PCID2在胃癌組織中高表達并通過調控細胞周期進程和增殖影響患者預后

張 諾，張 震，張雨路，宋 雪，張小鳳，李 靜，左蘆根，3，胡建國

蚌埠醫科大學第一附屬醫院1檢驗科，2胃腸外科，3炎癥相關性疾病基礎與轉化研究安徽省重點實驗室，4中心實驗室，安徽 蚌埠 233000；5蚌埠醫科大學臨床醫學院，安徽 蚌埠233000

胃癌（GC）是消化系統最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率分別居全球第5位和第4位，造成了嚴重的社會危害［1,2］。當前，若單純依靠手術、放化療等常規治療手段，對于患者術后5年生存率的改善效果欠佳［3-5］。癌細胞增殖等生物學行為是導致腫瘤惡性進展的重要因素，深入這一領域的研究有望為胃癌的靶向治療及預后評估提供重要參考［6-9］。PCI結構域2（PCID2）作為三素修復核酸外切酶2（TREX-2）mRNA復合物的組分之一，在核質運輸中扮演重要角色，同時還是細胞周期調節因子［10,11］。新近的研究表明，PCID2在結腸癌中的表達異常升高，并通過促進腫瘤細胞增殖和周期進程影響患者預后［12］。然而，PCID2在胃癌中的作用和機制尚未見報道。本研究嘗試通過分析本機構納入胃癌患者的臨床數據和開展體內外實驗，旨在探究PCID2在胃癌組織中的表達水平及其對胃癌患者遠期預后的評估價值，并探討其對胃癌細胞增殖和周期的影響及可能機制，以期為胃癌臨床診療水平提升提供新的參考。

1 材料和方法

1.1 資料采集

收集2012 年1 月～2016 年12 月接受胃癌根治術（醫療機構：蚌埠醫科大學第一附屬醫院）的患者資料。納入標準：經臨床和病理組織學檢測確診為原發性胃癌；具有完整的病歷資料。排除標準：合并其他組織起源的惡性腫瘤；患有嚴重的心血管、肝或腎疾??；術前接受過放療或化療。按照以上標準，本研究共納入100例胃癌患者，并獲取以下信息：（1）基本資料：性別、年齡、術前糖類抗原19-9（Carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）、術前癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen，CEA）、腫瘤直徑、腫瘤組織類型、病理分級、T分期、N分期等資料于本院病例系統獲??；（2）生存資料：通過多種渠道獲取胃癌患者術后生存情況，包括電話隨訪、門診復查等方式，明確術后5年是否發生腫瘤相關性死亡及時間；（3）組織蠟塊：于本院病理科收集所納入患者胃癌組織和癌旁組織蠟塊，以用于后續的免疫組織化學染色實驗；（4）冰凍標本：于本院《消化系統腫瘤生物標本庫系統》中調取30例胃癌患者（屬于上述已納入研究的100例患者）癌組織和癌旁組織冰凍標本（液氮保存），以用于后續的RT-qPCR實驗和Western blot實驗（隨機調取其中3例胃癌患者的癌組織和癌旁組織冰凍標本）。本研究已通過蚌埠醫學院倫理委員會批準（批準號：倫科批字[2023]第396號）。

1.2 實驗動物

選擇BALB/c-Nude裸鼠9只（雄性，6周齡，體質量20±2 g），在無特定病原體（SPF）環境下飼養，購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。本研究已通過蚌埠醫學院動物研究倫理委員會批準（批準號：倫動科批字[2023]第430號）。

1.3 主要試劑

人胃癌細胞系（MGC-803）購自國家生物醫學實驗細胞資源庫，兔抗PCID2多克隆抗體、兔抗p27多克隆抗體、兔抗p16多克隆抗體（武漢三鷹生物技術有限公司），HRP標記抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司），逆轉錄及RT-qPCR兩步法試劑盒（Takara），胎牛血清、RPMI 1640培養基、胰酶、PBS緩沖液均（Gibco），兔抗β-actin單克隆抗體（Abcam），CCK-8實驗試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），RIPA裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、ECL化學發光檢測試劑盒及細胞周期檢測試劑盒均（上海碧云天生物技術有限公司），小鼠單克隆抗p27抗體及抗p16抗體均（Santa-cruz）。

1.4 方法

1.4.1 免疫組織化學法檢測PCID2、p27及p16在胃癌和癌旁組織中的表達情況 將胃癌患者手術標本蠟塊制成5 μm厚度的切片，經脫蠟水化、抗原修復后除去內源性過氧化物酶，再經封閉、孵育一抗：PCID2（1∶100）；p27（1∶400）；p16（1∶2000）和二抗、DAB顯色、復染細胞核及脫水透明后進行封片掃描。相對積分光密度（IOD）值采用Image-J軟件計算。以胃癌組織中PCID2相對表達量（IOD值）的中位數為界，將患者分為PCID2低表達組（n=50）和PCID2高表達組（n=50）。

1.4.2 RT-qPCR 檢測PCID2 在胃癌和癌旁組織中mRNA 表達水平 首先使用Trizol 試劑提取組織總RNA，然后進行反轉錄，最后于RT-qPCR儀上進行擴增。擴增程序為：95 ℃變性30 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸20 s，重復40個循環。本實驗以GAPDH為內參基因，并通過計算2-ΔΔCT值評估PCID2 mRNA 的表達水平。實驗所用引物為上海生工公司合成，序列如下：PCID2：上游5'-CTCCAGAGGAGAAGTGTCAACA-3'，下游5'-GCTCGCAAGAATGATTGGACT-3'；GAPDH：上游5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。

1.4.3 GO功能富集分析預測PCID2可能的生物學功能通過cBioPortal 數據庫（https://www.cbioportal.org）獲取PCID2在胃癌中的共表達基因（Ρ＜0.01），進而通過DAVID 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）進行基因本體注釋（Gene Ontology，GO）富集分析（Ρ＜0.05），以預測PCID2可能參與的生物學功能。

1.4.4 細胞轉染及分組 將MGC-803培養于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中（37 ℃、5%CO2條件下）。待細胞密度達70%～80%時，分別用對照空載體、特異性敲低和過表達PCID2 慢病毒載體轉染MGC-803，并篩選穩定表達的細胞株用于后續實驗檢測。細胞實驗分組依次為對照組（NC組）、PCID2敲低組（Si-PCID2組）及PCID2過表達組（LV-PCID2組）。

1.4.5 CCK-8 法檢測PCID2 對胃癌細胞增殖的影響以2×103/孔的密度將轉染成功的MGC-803細胞接種到96孔板內，分別于培養24、48、72、96 h時，以10 μL/孔的體積添加CCK-8試劑。孵育4 h后，檢測450 nm處吸光度值（A450nm）。

1.4.6 流式細胞術檢測PCID2對胃癌細胞周期的影響收集轉染成功MGC-803 細胞，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗后，于4 ℃的70%冰乙醇中固定1 h。PBS洗滌并離心2次，然后將細胞重懸于含225 μL 碘化丙啶和90 μL 核糖核酸酶A（Ribonuclease A，RNase A）的PBS溶液中，混勻后于室溫下孵育30 min。最后采用流式細胞儀檢測并計算細胞周期分布情況。

1.4.7 Western blot檢測PCID2對細胞周期相關蛋白及p27和p16蛋白表達的影響 收集轉染成功MGC-803細胞、裸鼠移植瘤、胃癌組織及癌旁組織，并利用蛋白裂解液提取總蛋白。在測定蛋白濃度后，加入上樣緩沖液，并對蛋白進行變性處理。然后經SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白，再依次進行轉膜、封閉、孵育一抗及二抗，最后利用凝膠成像系統采集圖片。以β-actin為內參，利用Image-J軟件對目的蛋白進行定量分析。

1.4.8 裸鼠移植瘤實驗 轉染成功的MGC-803細胞經胰蛋白酶消化、離心后重懸成單細胞懸液（1×108個/mL），并以100 μL/只鼠的劑量接種于裸鼠背部皮下（NC組、Si-PCID2組及LV-PCID2組，3只/組）。14 d后，處死裸鼠，取出移植瘤，拍照并測量移植瘤體積和重量（腫瘤體積=1/2×長×寬2）［13］。

1.5 統計學分析

采用SPSS 26.0軟件和GraphPad prism 9.0軟件進行統計學分析和制圖。計量資料表示為均數±標準差，每項實驗均獨立重復不少于3次。通過χ2檢驗進行率的比較；兩組間均數比較采用t檢驗；3組間均數比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。通過Spearman進行相關性分析；通過Kaplan-Meier（K-M）曲線進行生存分析；分析影響胃癌患者術后5年生存率的獨立危險因素采用Cox比例風險回歸模型；分析PCID2預測胃癌患者術后5年生存率的評估價值采用受試者工作曲線（ROC）。以Ρ＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 PCID2在胃癌組織中呈現高表達

免疫組織化學和RT-qPCR檢測結果表明，PCID2在胃癌組織中的蛋白和mRNA表達水平較癌旁組織均明顯增加，且主要表達于癌細胞胞質（Ρ＜0.01，圖1A～C）。

2.2 胃癌組織中PCID2表達水平與腫瘤惡性進展相關

以PCID2相對表達水平的中位數（3.085）為界，將納入研究的100例患者分為PCID2低表達組（n=50）和PCID2高表達組（n=50）。通過對納入患者的臨床資料進行分析發現，PCID2高表達組患者CA19-9≥37 kU/L、CEA≥5 μg/L、T分期（T3～T4）及N分期（N2～N3）的比例顯著高于PCID2低表達組（Ρ＜0.01，表1）。進一步相關性分析結果顯示，PCID2在胃癌組織中的表達水平與患者外周血中CA19-9（r=0.504，Ρ＜0.001）及CEA（r=0.535，Ρ＜0.001）水平呈正相關（圖2A、B）。

表1 胃癌組織中PCID2表達水平與胃癌患者臨床病理參數間的關系Tab.3 Relationship between the expression level of PCID2 in GC tissues and clinicopathological parameters of the patients

圖2 胃癌組織中PCID2表達水平與CA19-9及CEA水平的相關性分析Fig.2 Correlation analysis between the expression level of PCID2 in GC and the levels of CA19-9 and CEA in peripheral blood.A:Correlation analysis between PCID2 and CA19-9.B:Correlation analysis between PCID2 and CEA.

2.3 PCID2高表達提示胃癌患者術后預后不良

采用K-M生存曲線比較PCID2高表達與低表達對胃癌患者術后5年生存率的影響，結果顯示PCID2高表達組患者術后5年生存率顯著低于PCID2低表達組患者（Log-rank χ2=38.248，Ρ＜0.001，圖3）。

圖3 PCID2 表達水平與患者胃癌根治術后5 年生存率的關系Fig.3 Relationship between PCID2 expression level and 5-year survival rate of GC patients after radical operation.

2.4 PCID2高表達是影響患者胃癌根治術后5年生存率的獨立危險因素

單因素結合Cox 多因素分析表明，胃癌組織中PCID2高表達、外周血CA19-9≥37 kU/L和CEA≥5μg/L、臨床T分期（T3～T4）及N分期（N2～N3）是影響胃癌患者術后5年生存率的獨立危險因素（Ρ＜0.05，表2）。

表2 影響胃癌根治術后5年生存率的單因素結合Cox多因素分析Tab.3 Univariate and Cox multivariate analyses of the factors affecting the 5-year survival rate of GC patients after radical gastrectomy

2.5 PCID2表達水平對胃癌患者根治術后5年生存率具有一定評估價值

ROC 曲線分析顯示：以PCID2 相對表達水平（3.035）為截點值，預測胃癌患者術后5年生存率的敏感性、特異性、曲線下面積分別為76.74%、75.44%、0.755（Ρ＜0.001，圖4）。

圖4 PCID2表達水平對胃癌患者根治術后5年生存率的評估價值Fig.4 Evaluation of the predictive value of PCID2 expression level for 5-year survival rate of GC patients after radical operation.

2.6 PCID2促進胃癌細胞周期進程及增殖

GO功能富集分析結果顯示PCID2可能參與胃癌細胞細胞周期G1/S期轉變（Ρ＜0.01，圖5A）。采用慢病毒轉染方式分別構建敲低與過表達PCID2基因的胃癌細胞系，并通過Western blot驗證轉染效率（Ρ＜0.05，圖5B、C）。CCK-8實驗證明：PCID2過表達促進胃癌細胞增殖，敲低則反之（Ρ＜0.01，圖5D）。流式細胞術分析表明：PCID2過表達促進胃癌細胞G1/S期轉變，敲低則抑制（Ρ＜0.05，圖5E、F）。Western blot實驗證實：PCID2過表達顯著促進CyclinD1和CDK6的表達，敲低則反之（Ρ＜0.05，圖5G、H）。

圖5 PCID2對胃癌細胞周期進程及增殖的影響Fig.5 Effect of PCID2 expression level on cell cycle progression and proliferation of GC cells.A:GO function enrichment analysis of PCID2 in GC. B,C:Western blotting for verifying efficiency of PCID2 knock-down and overexpression. D:CCK-8 assay for assessing the proliferation of GC cells. E,F:Flow cytometry for analyzing cell cycle distribution of GC cells. G,H:Western blotting for detecting expressions of cell cycle-related proteins in GC cells.NC: Normal control.Si:SiRNA.LV:Overexpression.*P＜0.05 vs NC,**P＜0.01 vs NC.

2.7 PCID2在體促進裸鼠成瘤

使用慢病毒轉染成功后的胃癌細胞建立裸鼠皮下成瘤模型，通過對裸鼠移植瘤體積和重量進行組間比較發現：PCID2過表達可明顯增加腫瘤的體積和質量，敲低則相反（Ρ＜0.05，圖6A～C）。Western blot檢測表明：PCID2過表達促進裸鼠移植瘤中CyclinD1和CDK6的表達，敲低則反之（Ρ＜0.05，圖6D、E）。

圖6 PCID2對裸鼠皮下成瘤能力的影響Fig.6 Effect of PCID2 expression level on subcutaneous tumor growth in nude mice.A:Representative pictures of the tumors from the nude mice in each group. B:Comparison of tumor volume in each group.C:Comparison of tumor weight in each group.D,E:Western blotting for detecting expressions of cell cycle-related proteins in tumors of the nude mice.*P＜0.05 vs NC,**P＜0.01 vs NC.

2.8 p27蛋白、p16蛋白在胃癌組織中低表達且受PCID2調控

免疫組織化學染色和Western blot分析顯示：胃癌組織中的p27蛋白和p16蛋白表達水平較癌旁組織均明顯降低（Ρ＜0.05，圖7A～F）。此外，在胃癌細胞（圖7G、H）和裸鼠移植瘤（圖7I、J）中，PCID2過表達可抑制p27蛋白和p16蛋白表達，敲低則促進二者表達（Ρ＜0.05）。

圖7 p27蛋白、p16蛋白在胃癌組織和癌旁組織中的表達情況及PCID2對其表達的影響Fig.7 Expressions of p27 and p16 proteins in GC and adjacent tissues and the influence of PCID2 on their expression.A,B:Immunohistochemical staining for detecting expression levels of p27 protein in GC tissues and adjacent tissues. C,D:Immunohistochemical staining for detecting expression levels of p16 protein in GC tissues and adjacent tissues.E,F:Western blotting for detecting expression levels of p27 and p16 protein in GC tissues and adjacent tissues. G,H:Western blotting for detecting expression levels of p27 and p16 proteins in GC cells with PCID2 overexpression and knockdown. I,J:Western blotting for detecting expression levels of p27 and p16 proteins in tumors of the nude mice.#P＜0.05 vs GC,##P＜0.01 vs GC;*P＜0.05 vs NC,**P＜0.01 vs NC.

3 討論

癌細胞通過異常增殖等生物學行為參與腫瘤的惡性進展，而這一過程受多種蛋白分子的調控［14-16］，深入這一領域的探索對胃癌進展機制的揭示、臨床診療水平的提高及患者預后評估具有重要的臨床意義［17-19］。本研究通過分析胃癌患者臨床數據，證實PCID2在胃癌組織中高表達且影響患者術后5年生存率。并且通過組織樣本分析結合體內外實驗，發現p27蛋白、p16蛋白在胃癌組織中低表達并可能通過PCID2調控進而促進胃癌細胞增殖和細胞周期進程。

我們首先對胃癌患者組織標本進行實驗分析，發現PCID2在胃癌組織中顯著高表達。T分期與N分期可反映腫瘤的浸潤程度以及淋巴結受累情況，其分期越高代表腫瘤惡性程度越高，而CA19-9和CEA是臨床上篩查胃腸道腫瘤常用的血清學標志物［20,21］。通過進一步分析PCID2表達水平與胃癌患者臨床病理參數之間的關系，發現PCID2 高表達組患者CA19-9≥37 kU/L、CEA≥5 μg/L、T分期（T3～T4）及N分期（N2～N3）的比例顯著高于PCID2低表達組患者，且胃癌組織中PCID2水平與外周血CA19-9、CEA濃度呈正相關。以上結果提示，PCID2可能在胃癌的發生發展中扮演重要角色［7,22］。接下來，我們嘗試分析PCID2表達對胃癌患者預后的影響，結果證實PCID2高表達是胃癌患者預后不良的獨立危險因素，提示PCID2與胃癌患者預后密切相關。另外，本研究通過ROC曲線分析表明PCID2對評估胃癌患者術后5年內是否死亡具有較高的預測價值，提示PCID2有望成為評估胃癌患者預后的良好指標。以上研究結果表明PCID2在胃癌組織中高表達并影響患者預后。

基于以上發現，我們嘗試進一步探究PCID2影響患者預后的可能途徑。首先通過GO功能富集分析發現，PCID2的生物學功能可能與細胞周期G1/S期轉變有關。為進一步探究PCID2對胃癌細胞周期的調控作用，我們采用慢病毒轉染的方式分別構建敲低和過表達PCID2的胃癌細胞系。CCK-8實驗顯示PCID2過表達能夠促進胃癌細胞增殖。同時，流式細胞術分析發現PCID2過表達能夠促進胃癌細胞G1/S期轉變，并可促進細胞周期關鍵蛋白CyclinD1和CDK6表達，而敲低PCID2則會產生相反的效果。最后，PCID2對胃癌細胞增殖及周期進程的調控作用也進一步在裸鼠成瘤實驗中得到驗證，但具體的分子機制仍有待進一步探究。

已有研究表明，細胞周期紊亂引起的腫瘤增殖失控是導致癌變的重要原因，其中G1/S期的轉變是調控細胞周期的關鍵因素［23-25］。既往報道顯示，p27和p16屬于細胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白（CDKIs）家族［26］。其中，p27基因主要負向調節Cyclin E和CDK2的活性，抑制G1期細胞進入S期，進而阻礙細胞的增殖和分裂［27-29］；而p16基因可直接與Cyclin D競爭性結合CDK4，降低Cyclin D/CDK4復合物活性，抑制G1/S期的轉變，影響細胞周期的進展［30,31］。既往研究發現，p27和p16曾作為抑癌基因，通過調節癌細胞生長周期參與多種惡性腫瘤的發生發展［32-34］?；诖?，我們檢測了胃癌組織及癌旁組織中p27和p16蛋白的表達情況，發現它們在胃癌組織中低表達。此外，進一步利用體內外實驗發現，過表達PCID2可抑制p27和p16蛋白表達，敲低則促進p27和p16蛋白表達。以上實驗結果提示，PCID2促進胃癌細胞增殖和周期進程可能與抑制p27和p16表達有關。

本研究同時也存在以下不足：我們的研究對象數量有限，仍需進一步擴大樣本量來證明現有結論；此外，雖然本研究證實了PCID2可能通過抑制p27、p16表達促進胃癌細胞增殖及周期進程，但不能排除PCID2通過其他機制影響胃癌惡性進程的可能。

綜上所述，本研究證實PCID2在胃癌組織中高表達，并可能通過抑制p27和p16表達促進胃癌細胞增殖和周期進程，進而影響患者預后。本研究不僅拓展了對PCID2生物學功能的認識，還有望為胃癌靶向治療及患者預后評估提供新的分子參考。