脂聯素通過上調PPARα/HOXA10 通路改善多囊卵巢綜合征大鼠的子宮內膜容受性

王 娟，楊雯欽，劉 進，石金鳳，肖 萍，李美香

1南華大學衡陽醫學院//組織胚胎學教研室//應用解剖與生殖醫學研究所//顯微形態實驗中心，湖南 衡陽 421001；2湖南省人民醫院生殖醫學中心//湖南師范大學附屬第一醫院，湖南 長沙410002

多囊卵巢綜合征（PCOS）是一種復雜的內分泌和代謝異常所致的疾病，是育齡期女性不孕的最常見原因［1］。子宮內膜容受性受損和排卵障礙/無排卵都是多囊卵巢綜合征相關不孕的重要原因［2,3］。然而，子宮內膜的變化從未像排卵功能障礙那樣受到關注［4］。

子宮內膜容受性指子宮內膜接受胚泡著床、發育成胚胎的能力。哺乳動物的子宮內膜在“種植窗期”表現出最大的容受性。研究表明，子宮內膜容受性差是引起著床失敗的主要原因［4,5］。影響子宮內膜容受性的因素主要有子宮內膜上皮細胞的胞飲突發育、子宮內膜的厚度、血流灌注水平和分子生物學等［6,7］。如何對PCOS患者子宮內膜容受性做出合適的評價和相應的改善措施來提高妊娠成功率，已成為生殖醫學系統研究的焦點［2,4,5］。

脂聯素（APN）作為一種具有胰島素增敏、抗炎、抗動脈粥樣硬化和抗增殖作用的新型脂肪因子［8,9］能直接調節生殖和胚胎著床過程［9,10］。研究發現子宮內膜中APN的動態平衡和抗炎作用可影響子宮內膜容受性和胚泡植入［10］。PCOS患者體內APN水平低于正常人［11］，其血清APN水平與胰島素抵抗（IR）呈負相關［12］。PCOS大鼠子宮內膜APN信號通路受損［13］。以上研究結果提示，APN與PCOS子宮內膜容受性有關，但其作用及機理目前尚未闡明。

過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）是一種激素激活核受體和轉錄因子，可調節脂質代謝、脂肪生成、胰島素敏感、炎癥反應、細胞生長和分化［14］，可參與卵巢雌、孕激素的合成并影響受孕，與生殖活動密切相關等［15］。PPAR家族存在PPARα、PPARβ和PPARγ3種亞型，在PCOS大鼠子宮內膜中均表達下調［16］，其中PPARα可能和PCOS患者代謝紊亂有關［17］，但其是否參與生殖功能的調節目前尚無相關報道。有研究發現APN可以通過其受體I 活化p38/MAPK 從而保護妊娠［18］。但APN是否可以通過上調PPARα的表達，改善PCOS子宮內膜容受性目前尚不明確。

本研究擬利用來曲唑建立大鼠PCOS模型，用APN及PPARα特異性抑制劑處理PCOS大鼠，觀察大鼠動情周期的改變、卵巢和子宮組織形態學改變、血清激素和相關蛋白水平的變化，檢測大鼠子宮內膜胞飲突的發育及評估大鼠生育能力，探討APN對PCOS大鼠子宮內膜容受性的作用及可能機制，為APN應用于臨床提供實驗依據和理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6周齡SD雌性大鼠50只，SPF級，購于長沙市天勤生物技術有限公司，合格證號：NO.43006700 017929；體質量160～212 g。

1.1.2 藥物和試劑 來曲唑（浙江海正藥業股份有限公司）；APN（Sino Biological）；玉米油（山東三星玉米產業科技有限公司）；PPARα抑制劑（GW6471）（MCE）；兔抗HOXA10 多克隆抗體（Gene Tex）；兔抗PPARα抗體（Affinity Biosciences）；兔抗Tubulin抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）；二抗：羊抗兔（Proteintech）；廣譜預染蛋白Marker（北京索萊寶生物科技有限公司）；鋨酸（Ted Pella）；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、化學發光試劑盒和BCA蛋白濃度檢測試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）；通用二步法免疫組化檢測試劑盒和DAB kit（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立、分組和后期干預 SD大鼠適應性喂養1周后隨機分為正常組（CON組，n=10）、PCOS模型組（n=40）。CON組用生理鹽水2 mL/d灌胃，模型組用來曲唑1 mg/(kg·d)溶于生理鹽水中連續灌胃21 d，誘導PCOS模型。每日行陰道涂片（瑞氏染色）監測動情周期，動情周期紊亂視為造模成功。造模成功后，模型組隨機分為4組（n=10）：PCOS對照組（PCOS）、PAN干預組（PCOS+APN 組）、APN 聯合PPARα抑制劑（GW6471）干預組（PCOS+APN+GW組）、APN聯合玉米油陽性對照組（PCOS+APN+VEH組）。PCOS+APN組、PCOS+APN+GW組和PCOS+APN+VEH組均腹腔注射APN 10 μg/(kg·d)，連續20 d。其中PCOS+APN+GW組于第11天起同時腹腔注射PPARα特異性抑制劑（GW6471）1 mg/(kg·d)溶于玉米油中，PCOS+APN+VEH組于第11天起同時腹腔注射玉米油，連續10 d。每天檢測大鼠動情周期，每3 d檢測1次體質量。實驗期間動物自由飲水。所有操作均按照實驗動物倫理學要求進行（倫理號：USC202007DS38）。

1.2.2 取材及生化指標檢測 給藥結束后處死大鼠。處死前1 d，大鼠晚9點開始禁食12 h，于次日9點經烏拉坦（0.6 mg/kg）麻醉后，快速心臟取血，離心取血清分裝于-80 ℃保存備用。放射免疫法檢測血清激素濃度，羅氏血糖儀測定空腹血糖（FBG）。取卵巢、子宮，拍照并稱質量。將一半組織固定于4%多聚甲醛液中用于組織切片；另一半組織-80 ℃冰箱凍存待用。

1.2.3 大鼠動情周期監測 用生理鹽水浸濕的消毒棉簽擦拭子旋轉插入大鼠陰道側壁上1/3處，順時針方向涂抹1周，取出的棉簽沿同一方向涂抹于載玻片上，加1%瑞氏染色，在顯微鏡下觀察陰道涂片的細胞學變化，判斷動情周期。

1.2.4 卵巢和子宮形態學觀察 將固定于4%多聚甲醛溶液中的卵巢和子宮按常規方法制作石蠟切片后，蘇木素染色10 min，流水沖洗，鹽酸酒精分色3 s，流水沖洗，伊紅染色10 min，流水沖洗，自來水藍化直至細胞核染色清晰為止，經常規脫水、透明后封片，鏡下觀察。

她一一向我介紹她的家具：懶人沙發，逍遙椅，水晶吊燈和銀臺燈。并說，老同學喜歡什么就搬走什么，沒有問題。

1.2.5 免疫組織化學染色檢測子宮組織中PPARα和HOXA10蛋白的表達 采用SP二步法，將組織切片脫蠟、水化、水浴鍋加熱進行抗原修復；3%H2O2去離子水孵育阻斷內源性過氧化物酶，一抗PPARα（1∶1000）、HOXA10（1∶1000）4℃孵育過夜；PBS洗滌后，加反應增強液，室溫孵育20 min；PBS洗滌后，加相應二抗孵育，DAB顯色，自來水充分沖洗、蘇木素復染、梯度酒精脫水、透明、封片，顯微鏡下閱片并拍照。

1.2.6 Western blot免疫印跡檢測子宮組織中PPARα和HOXA10蛋白的表達 取子宮組織加裂解液研磨后，4 ℃、12 000 r/min離心20 min后取上清。按BCA試劑盒說明書操作檢測蛋白濃度，按比例加入5×的上樣緩沖液，煮沸后經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白；轉膜，5%的脫脂牛奶封閉。TBST 洗膜后，分別加入一抗PPARα（1∶5000）、HOXA10（1∶51000）、Tubulin（1∶5000）4 ℃冰箱孵育過夜；洗滌后分別加入相應的二抗標記物，常溫孵育2 h；用增強化學發光法顯色，凝膠成像儀成像，經Image J軟件分析后得到灰度值。

1.2.7 掃描電鏡觀察大鼠子宮內膜胞飲突的發育 取動情期大鼠新鮮子宮中段，用PBS漂洗后迅速投入戊二醇中室溫固定2 h，再轉移至4 ℃保存。固定好的樣品經PBS漂洗后用1%的鋨酸和PBS混合液（1∶1）室溫2 h，經乙醇梯度脫水后再干燥，金屬鍍膜處理后掃描電鏡觀察采圖。發育中的胞飲突，細胞表面形成光滑、菲薄的內膜突起；發育完全的胞飲突，微絨毛減少，子宮內膜表面突起，極大程度折疊，形如蘑菇；退化的胞飲突，突起減少，微絨毛在子宮內膜表面再次出現，突起物表面褶皺增多，細胞體積增大。如果在同一標本中觀察到不同發育階段的胞飲突，本資料僅描述了其最普遍存在的表達方式。胞飲突的數量根據子宮內膜表面被覆胞飲突面積的百分比（＞50%，20%～50%，＜20%）可被分成豐富、中等、少量3種［4］。在高倍掃描電鏡（×5000）下計數完全發育胞飲突數量，每例樣本選擇3個高倍鏡視野，取平均值。

1.2.8 大鼠生育力評估 正常組取4只、PCOS組3只及PCOS+APN、PCOS+APN+GW組、PCOS+APN+VEH組各取5只雌性大鼠，與同等情況下且具有生育能力的正常雄性大鼠按照雌雄1∶1比例分別合籠飼養，次日晨9∶00觀察陰栓及陰道涂片。發現陰栓或精子的大鼠記為孕第1天（D1），其余妊娠天數類推。于孕D10取材，觀察胚胎數量及發育情況。

1.2.9 圖像分析及統計學處理 圖片均采用Image J軟件處理和分析。所有計量數據均采用均數±標準差表示。統計學分析采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計學處理。兩組比較采用t檢驗，以Ρ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 APN干預可恢復PCOS大鼠動情周期、降低PCOS大鼠體質量

CON組大鼠保持規律的動情周期。與CON組相比，PCOS 組大鼠動情周期紊亂，PCOS+APN 組、PCOS+APN+GW組和PCOS+APN+VEH組的動情周期逐漸恢復正常（圖1A）。5組大鼠體質量均有增加。與CON組比較，PCOS組大鼠的體質量增加顯著（Ρ＜0.01）；而PCOS+APN組和PCOS+APN+VEH組的體質量均較PCOS組顯著下降（Ρ＜0.01）；與PCOS+APN+GW組比較，PCOS+APN組和PCOS+APN+VEH組的體質量也均下降（Ρ＜0.01，圖1B）。

圖1 APN干預對PCOS大鼠動情周期及平均體質量的影響Fig.1 Effects of APN administration on vaginal cytology and body weight of PCOS rats.A:Estrous cycles of the rats in the 5 groups. B: Average body weight of the rats after modeling and treatments (n=10).**P＜0.01.P: Proestrus;E: Estrus;M:Metestrus;D:Ditestrus.

2.2 APN干預對PCOS大鼠生化指標的影響

圖2 APN對各組大鼠血清激素濃度、血糖和血脂的影響Fig.2 Effects of APN on sex hormone levels and blood glucose and lipid levels of PCOS rats.A-C:Serum levels of sex hormones including testosterone(T),estrogen(E)and progestational hormone(P)(n=10).D:Blood insulin levels(n=10).E:Blood glucose(GLU)levels.F-I:Serum levels of blood lipids including total triglyceride(TG),total cholesterol(TC),high-density lipoprotein(HDL)and low-density lipoprotein(LDL)(n=10).(*P＜0.05,***P＜0.001).

2.3 APN干預可降低PCOS大鼠卵巢指數、改善卵泡發育

大鼠卵巢肉眼觀察可見，PCOS組大鼠卵巢表面蒼白，體積較CON組稍大，表面可見多個囊性透亮卵泡（圖3A）；PCOS+APN組卵巢較PCOS組體積稍小。與CON組相比，PCOS組的卵巢指數顯著升高（Ρ＜0.05）；PCOS+APN組與PCOS+APN+GW的卵巢指數均低于PCOS組（Ρ＜0.05）；PCOS+APN組與PCOS+APN+GW比較，卵巢指數差異無統計學意義（Ρ＞0.05，圖3B）。HE染色可見，與CON組比較，PCOS組大鼠卵巢內可見較多的囊性擴張卵泡，顆粒細胞數量減少、層數變少，結構較紊亂，黃體少見（圖3C）。PCOS+APN 組、PCOS+APN+GW組和PCOS+APN+VEH組大鼠卵巢多囊情況較PCOS組均有所改善。

圖3 APN對PCOS大鼠卵巢指數及形態學的影響Fig.3 Effects of APN on ovarian index and ovarian morphology.A:Appearance of the ovaries in the 5 groups.B:Effects of APN treatment on ovary index of PCOS rats(n=10).C:HE staining of the ovaries in each group(Original magnification,10×4).* and ↑indicates the cystic follicles.CL indicates the corpus luteum.*P＜0.05,**P＜0.01.

2.4 APN干預后PCOS大鼠子宮指數升高、子宮內膜增厚

與CON組相比，PCOS組的子宮細長，子宮指數顯著降低（Ρ＜0.05）；PCOS+APN組與PCOS+APN+GW的子宮指數均較PCOS 組升高，子宮變粗（Ρ＜0.05）；PCOS+APN組與PCOS+APN+GW相比，子宮指數無顯著性差異（Ρ＞0.05）。HE染色可見，PCOS組大鼠的子宮內膜上皮相對于其他各組增厚，其他各組間則無明顯差異（圖4）。

圖4 APN對PCOS大鼠子宮指數及形態學的影響Fig.4 Effects of APN on uterine index and uterine morphology.A:Appearance of the uterus in the 5 groups.B:Effects of APN treatment on uterine index of PCOS rats(n=10).C:HE staining of the uterus in each group.*P＜0.05,**P＜0.01.

2.5 PPARα和HOXA10在大鼠子宮內膜的定位及表達情況

PCOS組大鼠的子宮內膜組織中，與CON組相比，PPARα和HOXA10的表達顯著減少，與PCOS+APN組相比，PPARα和HOXA10的表達顯著增多。PPARα和HOXA10主要表達在子宮內膜上皮細胞和子宮腺細胞胞漿中，呈棕褐色，血管內皮及固有層中也有陽性細胞，呈棕黃色。而在PCOS+APN+GW 組中，PPARα和HOXA10 的表達較PCOS+APN 組與PCOS+APN+VEH組相比均顯著減少，顏色變淺（圖5）。

圖5 免疫組織化學檢測各組大鼠子宮內膜組織PPARα和HOXA10的表達Fig.5 Expression of PPARα and HOXA10 in the endometrial tissue of rats in each group detected by immunohistochemical staining(×400).

Western blot檢測處于同一動情周期時期的各組大鼠子宮內膜中PPARα和HOXA10蛋白的表達水平，結果顯示，變化趨勢與免疫組化結果一致（圖6）。與CON比較，PCOS組大鼠子宮內膜PPARα和HOXA10表達顯著降低（Ρ＜0.001）；與PCOS組比較，PCOS+APN組大鼠子宮內膜中PPARα和HOXA10表達顯著上調（Ρ＜0.01）；與PCOS+APN組比較，PCOS+APN+GW組大鼠子宮內膜中PPARα和HOXA10表達顯著降低（Ρ＜0.05），PCOS+APN+VEH組大鼠子宮內膜中PARα和HOXA10表達無統計學差異；與PCOS+APN+GW組較，PCOS+APN+VEH 組大鼠子宮內膜中PPARα和HOXA10表達顯著上調（Ρ＜0.05）。

圖6 各組大鼠子宮內膜組織中PPARα、HOXA10蛋白表達Fig.6 PPARα and HOXA10 protein expression in the endometrial tissue of the rats in each group detected by Western blotting.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.6 APN對大鼠子宮內膜的胞飲突發育情況的影響

CON組大鼠子宮內膜有完全發育胞飲突形成，而PCOS 大鼠子宮內膜胞飲突發育較CON 組欠佳。PCOS+APN組大鼠子宮內膜胞飲突的發育較PCOS組良好，PCOS+APN+GW組大鼠子宮內膜胞飲突的發育較PCOS+APN組欠佳，而PCOS+APN+VEH組大鼠子宮內膜胞飲突發育較PCOS+APN+GW組良好（圖7）。

圖7 APN各組大鼠子宮內膜胞飲突發育的影響Fig.7 Effects of APN on the development of endometrial pinopodes (PP) in each group.Red arrows indicate the pinopodes.

2.7 APN對大鼠妊娠的影響

各組大鼠均有妊娠（圖8A），與PCOS組大鼠妊娠率（33%）相比，其余各組大鼠妊娠率（100%）一致。與CON組比較，PCOS組大鼠胚胎數量顯著減少；APN干預后大鼠胚胎數量明細增多；而加入PPARα特異性抑制劑干預后（PCOS+APN+GW組），大鼠胚胎數量顯著減少，且胚胎發育遲緩（圖8C、D）。

圖8 APN對各組大鼠妊娠的影響Fig.8 Effects of APN on pregnancy of the rats in each group.A: Statistics of pregnancy rate in each group.B:Pregnant uterine specimens of the rats in each group.C:Statistics of the number of embryos.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

3 討論

PCOS是最常見的全身性生殖內分泌疾病之一，由于影響因素的多樣性和癥狀的異質性［19］，給女性健康和生活帶來多方面的影響。育齡期PCOS患者最嚴重的生殖障礙表現為不孕和流產風險增加［20,21］。其原因除與卵泡發育及排卵障礙、卵子發育潛能受損有關外，子宮內膜容受性差也是一個主要原因。已有研究報道，高雄激素血癥和胰島素抵抗是PCOS的核心病因和臨床癥狀，可干擾卵泡的生長發育和卵母細胞的產生，從而影響妊娠［21,22］；但對有關PCOS患者因子宮內膜容受性下降而引起不孕的機制關注較少。本研究采用來曲唑成功復制PCOS大鼠模型，旨在探討PCOS大鼠子宮內膜容受性的變化及對妊娠的影響。

評價子宮內膜容受性的指標主要有子宮內膜的厚度、血流灌注水平、子宮內胞飲突發育情況和分子生物學等［4,6,23,24］。研究報道HOXA10的表達水平和胞飲突的發育情況會隨著人的月經周期或嚙齒類動物的動情周期變化而變化，在人子宮內膜的分泌中晚期HOXA10表達水平顯著升高，隨之胞飲突發育9［25,26］。本研究發現PCOS 大鼠子宮內膜組織中PPARα及HOXA10的蛋白表達水平較對照組下調；子宮內膜胞飲突的發育較對照組欠佳，提示PCOS大鼠子宮內膜容受性下降。在用APN干預后，PCOS大鼠動情周期得到恢復、體重下降、卵巢多囊樣改變得到改善、卵巢指數下降、子宮指數增加、血清激素與脂質代謝紊亂得到部分恢復等，這些結果與文獻報道一致［13,27］。在APN干預后，PCOS大鼠子宮內膜中PPARα、HOXA10表達上調，胞飲突發育良好，提示APN 可改善子宮內膜的容受性。但同時加入PPARα特異性抑制劑GW6471 后（PCOS+APN+GW組），APN的這些作用被抑制，子宮內膜PAPRα、HOXA10 表達水平下降、胞飲突發育欠佳，與PCOS組相似。以上研究結果提示APN可能是通過PPARα提高HOXA10在PCOS大鼠子宮內膜的表達，進而改善子宮內膜容受性。

在本研究中，PCOS大鼠有典型的高雄激素血癥，且子宮內膜容受性下降，提示高雄激素血癥和子宮內膜容受性之間有潛在聯系。這與PCOS 患者子宮內膜HOXA10 的表達與睪酮（T）呈負相關［28］結果一致。PCOS患者子宮內膜容受性受損發生機制復雜。研究報道PCOS患者子宮內膜容受性受損、妊娠率降低與胰島素抵抗相關［12,21］；也有報道認為PCOS患者子宮內膜也受到炎癥微環境的影響［19］，促炎因子可以通過促進絲氨酸殘基來干擾胰島素信號通路，導致PCOS患者子宮內膜容受性受損［21］。研究報道，肌醇和二甲雙胍（胰島素增敏劑）均可通過AMPK信號通路增加子宮內膜GLUT4水平，提高患者生育能力［29］。最近研究發現，在子宮內膜中APN可通過激活APN受體來發揮對AMPK信號通路的作用，從而改善PCOS病人的內質網活性，發揮能量代謝作用，增加胰島素敏感性［11,13,30］。APN 或許還能通過改善PCOS 大鼠子宮內膜能量代謝來提高子宮內膜容受性，這還有待后續的進一步研究。

該研究首先應用來曲唑誘導PCOS大鼠模型，隨后用APN和PPARα特異性抑制劑GW6471干預PCOS大鼠。結果發現APN 干預后，PCOS 大鼠子宮內膜中PPARα、HOXA10表達上調，胞飲突發育良好；但同時加入GW6471后（PCOS+APN+GW組），APN的這些作用被抑制，子宮內膜組織中PAPRα、HOXA10表達水平下降、胞飲突發育欠佳，而陽性對照組（PCOS+APN+VEH組）各指標不受影響。以上研究結果提示APN可能是通過PPARα提高HOXA10在PCOS大鼠子宮內膜的表達，進而改善子宮內膜容受性。隨后對各組大鼠的生育能力的評估結果也進一步提示APN可以通過PPARα/HOXA10通路改善PCOS大鼠子宮內膜容受性，提高生育能力。但APN通過PPARα增強下游HOXA10啟動子作用的具體機制還有待進一步研究。研究結果提示APN或PPARα有望成為未來改善PCOS病人妊娠結局的治療靶點，為臨床PCOS治療提供理論依據。