聚乳酸/羥基磷灰石/磷鈣鋅石復合支架促進大鼠骨質疏松性骨缺損愈合

羅彩珠，陳金香，張 群，于學釗，張書勤

南方醫科大學1第三附屬醫院//廣東省骨與關節退行性疾病重點實驗室，廣東 廣州 510630；2藥學院//國家藥監局藥物代謝研究與評價重點實驗室，廣東 廣州510515

隨著我國人口老齡化，骨質疏松問題日益突顯，逐漸成為公共衛生挑戰［1］。骨質疏松的特點是骨量減少和骨微結構破壞，增加骨折風險同時伴隨嚴重并發癥，給患者和社會帶來了嚴重的負擔［2］。骨質疏松患者的骨再生細胞缺陷，包括數量減少和功能降低，導致骨組織的再生過程受限；此外，骨質疏松患者體內骨髓間充質干細胞向脂肪細胞方向分化增多，而向成骨細胞方向分化減弱，使得骨組織的修復受到影響［3,4］。因此針對骨質疏松性骨缺損骨骼微環境開發更適合的骨移植物很有必要。

Zn2+與人體骨骼密切相關，Zn2+能夠有效地刺激人類骨骼形成［5］，在健康成年人中，循環中的Zn2+濃度與骨鈣素呈正相關，與骨再吸收標志物呈負相關［6］；同時研究表明，Zn2+在骨質疏松性骨折的發生發展中也起著重要作用，并且隨著衰老和骨骼流失，絕經后女性骨骼中的Zn2+含量下降［7］。因此，在OP患者在骨缺損后，如果能實現Zn2+在損傷部位的持續釋放，可能會更好地治療骨質疏松性骨缺損。

將具有生物可降解性質、良好機械強度的聚合物與生物活性陶瓷混合，制備出與天然細胞外基質相同的生物復合材料。本文選取聚乳酸（PLA）和羥基磷灰石（Ca5(PO4)3OH），HA作為生物復合材料，已有研究證實通過靜電紡絲［8］、冷凍干燥［9］和溶劑澆鑄法［10］制備的多孔PLA/HA復合材料具有優秀的力學性能和更高的促細胞增殖性能。迄今為止，研究人員通過3D打印制備了各種多孔PLA/HA支架，在提高力學性能的同時，實現了精確復雜的骨結構［11］，具有很大的應用前景。在PLA/HA復合材料中載入Zn多將Zn2+摻入到HA中制備Zn-HA中，再與PLA復合，但已有研究表明，Zn2+的摻入降低了HA的溶解度和機械強度［12］。對Zn-HA已進行了大量的體外和體內研究，但Zn取代對HA骨傳導特性的作用仍存在爭議［13］。納米磷鈣鋅石（nano size-scholzite CaZn2（PO4）2·2H2O,nZCP）可將Zn2+持續釋放到骨微環境中，其在細胞水平的促成骨作用已被證實［14,15］，但其在體內的活性尚未得到驗證。通過濕化學方法可以很容易地獲得nZCP，其還可以作為形成骨無機質主要成分HA的成核材料［14］。

本研究為了不影響HA的骨傳導特性，利用所合成的粒徑為10 nm的nZCP替代Zn-HA作為Zn2+的緩釋平臺，并將其與多孔PLA/HA支架進行復合。將不同劑量的nZCP 分別加入到PLA/HA 中，形成一組PLA/HA/nZCP（PHZ）復合支架。不受控制的Zn2+快速釋放會破壞體內的Zn穩態，導致其他微量金屬離子如Ca2+、Fe2+和Cu2+的缺乏，并與親和位點結合導致蛋白質功能障礙［12］。因此，控制其在安全的范圍內持續釋放至關重要，為此探究了Zn2+的釋放行為，設立含量梯度，找到PLA/HA具有較好成骨活性的nZCP含量。數據表明不同Zn含量的PHZ（分別為PHZ-1、PHZ-2、PHZ-3）支架具有連通的孔結構，粒徑20～40 μm，具有良好的Zn2+緩釋性能。PHZ-2、PHZ-3 兩組即nZCP 質量百分比為4.5%～7.5%的PHZ支架在體外和體內表現出更佳的成骨活性。

1 材料和方法

1.1 藥品及試劑

聚乙烯吡咯烷酮（相對分子質量40 000，Aladdin），Ca（OH）2、十二烷基硫酸鈉、ZnO、H3PO4、1,4-二氧六環、二氯甲烷、PLA（相對分子質量80 000）、HA（Mcklin China），胎牛血清（Gibco），青霉素/鏈霉素（Procell），α-基礎培養基、胰蛋白酶（Gibco），鈣黃綠素/碘化丙啶細胞活力測定試劑盒（Beyotime），抗壞血酸、β-甘油磷酸（Mcklin），地塞米松（Pythonbio），4%多聚甲醛（Biosharp），PBS（Procell），ALP染色試劑盒（Beyotime），RIPA緩沖液（Aladdin），蛋白酶抑制劑（Solarbio），ALP檢測試劑盒（NJJCBIO），0.2%茜素紅（Solarbio），BCA蛋白測定試劑盒（Beyotime），抗RUNX2、抗ALP、抗-βactin等一抗（Abcam），二抗（Beyotime），蘇木素-伊紅染色試劑盒、亞甲基藍酸性品紅染色試劑盒（Solarbio）。

1.2 nZCP的制備

在聚乙烯吡咯烷酮（3.0 g）的超純水溶液（100 mL）中依次加入Ca（OH）2（74 mg）、十二烷基硫酸鈉（SDS 1.0 g）、ZnO（162 mg）。30 min內，滴加H3PO4（136 μL，用30 mL超純水稀釋），將混合溶液倒入厚壁試管中，80℃攪拌12 h，離心后，形成的nZCP沉淀物用超純水沖洗3次，烘干備用。

1.3 復合支架的制備

1,4-二氧六環和二氯甲烷混合溶液（5 mL,v/v=85∶15）完全溶解PLA（0.85 g），接著加入HA和3種不同質量的nZCP（表1）。攪拌直到粉末完全在PLA均勻分散。將混合液體倒入模具，冷凍干燥3 d，去除溶劑，產物分別記為PLA/HA、PHZ-1、PHZ-2、PHZ-3。

表1 不同組別中每種組分的含量Tab.3 Content of each component in different scaffolds

1.4 表征

通過Zeta-sizer對nZCP的粒徑大小進行測定。采用D8AA25 X衍射儀、SEM、FTIR光譜儀分別對不同支架和nZCP的粉末X射線衍射（PXRD）圖譜、形貌、FTIR圖譜進行了表征。此外用EDS不同支架進行了元素分析。為了觀察Zn2+和Ca2+元素的釋放，將支架浸泡在磷酸鹽緩沖鹽水（PBS pH=7.4）中，收集上清液，用電感耦合等離子體原子發射光譜法測定Zn2+和Ca2+的濃度。

1.5 復合支架壓縮模量

在進行力學分析之前，將復合支架制備為圓柱體（直徑6 mm，高12 mm）。之后，在萬能力學試驗機上進行壓縮性測試。以1.0 mm/min的橫向頭速度向支架施加軸向壓縮載荷，直到支架破裂。在加載過程中，記錄載荷-位移數據并用于生成曲線，其中破壞載荷定義為抗壓強度。

1.6 體外細胞試驗

1.6.1 分離培養大鼠骨髓間充質干細胞（rBMSCs）采用全骨髓貼壁法從SD大鼠（4周齡）股骨和脛骨分離rBMSCs。分離的rBMSCs在含10%（v/v）胎牛血清和1%（v/v）青霉素/鏈霉素的α-基礎培養基中，濃度為5%CO2，37 ℃培養，2 d后更換培養基。在細胞融合前，用0.25%胰蛋白酶收集細胞，將細胞重懸于新鮮培養基中，1.6.2 復合支架浸提液的制備 支架浸提液按照國際標準化方法（ISO 10993-12）制備［16］。簡單地說，支架（3 cm2/mL）在37℃的成骨誘導培養基中37 ℃浸泡72 h。離心后，用帶有0.22 μm過濾膜的注射器過濾上清液，得到支架浸提液。

1.6.3 復合支架的細胞相容性分析 細胞粘附后，將支架放到細胞板上共培養1、3、5 d，然后加入10 μL的2-（2-氧基-4-硝基苯）-3-（4-硝基苯）-5-（2,4-二硫苯）-2 h-四氮唑單鈉鹽（WST-8），37 ℃孵育30 min。使用酶標儀在570 nm處測定rBMSCs的A值。細胞接種至96孔，在37 ℃和5%CO2培養箱中培養。1、3和5 d后，按照制造商的說明，使用鈣黃綠素/碘化丙啶細胞活力測定試劑盒對細胞進行染色。然后在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察細胞（LSCM,NikonA1,Japan）。

1.6.4 ALP染色試驗 rBMSCs接種于12孔板中，密度為4×105/孔。用不同支架浸提液制備成骨培養基(正常α-MEM培養基、50 μg/mL抗壞血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸、100 nmol/L 地塞米松，分別與細胞作用7 d 和14 d。去除培養基，用4%多聚甲醛固定細胞20 min。PBS洗滌2次后，將ALP染色試劑盒制備的染色液加入每孔，在室溫下黑暗孵育30 min。然后將液體取出，掃描全板，記錄并觀察ALP的表達。

1.6.5 ALP 活性測定 使用一定體積的RIPA 緩沖液和蛋白酶抑制劑。細胞在冰上溶解30 min，然后以15 000 r/min離心5 min，隨后收集上清液。最后，使用ALP檢測試劑盒通過記錄微板檢測器在520 nm處的吸光度值來測定上清液中的酶活性。將酶活性（IU/L）歸一化為總蛋白（mg/dL）。

1.6.6 茜素紅染色（ARS）采用ARS法測定細胞外基質礦化（ECM）。rBMSCs 接種于12 孔板中，密度為4×105/孔。14 d后，加入0.2%茜素紅，室溫孵育1 h。吸去染色液，掃描拍照。

1.6.7 qPCR定量檢測 為了確定骨形成標記物的轉錄水平，用含有支架浸提液的成骨培養基在6孔板中處理rBMSCs 7 d 和14 d。原始細胞密度為1×106/孔。用Trizol 提取總RNA，然后反轉錄成cDNA，然后采用SYBR 法進行定量PCR 檢測，反應過程如下∶95 ℃下30 s，95℃下5 s，60℃下34 s，循環40 次，95℃下15 s，60℃下1 min，95℃下15 s。引物序列見表2。

表2 引物序列表Tab.3 Primer sequences for RT-qPCR

1.6.8 Western blot檢測 培養后第4天和第7天，從6孔板中收集細胞，用RIPA緩沖液裂解。用BCA蛋白測定試劑盒測定總提取蛋白濃度。隨后，使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳從不同樣品中分離出等量的蛋白質，并轉移到聚偏二氟乙烯膜中。將膜與抗RUNX2、抗ALP、抗-β-actin等一抗在4℃孵育過夜，然后在室溫下與二抗孵育1 h。最后，利用增強型化學發光檢測試劑盒，捕獲蛋白條帶。

1.7 體內試驗

1.7.1 動物造模 SD大鼠（雌性，8周齡）購自南方醫科大學動物實驗中心。所有實驗程序均經南方醫科大學動物倫理委員會批準（NO.44002100029647）。采用OVX模型誘導骨質流失（12周，體質量210±10 g）。OVX手術后8周，進行骨缺損手術。術前將體質量350±20 g的SD大鼠隨機分為4組（PLA/HA、PHZ-1、PHZ-2、PHZ-3）。用電鉆在股骨遠端制造一個直徑3.5 mm，深度4 mm的缺損，并在閉合前立即將復合支架放入骨缺損中。植入6周和12周后處死大鼠，取出股骨，用4%多聚甲醛固定，以備后續分析。

1.7.2 μCT成像評價 各組大鼠股骨用4%多聚甲醛固定，置于75%乙醇中待進一步分析。μCT 用于評價其微觀結構和量化骨結構參數。掃描儀的設置電壓為70 kV，電流為110 mA，分辨率為10.8 μm/像素［17］。整個股骨固定在一個長75 mm、直徑20 mm的掃描支架中。X射線設置為55 kVp，145 μA，8 W。因構建的是股骨髁骨缺損模型故將感興趣體積（VOI）定義為股骨遠端股骨髁［18］。隨后通過內置軟件計算VOI的骨結構參數：骨礦物質密度（BMD，mg/cm3）、骨體積分數（BV/TV，%）、骨小梁厚度（Tb.Th，mm），骨小梁分離（Tb.Sp，mm），骨小梁數（Tb.N，1/mm）。股骨遠端三維顯微結構由MIMICS Medical 21.0 重建。

1.7.3 組織學評價 固定后的股骨樣本用濃度從75%增加到100%的乙醇脫水，然后石蠟包埋。組織切片（厚度為4 μm）采用德國Leica 公司SP1600 型鋸切片機制作。隨后，用蘇木素-伊紅染色試劑盒和亞甲基藍酸性品紅染色試劑盒對缺損部分切片進行組織學觀察。

1.8 統計分析

使用GraphPad Prism進行統計分析。數據分析采用Kolmogorov Smirnov方法檢驗正態性，然后進行單向方差分析（ANOVA）和t檢驗。當Ρ＜0.05時認為差異有統計學意義。本研究中所述的所有數據都是基于每個實驗重復3次的結果。

2 結果

2.1 nZCP和PHZ支架的表征

PXRD 譜中的所有峰10.3°、13.0°、19.4°、21.4°、26.1°、28.3°、31.9°、32.2°、34.6°、39.8°、47.6°、50.3°、55.3°均與標準ZCP（JCPDS No.35-0495）一致，證實了高純度nZCP的成功合成（圖1A）。SEM圖像顯示合成的nZCP呈球形，平均尺寸約為10 nm（圖1B），與DLS結果一致（圖1C）。

圖1 nZCP及各組支架的表征Fig.1 Characterization of the synthesized nZCP and scaffolds.A:PXRD patterns of the synthesized nZCP and simulated ZCP.B:SEM of nZCP(scale bar:100 nm).C:Particle size distribution of nZCP.D,E:PXRD patterns and FTIR spectra of different scaffolds and their subcomponents.F,G:Typical stress-strain curves and compressive strength data of PLA/HA and PHZ.H,I:Zn2+and Ca2+release profiles of the scaffolds in PBS(pH=7.4).Data are shown as Mean±SD.**P＜0.005,***P＜0.0005,****P＜0.0001.

在PXRD結果中，PLA/HA、PHZ-1、PHZ-2和PHZ-3的強2θ峰在16.8°和19.2°左右，表明這些支架主要成份是PLA，在10.3°和31.8°的衍射2θ峰分別屬于nZCP和HA。PHZ中的特征峰與單組分相一致（圖1D）。

在PLA 的紅外光譜中，C=O 拉伸振動峰出現在1720 cm-1處，1110～1220 cm-1和1150 cm-1為酯類的C-O拉伸峰，2960 cm-1和2860 cm-1處的能帶是-CH3的C-H不對稱和對稱拉伸，甲基的不對稱和對稱彎曲模式在1490 cm-1到1300 cm-1。HA譜中1160 cm-1～950 cm-1處的峰可視為磷酸鹽γ1 和γ3 兩種振動模式的特征峰，569 cm-1和604 cm-1處的峰可視為磷酸鹽γ4振動模式的特征峰，HA譜中3430 cm-1處的峰屬于羥基的特征峰（圖1E）。

從支架的典型應力-應變曲線可以看出，PHZ-2和PHZ-3 的抗壓強度高于PLA/HA 和PHZ-1（圖1F）。PHZ-2 的抗壓強度（2.63±0.23 MPa）與PHZ-3（2.42±0.16 MPa）相當，但顯著高于PLA/HA（1.47±0.16 MPa，Ρ＜0.0005）和PHZ-1（1.81±0.09 MPa，Ρ＜0.005，圖1G）。用ICP-MS 分析了支架中Ca2+和Zn2+的釋放行為，前10 d兩種離子的釋放速度較快，隨后逐漸減緩，達到穩定釋放（圖2H～I）。

掃描電鏡顯示，所有支架中均存在多孔結構（圖2A、B）。隨著nZCP含量的增加支架內部的粗糙度升高（圖2C、表3）。

表3 通過EDS測定的不同組別原子百分含量Tab.3 Element atomic percentage of different samples determined by EDS(%)

2.2 復合支架作用下rBMSCs細胞增殖及成骨分化

CCK-8結果所示，各組與rBMSCs共培養1、3、5 d后增殖良好。含nZCP的支架A值與PLA/HA的支架A值差異無統計學意義（Ρ＞0.05，圖3A）。細胞死活染色結果，所有rBMSCs均附著在細胞培養板上分布良好，無細胞死亡（視野呈綠色熒光，幾乎沒有紅色熒光，圖3B）。

圖3 支架具有良好的生物相容性，PHZ促進rBMSCsALP活性和胞外基質礦化Fig.3 Evaluation of biocompatibility of the scaffolds in rBMSCs and their effects on ALP activity and extracellular matrix mineralization of the cells.A:Viability of rBMSCs cultured with aqueous extracts of different scaffolds at 1,3,and 5 days.B:Livedead staining of the rBMSCs (green and red colors indicate living and dead cells,respectively;scale bar:250 μm).C,D:ALP staining of rBMSCs at 7 days of incubation with the scaffold extracts.E,F:at 14 days.G:ARS staining of rBMSCs at 14 days of incubation(scale bar:250 μm).Data are shown as Mean±SD.*P＜0.05,**P＜0.005,***P＜0.0005,****P＜0.0001.

ALP染色結果所示，隨著體系中nZCP含量的增加，第7天ALP染色程度加深（圖3C），第7天的ALP活性定量進一步證實了染色結果（圖3D）。PHZ-3組的ALP 活性顯著高于PLA/HA 組（Ρ＜0.0001）、PHZ-1 組（Ρ＜0.0005）、PHZ-2組（Ρ＜0.005）。第14天，趨勢與第7天的結果相同（圖3E、F）。ARS結果顯示，與其他組相比，PHZ-2和PHZ-3的鈣結節數量明顯升高（圖3G）。

PHZ-3培養7 d后RUNX2（Ρ＜0.0005）和OCN（Ρ＜0.005）表達水平明顯高于PLA/HA組，而PHZ-2的ALP表達水平最高（Ρ＜0.0001，圖4A1～A3）。培養14 d后，與PLA/HA 相比，PHZ-2 中OCN（Ρ＜0.0001）和ALP（Ρ＜0.0005）的表達上調最明顯，而RUNX2在PHZ-3中最高（Ρ＜0.05，圖4B1～B3），這與第7天的結果不一致。Western blot結果顯示，與其他各組相比，PHZ-2在第4天（Ρ＜0.05）和第7 天（Ρ＜0.05）RUNX2 蛋白表達量最高，第4天ALP蛋白表達無顯著差異，但第7天PHZ-2（Ρ＜0.05）和PHZ-3（Ρ＜0.05）的ALP蛋白表達略有增加（圖5A～D）。

圖4 PHZ在7 d和14 d促進成骨相關基因RUNX2、ALP、OCN轉錄Fig.4 PHZ promotes transcription of osteogenic genes RUNX2,ALP and OCN in rBMSCs at 7 and 14 days.A:Expression levels of RUNX2 (A1),ALP (A2),and OCN (A3) mRNA in rBMSCs treated with the scaffold extracts for 7 days.B:Expression levels of RUNX2(B1),ALP(B2),and OCN(B3)in rBMSCs treated with the scaffold extracts for 14 days.Data are shown as Mean±SD.*P＜0.05,**P＜0.005,***P＜0.0005,****P＜0.0001.

圖5 PHZ在4 d和7 d促進成骨相關基因RUNX2、ALP表達；OVX術后8周骨質疏松模型成功構建Fig.5 PHZ promotes expressions of RUNX2 and ALP proteins in in rBMSCs and establishment of a osteoporotic rat model 8 weeks after OVX surgery. A: Western blots of RUNX2 and ALP proteins in rBMSCs treated with the scaffold extracts for 4 days. B1, B2:Quantification of RUNX2 and ALP protein at 4 days.C:Western blots of RUNX2 and ALP in rBMSCs incubated with different extracts for 7 days.D1,D2:Quantification of RUNX2 and ALP protein at 7 days.E1,E2:Three-dimensional reconstruction of femoral condyle trabecular bone at 8 weeks after OVX(E1)and sham operation(E2).F:Bone parameters in femoral condyle at 8 weeks after OVX.Data were shown as Mean±SD,*P＜0.05,**P＜0.005,***P＜0.0005.

2.3 PHZ在體內刺激成骨

OVX手術8周后，假手術組與OVX組與的骨參數BV/TV（Ρ＜0.05）、Tb.Th（Ρ＜0.05）、骨形態有顯著差異，說明骨質疏松模型構建成功（圖5E、F）。股骨髁缺損造模6周和12周后采集股骨，μCT圖像顯示缺損部位的冠狀面、矢狀面和水平面上新形成的骨（圖6A～C）。在6周的樣本中，4組材料沒有明顯降解（圖6A～C），但支架周圍有新的骨骼生長。術后12周骨缺損內新骨長入支架的三維重建圖像（圖6D），與PLA/HA和PHZ-1相比，PHZ-2和PHZ-3中發現了更多的新骨。定量分析顯示，PHZ-3組的BMD（Ρ＜0.05）和BV/TV（Ρ＜0.05）參數相較于PLA/HA顯著增加，PHZ-2和PHZ-3組Tb.Sp值低于PLA/HA組（Ρ＜0.05），但4組的Tb.N 和Tb.Th 參數無統計學差異（圖6E）。在手術6周時，在PHZ-3支架內部和表面內均觀察到新形成的組織，而其他組僅在表面出現少量新生組織（圖7A1）。手術12 周時，PHZ-2 和PHZ-3的新生組織多于其余兩組（圖7A2）。亞甲基藍酸性品紅染色時，新成熟骨組織和骨類似物分別被染色為暗紅色和紫灰色（圖7B）。

圖6 PHZ在骨缺損術后6周，12周促進骨整合和骨修復Fig.6 PHZ promote bone graft integration and bone repair at 6 weeks and 12 weeks after scaffold implantation.A-C:MicroCT images of bone defects in the coronal plane(A1-A4),sagittal plane(B1-B4),and horizontal plane(C1-C4)at 6 weeks after implantation(scale bar:5 mm).D:Threedimensional reconstruction of bone defects observed from different angles at 12 weeks.E:Bone parameters of the bone defects at 12 weeks.Data are shown as Mean±SD,*P＜0.05.

3 討論

已有研究證實PLA/nHA支架在動物體內具有良好的生物相容性，當nHA在PLA的質量分數為15%時對細胞的增殖效果最好，因此在此項研究中PLA中摻入HA和nZCP質量百分數為15%［19］。支架結構方面，內部孔隙連通，大孔徑約40 μm，有利于成骨［20,21］。在組成方面，PHZ 支架中含有Ca、P 和Zn 元素，同時HA、ZCP二者在PHZ支架中均勻分散。經nZCP摻雜后，HA的XRD譜峰未發生變化，表明HA的晶格參數未受影響［20］。從FTIR 結果可以看出，PHZ 與PLA、HA、nZCP有相似的FTIR峰值，說明PLA、HA、nZCP只是簡單的混合，不涉及化學鍵變化［22］。nZCP在PHZ中的分散分布促進了降解過程中支架中Zn2+的連續穩定釋放，從而實現了長時間有效的成骨。PLA/nHA、PHZ支架抗壓強度接近松質骨（抗壓強度：0.1～16 MPa）［23］，PHZ-3與PHZ-2兩組的抗壓強度高于PLA/nHA、PHZ-1，可能是因為nZCP填充了nHA顆粒之間的空隙并且nZCP加入后支架內的無機組分有一定的團聚，提高了支架的抗壓強度。這有利于其未來在骨科治療中的應用，但PHZ的力學性能還不能完全滿足骨缺損再生的需要，今后還需進一步改進。

高劑量的Zn2+（600～900 μmol/L）被發現具有細胞毒性且對真核細胞往往是致命的［24-26］。因此，需調整生物材料中Zn2+的含量保證其對真核細胞的無毒，同時，PHZ支架在30天內持續釋放Zn2+，從3種不同Zn含量的支架PHZ-1、PHZ-2、PHZ-3所釋放的Zn2+濃度均在1～50 μmol/L的有效成骨細胞活性范圍內［24］。這種控制Zn2+的釋放可以使Zn2+保持在低濃度，降低毒性，這對未來PHZ支架在人體上的安全應用至關重要。

接下來，驗證PHZ支架促進rBMSCs的增殖和成骨分化。添加nZCP對rBMSCs的增殖無不利影響，為后續rBMSCs的成骨分化提供了基礎。隨后，我們研究了支架對rBMSCs成骨分化的影響，有研究結果表明，Zn2+能夠在增殖分化期通過刺激ALP活性和膠原合成來增加成骨作用［27］，發現添加nZCP增強了rBMSCs的ALP 活性和礦化過程。已有研究指出，Zn2+通過RUNX2的表達影響成骨活性，RUNX2是一種關鍵的成骨特異性轉錄因子，被認為是成骨分化的早期標志，OCN被認為是成骨分化的晚期標志物［28］，RUNX2是ALP、OCN的主要調控因子［29］。nZCP的加入對RUNX2、ALP、OCN基因和蛋白的表達均有上調作用，但不同的nZCP加入量在成骨分化不同時期4、7、14 d表現出不同上調程度，這可能與其他由支架釋放的離子如Ca2+和PO43-離子的共同作用有關［30］。nZCP的加入可加速成骨分化過程，PHZ-2、PHZ-3兩組的促成骨活性較好。

最后，體內實驗再次證實nZCP的加入提高了支架的成骨性能。由于支架的孔連通性和大孔結構，新生骨可從支架的外圍向內部生長。新骨在支架內部的生長證明了支架具有良好的骨傳導性。Zn2+的早期釋放可促進rBMSCs的粘附，粘連性能的改善有利于成骨早期的骨整合［31］，為后續rBMSCs的成骨分化提供了基礎。與PLA/nHA 相比，添加了nZCP 的PHZ-1、PHZ-2、PHZ-3形成了更多的新骨，說明nZCP內Zn2+的釋放增強了支架的成骨能力；PHZ-2、PHZ-3促成骨效果好于PHZ-1，說明PHZ-2、PHZ-3內的nZCP含量更有利于骨再生。

綜上所述，本研究通過水熱法合成了粒徑均勻（10 nm）的nZCP 并將其與多孔PLA/HA 支架進行復合。同時探究了在PHZ復合支架內Zn2+的釋放行為以及其細胞毒性，驗證了PHZ支架的生物相容性，通過體內外實驗找到PLA/HA內具有較好成骨活性的nZCP含量。但是因為PHZ同時可釋放Ca2+和PO43-離子，其在體內外表現出的促成骨活性可能是多種離子共同作用的結果，所以在PLA/HA摻入最佳的鋅含量仍需進一步實驗，但可以得出結論PHZ-2、PHZ-3是應用于骨質疏松性骨缺損有前景的復合材料。