6組小鼠在DTMUV感染后4 d血清中病毒滴度最高;第1、2、3組小鼠分別在DTMUV感染后1、2和3 d使用單克隆抗體4A1治療,小鼠血清中DTMUV滴度逐漸降低(圖6)。

圖6 感染小鼠血清中DTMUV滴度

3 討論

DTMUV與大多數黃病毒屬病毒相同,E蛋白被認為是其主要保護性抗原,可誘導機體產生中和抗體。本試驗以原核表達的E蛋白作為抗原免疫小鼠,將脾細胞與SP2/0細胞融合后,篩選出特異性強、對DTMUV具有中和作用的單克隆抗體4A1。

抗體在機體內發揮綜合作用,表現在通過與病毒結合,進而清除病毒和阻礙病毒擴散。小鼠保護試驗結果顯示,單克隆抗體4A1能夠100%保護DTMUV感染的BALB/c 小鼠,可完全清除小鼠血液中的DTMUV,具有明確的治療作用。

目前,雖然沒有DTMUV引發人類疾病的報道,但最近的調查證實,在鴨養殖場工作人員體內可檢測到DTMUV抗體和DTMUV RNA[6,15]。另外,動物模型試驗還證明,DTMUV對小鼠具有年齡依賴性的神經侵襲破壞作用[16],DTMUV可介導所有黃病毒所引發的抗體依賴增強(Antibody-dependent enhancement,ADE)感染疾病的嚴重性[17],對人類存在潛在的生物安全風險。坦布蘇病毒病仍然是對鴨養殖業危害最大的傳染病之一,不僅給鴨養殖業造成重大經濟損失,還可造成鵝和雞等的感染發病[18-19]。盡管我國廣泛使用各種坦布蘇病毒病疫苗進行免疫,但仍未完全控制該病的局部發生和流行。與傳統疫苗免疫相比,4A1對于DTMUV的特異性更強,能夠快速識別DTMUV并與之結合,可在較短的時間內清除體內的DTMUV,能夠更好的應對該病流行,對實際生產中DTMUV感染的控制具有積極意義。但該4A1單克隆抗體由于是在小鼠中制備,在鴨群使用過程中可能存在潛在的免疫排斥問題。