銅死亡誘導劑FDX1、硫辛酸與冠狀動脈病變嚴重程度的相關性

魏 婷，丁洋洋，張佳佳，李金龍，張 恒，康品方，2，張寧汝

蚌埠醫科大學1第一附屬醫院心血管科，2心腦血管基礎與臨床重點實驗室，安徽 蚌埠233000

動脈粥樣硬化（AS）是泛指動脈壁增厚、失去彈性、硬化性的疾病，以脂質沉積和內膜纖維化為特征，所導致的冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。–HD）、心肌梗死、腦梗死等心腦血管疾病嚴重威脅人類生命健康［1,2］。CHD的一級預防、早期發現和治療一直是全球長期的科學研究目標，但其致病機制及風險因素多種多樣且復雜，導致了對它的防治仍然十分困難［3］。血脂異常是AS和CHD的直接相關危險因素，深入研究AS的發病機制、潛在治療靶點的同時，探究脂代謝異常的相關機制對AS防治同樣具有重要意義。

鐵氧還蛋白1（FDX1）是一種線粒體代謝相關的基因，屬于鐵硫（Fe-S）簇蛋白家族，廣泛表達于與類固醇生成相關的組織如：腎上腺、性腺，與脂肪酸氧化和氨基酸等代謝密切相關［4,5］。當FDX1活性的喪失會破壞鐵硫簇酶和細胞鐵穩態的活性，可導致線粒體鐵超負荷和胞質鐵消耗［6,7］。但目前為止，FDX1是否參與心血管疾病的發生發展尚不完全清楚，有關FDX1是否參與動脈粥樣硬化斑塊的形成，國內外鮮有研究。

硫辛酸（LA）在臨床上是常用的抗氧化劑，在酒精性肝炎、神經病變以及缺血再灌注損傷等疾病中發揮強大的抵御氧化應激方面作用［8］。最新的研究［9］表明，FDX1是誘導銅死亡的關鍵基因，它通過上游調節蛋白質脂?；^程來調控細胞對銅離子的敏感性，而LA是蛋白脂?；磻闹饕?，那么通過上調上游調節因子FDX1的表達來促進線粒體合成內源性LA，是否有可能成為防治AS的新靶點有待研究。

目前FDX1與LA水平與CHD的相關性仍未被充分證實，本研究擬通過檢測有無冠脈病變及冠脈不同病變程度下FDX1、LA水平差異，以及高脂血癥動物模型的建立，明確FDX1與LA水平與高脂血癥所致動脈血管損傷的相關性，為研究CHD的新型治療、預防策略提供參考依據。

1 資料和方法

1.1 研究對象及分組

選擇2021年10月～2022年10月在蚌埠醫科大學第一附屬醫院的可能患有冠心病的226例患者進行臨床診斷，其診斷分型依照1999年WHO/WPR標準。所有入院患者接受心電圖和冠狀動脈造影（CAG）等檢查明確病情，并在入院后完善心臟彩超及抽血化驗，記錄患者既往病史等基本資料。根據CAG中手術記錄患者的冠狀動脈左主干、左前降支、左旋支、右冠狀動脈等病變情況，將179例冠脈有病變的患者按照冠狀動脈狹窄最嚴重的局部血管病變情況分為：輕度狹窄組（a-CHD，狹窄程度≤49%，n=30）、中度狹窄組（b-CHD，狹窄程度50%～74%，n=30）和重度狹窄組（c-CHD，狹窄程度≥75%，n=30），其中有47例雖有胸痛癥狀但CAG檢查無異?；颊咦鳛閷φ战M。排除標準：既往有心臟瓣膜性病、嚴重肝腎及心血管功能不全、惡性腫瘤病史、風濕及免疫系統疾病、心房顫動等［10］。入選患者均簽署知情同意書，研究方案獲得本院倫理委員會批準（倫科批字[2023]344號）。根據患者CAG結果計算Gensini評分，Gensini評分法［11］（表1）。

1.2 一般資料收集及標本采集

收集所有入選患者的臨床數據資料，記錄患者基本信息、飲酒、吸煙史以及既往疾病史等，比較紅細胞計數（RBC）、白細胞計數（WBC）、白蛋白（CRP）、血小板（PLT）、低密度脂蛋白（LDL）、肝（谷丙轉氨酶ALT）、腎（肌酐Cr）功能、腦鈉肽（BNP）以及心臟彩超結果中射血分數（LVEF）、縮短分數（FS）等指標。入選患者于禁食12 h 后留取肘靜脈血5 mL 于肝素抗凝試管中，以3000 r/min離心5 min分離血清，將上清液留取至單獨的凍存管，-80 ℃冰箱中備用。

1.3 血清FDX1和LA表達水平檢測

將血清從-80 ℃冰箱取出融化，使用人FDX1、LA酶聯免疫分析（ELISA）試劑盒（上海優選生物科技有限公司）檢測血清FDX1、LA水平，檢測過程嚴格按照試劑盒說明書加入標本、標準品、檢測抗體等，在操作完成后得到FDX1、LA的吸光度（A值），通過計算出標準曲線的直線回歸方程，將A值代入方程式計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，得到實際濃度。

1.4 實驗動物及高脂血癥模型誘導

10周齡雄性ApoE-/-小鼠15只，品系C57BL/6J，體質量20±2 g，15只相同遺傳背景和周齡的雄性C57BL/6J小鼠，體質量20±2 g，購自常州卡文斯實驗動物有限公司，均為SPF 級動物，許可證號：SCXK（蘇）2021-0013。動物房溫度設置為（20～22）℃，明暗周期12∶12，環境的濕度60%。用標準飼料適應性喂養5 d后，高脂高膽固醇飼料喂養12周誘導高脂血癥模型，對照組設為標準飼料喂養的同周齡15只C57BL/6J小鼠，研究方案獲得本院倫理委員會批準（倫動科批字[2023]第546號），高脂飼料（2.0%膽固醇，2.5%豬膽鹽，10.0%豬油加入小鼠標準飼料中混勻）由常州卡文斯實驗動物有限公司提供。

1.5 小鼠血清生化指標檢測

為確定高脂血癥模型是否制備成功，12周后全部處死小鼠，隨后對各組別小鼠分別進行眼球取血，靜置1 h，3000 r/min離心10 min，經全自動生化分析儀（深圳雷杜生命科技股份有限公司）檢測TC、TG、LDL和HDL水平，根據相關公式計算出AS指數：（TC-HDL）/HDL，TG、TC、HDL、LDL測定試劑盒為全自動生化分析儀配套試劑盒由深圳雷杜生命科技股份有限公司提供。

1.6 小鼠主動脈切片HE染色

12周后停止藥物干預，將兩組小鼠處死，解剖小鼠胸主動脈組織，制備石臘，按常規方法進行脫蠟，水合，分兩次使用二甲苯將切片浸泡5 min，再分別在無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇中浸泡5 min，使用PBS將切片浸洗3次，在蘇木素-伊紅染液試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）中試劑一核染液染缸內染色3～5 min，水洗約30～60 s；浸入試劑盒的二分色液I中約20 s，再次水洗；浸入試劑盒中試劑三分色液II中約40 s后水洗；最后置于試劑盒中試劑四漿染液中染色2 min，最后多余染液使用試劑五增色液去除，濾紙吸干封片，普通光學顯微鏡下觀察兩組血管形態。

1.7 小鼠主動脈切片天狼猩紅染色

按常規方法進行脫蠟，水合，分兩次使用二甲苯將切片浸泡5 min，再分別在無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇中浸泡5 min，自來水將切片清洗3次。0.1 g天狼猩紅（索萊寶生物科技有限公司）溶解于100 mL苦味酸飽和液（索萊寶生物科技有限公司）中，配成苦味酸天狼猩紅工作液。將切片置于入苦味酸天狼猩紅染液染色2 h，并用自來水稍洗，晾干，中性樹膠封片，使用偏振光顯微鏡下觀察血管膠原蛋白沉積。

1.8 小鼠主動脈切片免疫組化染色

按常規方法進行脫蠟，水合，分2次使用二甲苯將切片浸泡5 min。再分別在無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇中浸泡5 min，使用PBS將切片浸洗3次。把切片放入抗原修復緩沖液的染色盒內，使用微波爐加熱10 min，取出清洗冷卻后用PBS 浸洗3 次，每張切片滴加2 滴3%H2O2-甲醇溶液，室溫（15～25 ℃）封閉10 min。滴加1%BSA50～100 μL，室溫孵育20 min。滴加FDX1（英國Abcam）1∶200、LA（英國Abcam）1∶100一抗50～100 μL，4 ℃過夜。加入羊抗兔IgG（英國Abcam）1∶200二抗50 μL，使用DAB試劑盒（福州邁新生物科技有限公司）顯色，蘇木素染液復染10 min，顯微鏡下觀察棕黃色顆粒沉積作為陽性。以Image J 軟件進行半定量分析，計算單位面積平均光密度值（MOD）值。

1.9 RT-qPCR 檢測小鼠主動脈FDX1、硫辛酸合成酶（LIAS）和線粒體順烏頭酸酶（ACO2）mRNA表達

稱取適量的胸主動脈樣本，將剩余組織凍存，加入1 mL的Trizol試劑（賽默飛世爾科技公司），研磨粉碎胸主動脈后，萃取小鼠主動脈組織的總RNA，TAKARA逆轉錄試劑盒（南京諾維贊生物科技股份有限公司）處理RNA，將總RNA 轉成cRNA，4℃保存，冰上解凍cDNA和qPCR試劑盒（南京諾維贊生物科技股份有限公司），配置qPCR反應液，撥動八聯管至充分混勻，氣泡消失后可放置于熒光定量PCR儀中進行擴增。按下列條件進行qPCR反應：95℃預變性30 s；然后95 ℃5 s，60 ℃30 s，共進行40個循環。溶解曲線：95 ℃5 s；60 ℃1 min。降溫：50 ℃30 s，1個循環。內參基因β-actin、FDX1、LIAS、ACO2引物由北京擎科生物科技股份有限公司生產。采用2-△△CT的方法計算目的基因的相對表達量（表2）。

表2 引物序列Tab.3 Primer sequence for RT-PCR

1.10 統計學方法

最終的數據分析，采用SPSS26.0軟件，計量資料采用均數±標準差表示，計數資料用例數（n）及百分率（%）表示；組間比較采用t檢驗、方差分析、卡方檢驗；對于指標間的相關性檢測，使用Pearson 法分析；使用軟件Image pro plus對圖片進行測量分析；當Ρ＜0.05表示差異具有統計學意義，所有的實驗都是獨立重復3次。

2 結果

2.1 受試者臨床資料比較

c-CHD組LVEF、FS顯著低于對照組（Ρ＜0.01），肝腎功能、血常規等相關指標差異均無統計學意義（Ρ＞0.05，表3）。

表3 基線資料比較Tab.3 Baseline data of the patients indifferent groups

2.2 血清FDX1、LA表達水平和Gensini評分在不同冠脈狹窄中的變化

與對照組相比，a-CHD組、b-CHD組和c-CHD組的血清FDX1水平顯著減低（Ρ＜0.05～Ρ＜0.01），隨冠狀動脈狹窄進程加重血清FDX1、LA水平逐漸降低，差異有統計學意義（Ρ＜0.01）。Gensini評分隨冠狀動脈狹窄程度加重逐漸增高，各組之間評分比較差異均有統計學意義（Ρ＜0.05，表4）。

表4 不同冠脈狹窄患者血清FDX1、LA表達水平和Gensini評分比較Tab.3 Comparison of serum FDX1 and LA levels and Gensini score in patients with different severities of coronary stenoses

2.3 血清FDX1、LA表達水平與病變支數的關系

冠狀動脈造影結果顯示各組患者冠狀動脈病變支數不同，將實驗組患者分為單支組、雙支組及多支病變組（3支及以上），分析得出，單支組、雙支組和多支組血清FDX1、LA較對照組相比顯著降低（Ρ＜0.05，表5）。

表5 血清FDX1、LA表達水平與病變支數的關系Tab.3 Correlation of serum FDX1 and LAlevels with the number of lesion branches

2.4 血清FDX1、LA表達水平與Gensini評分的相關性

血清FDX1 水平與Gensini 評分呈負相關關系（r=-0.241，Ρ＜0.01），LA水平與Gensini 評分呈負相關關系（r=-0.273，Ρ＜0.01）。

2.5 ApoE-/-小鼠高脂血癥模型制備

為確定高脂血癥模型是否成功，連續高脂飲食12周后，隨機從對照組和ApoE-/-模型組中采集樣本。小鼠血清學檢測結果顯示，ApoE-/-模型組小鼠TG、TC、LDL水平，與對照組相比均明顯上升（Ρ＜0.01）；HDL水平顯著下降（Ρ＜0.01），AS指數明顯增高（Ρ＜0.01，表6）。

表6 兩組小鼠TG、TC、HDL、LDL、AS指數水平Tab.3 Levels of TG,TC,HDL,LDLandAS index in normal andApoE-/-mice

2.6 小鼠主動脈切片HE染色結果

兩組小鼠胸主動脈HE染色顯示，C57正常對照組，血管層次分明，內中外三層膜結構清晰可見，中膜細胞排列規律整齊，未見有病理性變化；ApoE-/-模型組血管中膜增厚，中膜中彈性纖維間距增大（如黑色箭頭）伴有脂質聚集。間隙內出現炎性細胞（棕黃色箭頭），彈性纖維被破壞，出現斷裂（如藍色箭頭），（圖1A）。

圖1 兩組小鼠主動脈HE染色、天狼猩紅染色結果Fig.1 HE staining(A)and Sirius red staining(B)of the aorta of normal and ApoE-/-mice(Scale bar=20μm).

2.7 小鼠主動脈切片天狼猩紅染色結果

在偏振光顯微鏡下觀察小鼠主動脈天狼猩紅染色顯示，C57正常對照組I型和III型纖維緊密排列，I型膠原纖維和III型膠原纖維占比適中；ApoE-/-模型組I型膠原顯著增加，III型膠原顯著減少，III型膠原纖維緊斷斷續續排列與I型膠原纖維之中，I型膠原纖維占比顯著高于III型膠原纖維。與C57正常對照組相比，ApoE-/-模型組胸主動脈膠原纖維增生明顯，血管纖維化程度明顯增加（圖1B）。

2.8 FDX1、LA的免疫組織化學染色結果

免疫組化中FDX1、LA染色陽性信號為棕色顆粒，表達在細胞質中，結果顯示ApoE-/-模型組主動脈的FDX1、LA 表達量明顯低于C57 正常對照組；兩組間FDX1 表達MOD 值差異有統計學意義（F=0.620，Ρ＜0.01），兩組間LA表達MOD值差異有統計學意義（F=0.397，Ρ＜0.05，圖2）。

圖2 FDX1、LA免疫組化染色結果Fig.2 Immunohistochemical staining of FDX1(A) and LA (B) in the aorta of normal and ApoE-/-mice and quantitative analysis of their expression levels(Scale bar=100μm).*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.

2.9 RT-qPCR 檢測小鼠主動脈FDX1、LIAS、ACO2 mRNA表達結果

與對照組比較，ApoE-/-模型組主動脈FDX1 mRNA表達明顯降低（Ρ＜0.01）；與C57 正常對照組比較，ApoE-/-模型組LIAS mRNA表達明顯降低（Ρ＜0.001）；與C57正常對照組比較，ApoE-/-模型組ACO2 mRNA表達明顯降低（Ρ＜0.01，圖3）。

圖3 FDX1、LIAS、ACO2的mRNA相對表達量Fig.3 FDX1(A),LIAS(B)and ACO2(C)mRNA expression levels in the aorta of normal and ApoE-/-mice.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs control group.

3 討論

AS的發生是在微血管阻力增加、脂質代謝異常、纖維組織增生等因素共同作用下導致的血管病變［12］。研究表明，高脂血癥與CHD的發生、發展密切相關，同時也是導致CHD的一個獨立的重要危險因素［13］，血漿中增多的膽固醇脂質易沉積于動脈內膜，引起結締組織纖維化，使動脈增厚和變硬。當單核-巨噬細胞遷移至內皮損傷部位，吸收脂質形成巨噬細胞源性泡沫細胞，從而促進AS進展［14］。在臨床實踐中血脂水平經常被用于估計AS等心血管疾病的風險，并作為不良心血管事件一級預防的治療目標。Fang［15］通過薈萃分析證實茶黃素通過抑制膠束形成以減少膽固醇吸收來改善高膽固醇血癥，減輕了動脈粥樣硬化程度，從而預防冠狀動脈疾病的發生。因此在探究CHD發病機制的同時，研究高脂血癥相關血管病變的機制對于CHD的防治也有著至關重要的臨床意義。

越來越多的研究表明線粒體的代謝與AS的發生息息相關，并參與了CHD中能量代謝、氧化應激、鈣調節和細胞死亡的多個病理生理過程［16-18］。當參與線粒體的代謝的信號分子表達發生變化，如線粒體活性氧簇增加、ATP減少等，影響線粒體及細胞功能，進而引發相關生物應激反應，最終導致心血管相關疾病的發生［19］。FDX1是線粒體代謝相關的基因的一種，歸屬于Fe-S簇蛋白家族［20］。Sheftel等［21］研究顯示，FDX1利用類固醇合成急性調節蛋白將胞質內膽固醇轉移到線粒體，接著膽固醇側鏈裂解酶將膽固醇進一步轉化為孕烯醇酮，對于啟動類固醇激素的合成至關重要。Cai等［22,23］通過實驗發現，對于脂酰合成，FDX1將電子轉移到自由基S-腺苷蛋氨酸依賴性脂酰合酶中以啟動其自由基鏈反應，且FDX1在血紅素a和脂酰輔因子生物合成中具有附加和特異性作用。當FDX1缺乏時Fe-S簇蛋白生物表達降低，線粒體中細胞鐵攝取和鐵積累增加，會破壞鐵硫簇的組裝和維持正常的胞質和線粒體鐵穩態，最終導致細胞凋亡和心血管功能紊亂［24］。Yuan等［25］通過研究證實，銅死亡誘導劑FDX1可能參與心力衰竭的病理生理過程，是導致線粒體蛋白高乙?；闹饕?，有可能成為心力衰竭新型治療機制的關鍵靶點。以上研究均提示FDX1可能通過調節線粒體代謝過程參與了心血管疾病的發生發展。

LA是線粒體代謝過程的重要輔助因子，也是目前研究較廣泛的抗氧化劑［26］。國內外LA與CHD的相關文獻均表明，LA具有清除活性氧、金屬鰲合、修復氧化損傷的能力，在動脈粥樣硬化過程中的氧化應激、炎癥反應等多個病理機制中均發揮著重要調節作用［27,28］。Lian等［29］通過研究證實，內源性LA在線粒體中通過脂肪酸合成通路II（mtFAS II），由LIAS 等關鍵酶催化合成［30］，成為蛋白質脂?；闹匾?。當阻斷線粒體LA合成，造成蛋白脂酸化無法正常進行，線粒體會出現分解代謝障礙，引起細胞能量不足，表現為胚胎發育、神經和心血管功能紊亂［31,32］。WANG等［33］通過實驗發現，LA能降低心肌的缺血性損傷，其可能是心肌缺血/再灌注損傷的內源性細胞保護重要介質。因此，通過探究LA的上游調控因子從而促進內源性LA合成具有重要臨床意義［34］。Tscetkov等［35］研究表明，FDX1和蛋白質脂?；钦{控銅依賴性細胞死亡—銅死亡的關鍵因子，FDX1可上游調節線粒體蛋白質脂?；^程，而LA是蛋白質脂?；年P鍵原料，此外Joshi 等［4］也證實了FDX1 對于硫辛酸輔因子的產生至關重要，基于以上研究提示：FDX1可能通過上調內源性LA的表達共同參與了心血管疾病的發生發展，可能與冠狀動脈粥樣硬化的形成有潛在聯系，但具體機制尚不明確。

本研究首次發現，冠脈造影異常的患者血清FDX1、LA水平與正常對照組相比明顯降低，且隨著冠脈狹窄程度的加重血清FDX1、LA水平逐漸減低，提示血清FDX1、LA水平變化可能與冠脈狹窄程度有關。另外，單支病變的患者血清FDX1、LA水平最高，隨著病變支數的增加，血清FDX1、LA 水平逐漸降低，表明FDX1、LA均可以對冠脈病變情況造成影響。臨床上，Gensini評分可以反映冠心病患者冠脈病變嚴重程度［36］，Pearson檢驗分析發現，實驗組患者血清FDX1、LA水平與Gensini 積分呈負相關，Gensini 積分越高，血清FDX1、LA 水平越低；而FDX1 與LA 呈正相關，這與Tscetkov等的研究結論一致［35］。Huo等［37］通過銅離子載體Elesclomol在心肌細胞中誘導銅死亡，發現其特征是Fe-S簇蛋白的減少和線粒體酶脂?；臏p少，多種線粒體Fe-S簇蛋白如FDX1、LIAS、ACO2等的表達均明顯下降。為了探究FDX1、LA的表達是否與脂代謝異常導致的血管病變有關，本研究中成功建立了高脂血癥小鼠模型，利用免疫組織化學染色、RT-PCR等方法，首次證實了在高脂血癥模型中主動脈FDX1、LA的表達較正常對照組明顯下降，同時LIAS、ACO2等的Fe-S簇蛋白表達也明顯降低，提示，FDX1、LA的表達與高脂血癥所致的動脈病變有關。

綜上所述，冠脈狹窄患者血清FDX1、LA 水平降低，兩者水平變化與冠脈病變支數和Gensini積分有關，且兩者共同參與了冠狀動脈粥樣硬化的發生與進程。該結果為判斷冠脈病變程度及研究CHD致病機制提供了一定參考依據。血脂異常作為冠狀動脈粥樣硬化的獨立危險因素，通過動物模型進一步證實了FDX1、LA與高脂血癥導致的血管病變有關，為CHD的防治提供參考，盡管本實驗證實了FDX1、LA在冠狀動脈粥樣硬化冠脈病變、高脂血癥所致血管損傷之間的相關性，但其具體作用機制及作用途徑仍需深入研究。