牛IFN-γ真核表達系統的構建及單克隆抗體的制備與鑒定

許 芳,蔡 杰,薛華平,羅 均,蔣永青*,郭霄峰*

(1.華南農業大學獸醫學院,廣東廣州 510642;2.深圳市綠詩源生物技術有限公司,廣東深圳 518120)

牛結核病(Bovine tuberculosis,bTB)是由結核分支桿菌復合群(Mycobacterialtuberculosiscomplex,MTBC)引起的一種慢性消耗性人獸共患傳染病,其主要病原是牛分支桿菌(Mycobacteriumbovis)和結核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)[1]。該病是當今世界養牛業面臨的最復雜的動物健康問題之一,也威脅著食品安全。

牛結核病是世界動物衛生組織(WOAH)規定必須通報的疾病之一,我國列為二類動物疫病。發達國家每年M.bovis導致人結核病比例為1%左右,發展中國家或貧困地區由M.bovis導致人結核病比例為5%～28%[2-3]?？焖儆行У卦\斷是控制bTB的關鍵?，F有的診斷方法有結核菌素皮內變態反應(tuberculin skin test,TST)、牛γ干擾素(gamma interferon,IFN-γ)體外釋放試驗和血清抗體檢測方法等。bTB感染導致機體產生免疫,主要包括細胞免疫和體液免疫。感染早期以細胞免疫為主,感染中、后期機體轉為以體液免疫為主[4-6]。因此,血清學抗體檢測在感染中、后期的bTB診斷中發揮著重要作用。而TST和IFN-γ體外釋放試驗在該病感染早期的診斷中發揮著重要作用,更有利于控制和切斷bTB的傳播。TST為皮內注射牛提純結核菌素(purified protein derivative ofM.bovis,bPPD),bPPD源自M.bovis培養物的提取物,與環境分支桿菌有交叉抗原,極易出現非特異性結果,導致檢測假陽性。牛IFN-γ體外釋放試驗,是國際公認的bTB確診標準[7],為TST的理想補充試驗[8-9]。隨著bTB發展,需要不斷對這些方法進行改善[10]。文獻中大多使用原核表達系統獲得牛IFN-γ[11-13],該方法獲得的牛IFN-γ與天然牛IFN-γ構象上仍存在一定差別,而利用真核表達系統則可以獲得與天然構象更為相似的IFN-γ。真核表達系統使用較多的有酵母表達系統、哺乳動物表達系統和昆蟲細胞表達系統,具有對轉錄后的加工系統、翻譯后的修飾系統以及可實現真正的分泌表達等優勢,克服了原核表達系統中沒有轉錄后剪切、加工系統以及不能進行有效的糖基化、磷酸化、甲基化等缺陷[14]。本研究通過構建真核表達系統表達出與天然IFN-γ更為相似的牛IFN-γ重組蛋白,制備出牛IFN-γ單克隆抗體,為后續開發bTB IFN-γ體外釋放酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體、細胞系、實驗動物和樣本 pFastBacl載體和骨髓瘤細胞(S/P20)由華南農業大學獸醫微生物實驗室保存;Balb/c雌性小鼠購自珠海百試通生物科技有限公司。樣本為無菌采集的牛全血,經商品化牛結核病γ干擾素ELISA檢測試劑盒中牛結核菌素(bPPD)、禽結核菌素(aPPD)和PBS分別刺激培養,刺激后的培養物取上清,并使用該試劑盒檢測確定為陽性樣本。本試驗使用bPPD和PBS的刺激上清分別作為雙抗夾心ELISA效果驗證的陽性樣本和陰性樣本。

1.1.2 主要試劑 限制性內切酶、T4連接酶,美國NEB公司產品;質粒小量提取試劑盒,美國Omega Bio-Tek公司產品;DNA Marker、膠回收試劑盒,日本寶生物工程(大連)有限公司;DH5α感受態細胞,中國北京全式金生物技術股份有限公司產品;DH10Bac感受態細胞,中國上海唯地生物技術有限公司產品;LipoInsectTM轉染試劑、桿狀病毒穿梭載體Bacmid小量抽提試劑盒、Protein G親和層析柱、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型),中國上海碧云天生物技術有限公司產品;SFM培養液,中國上海倍進生物技術有限公司產品;BCA蛋白定量試劑盒,中國江蘇康為世紀生物科技股份有限公司產品;蛋白Marker、Ni-NTA His·Bind?樹脂、50×HAT(A:氨基蝶呤)、50×HT(H:次黃嘌呤和T:胸腺嘧啶核苷)、弗氏完全和弗氏不完全佐劑、融合劑PEG (P7181)、辣根過氧化物酶(HRP)、鼠類單克隆抗體亞類鑒定試劑盒,德國Merck公司產品;RPMI 1640培養基、胎牛血清FBS,美國Thermo Fisher Scientific公司產品;青、鏈霉素,中國華北制藥股份有限公司產品;TMB底物液,美國Seracare公司產品;rProtein G Beads 4FF親和層析柱,中國天地人和生物科技有限公司產品;商品化牛結核病γ干擾素ELISA檢測試劑盒,中國武漢科前生物股份有限公司產品。

1.1.3 主要儀器 振蕩培養箱,中國上海一恒科學儀器有限公司產品;酶標儀,美國Thermo Fisher Scientific公司產品;二氧化碳培養箱,中國益世科(上海)企業發展有限公司產品;高速冷凍離心機,美國Beckman Coulter公司產品;顯微鏡,日本Olympus公司產品。

1.2 方法

1.2.1 IFN-γ基因序列合成 分別將限制性內切酶(BamH Ⅰ)、信號肽、牛IFN-γ序列(FJ263670.1)、TEV識別位點、His標簽和限制性內切酶(EcoR Ⅰ)基因序列合成到PUC57克隆載體上?；蛐蛄杏芍袊ど锕こ?上海)股份有限公司合成。

1.2.2 引物設計 根據GenBank中牛IFN-γ序列(FJ263670.1),在上、下游引入BamHⅠ和EcoRⅠ限制性酶切位點,設計檢測引物IFN-γ-F和IFN-γ-R;同時依據pFastBacl載體序列,設計檢測重組桿狀病毒的通用引物M13-F和M13-R(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 IFN-γ基因引物和M13通用引物序列

1.2.3 重組表達質粒的構建與鑒定 復蘇PUC57克隆載體,過夜擴大培養后提取質粒,用BamHⅠ、EcoRⅠ在37℃的水浴鍋中進行雙酶切鑒定。對IFN-γ片段進行膠回收,經BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切后,克隆至表達載體pFastBac1上,轉化至DH5α感受態細胞后,涂布菌液到含有氨芐抗生素的平板上,過夜培養,平板上挑取單菌落進行PCR鑒定,過夜培養,提取質粒,進行雙酶切鑒定,將鑒定正確的質粒命名為pFastBac1-IFN-γ。

1.2.4 重組桿粒的構建與鑒定 將雙酶切鑒定成功的陽性質粒轉化至DH10Bac感受態細胞后,涂布到含有3種抗生素即卡那霉素、慶大霉素、四環素,以及兩種顯色物質即X-Gal和IPTG的平板中,倒置培養,經過3輪藍白斑篩選,選擇單個白色的菌落擴大培養后,使用桿狀病毒穿梭載體Bacmid小量抽提試劑盒提取桿粒DNA,以IFN-γ和M13的上、下游引物進行PCR鑒定,將鑒定正確的重組桿粒命名為Bacmid-IFN-γ。

1.2.5 重組桿粒的轉染 將Sf9昆蟲細胞調整至對數生長期進行細胞計數,每孔8×105個細胞鋪于6孔細胞板中,室溫下靜置10 min;向100 μL不含血清的昆蟲培養基中加入8 μL轉染試劑,短暫渦旋混勻后,室溫靜置30 min;向100 μL不含血清的昆蟲培養基中加入3 μg重組桿粒,輕輕吹打混勻;將上述兩種溶液混勻,室溫靜置30 min,加入到6孔板中,即為轉染孔,同時做空白細胞對照;27℃培養5 h后棄去6孔板中液體,加入含10% FBS的昆蟲培養基;27℃培養96～120 h。

1.2.6 桿狀病毒的接毒與傳代 培養96～120 h后,在顯微鏡下觀察細胞病變,從每孔中收集1 mL含有病毒的上清液,轉入無菌EP管中,10 000 r/min離心2 min,除去細胞和大碎片,將上清轉移至EP管中,記作P1代重組桿狀病毒,繼續將P1代毒接種到100 mL細胞密度約2×106個/mL的Sf9細胞中培養,27℃、100～120 r/min振蕩培養,觀察細胞病變,96～120 h收取P2代桿狀病毒。對收集的P2代病毒液提取DNA并進行PCR鑒定及測序。

1.2.7 IFN-γ蛋白的大量表達、純化與鑒定 取P2代桿狀病毒50 mL,接于1 L細胞密度為2×106個/mL的Sf9細胞中培養,培養96～120 h收取病毒液用于目的蛋白的檢測和純化。細胞培養液8 000 r/min離心30 min后,收集上清,使用Beckman高速冷凍離心機,SW37Ti轉頭進行超速離心,30 000 r/min離心2 h后棄去上清,每管用200 μL的TEN溶解沉淀,過夜溶解后收集上清,用Ni-NTA His·Bind?樹脂進行蛋白純化。經SDS-PAGE電泳,分析目的條帶的表達量。使用商品化的牛結核病γ-干擾素ELISA檢測試劑盒中兔抗牛γ干擾素多抗進行Western blot鑒定,判斷該蛋白的反應原性。將純化的IFN-γ蛋白稀釋至10、5、2.5、1、0.5、0.25、0.1 μg/mL,使用商品化牛結核病γ干擾素ELISA檢測試劑盒檢測,操作步驟按該試劑盒說明書進行,進一步判斷該蛋白的反應原性。

1.2.8 單克隆抗體的制備

1.2.8.1 小鼠免疫與細胞融合 按照常規方法進行Balb/c小鼠免疫[15]。用純化IFN-γ蛋白免疫小鼠,50 μg/只,三免后14 d,尾靜脈采血測定血清效價。融合前3 d加強免疫,取免疫小鼠脾細胞和SP2/0細胞按照常規方法進行細胞融合。

1.2.8.2 篩選方法的建立 間接ELISA法測定效價。用包被液將純化的IFN-γ蛋白稀釋至50 ng/mL,加入96板孔中,100 μL/孔,置2～8℃放置15 h;棄去包被液,拍干,用洗滌液洗板1次,300 μL/孔;棄去洗滌液,拍干,加入5%脫脂奶粉封閉板孔,200 μL/孔,置37℃溫育60 min;棄去封閉液后拍干,加入使用磷酸鹽緩沖液(PBS,0.01mol/L,pH 7.4)倍比稀釋的雜交瘤細胞培養上清、小鼠腹水,100 μL/孔,置37℃溫育60 min,洗滌3次;加入1∶5 000稀釋的羊抗鼠IgG-HRP酶標二抗,100 μL/孔,置37℃溫育30 min;洗滌3次,加入底物顯色液,100 μL/孔,20～25℃避光顯色10 min;加入終止液,50 μL/孔;測定OD450nm值,分別設SP2/0細胞培養上清、腹水作為陰性對照,當OD450nm值大于陰性對照OD450nm值2倍時對應的最大稀釋度作為單克隆抗體的效價。

1.2.8.3 陽性雜交瘤細胞株的篩選與克隆 采用建立的間接ELISA法對雜交瘤細胞上清進行篩選。陽性孔再經過3次有限稀釋法進行亞克隆,待陽性率達到100%時擴大培養,收集上清并凍存細胞,用于制備腹水。

1.2.8.4 小鼠腹水的制備 采用體內誘生法制備單克隆抗體腹水。

1.2.9 單克隆抗體的鑒定

1.2.9.1 亞類鑒定 按照商品化的單抗亞型鑒定試劑盒說明書進行亞類鑒定。

1.2.9.2 單克隆抗體腹水的效價測定 將雜交瘤細胞株腹水以1∶100、1∶200等倍比稀釋(100×2n-1),以SP2/0腹水作為陰性對照,用純化的IFN-γ蛋白包被的間接ELISA檢測其效價,當(陽性樣本OD450nm值/陰性對照OD450nm值)≥2時,對應的最大稀釋度作為單克隆抗體效價。

1.2.10 單克隆抗體的純化和標記 按照rProtein G Beads 4FF親和層析柱說明書進行單克隆抗體純化、使用商品化的BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測單克隆抗體的濃度。使用HRP標記單克隆抗體,具體操作如下:稱取5 mg HRP溶于1 mL雙蒸水中,加入500 μL新鮮配制的碘酸鈉溶液,2～8℃反應30 min,溶液呈草綠色,再加入0.5 mL乙二醇(0.16 mol/L),混勻后室溫避光反應30 min。然后加入5 mg純化后的單克隆抗體,在pH 9.5的碳酸鹽緩沖液中2～8℃透析15 h。次日,在溶液中加入新鮮配制的NaBH40.2 mL,混勻后2～8℃反應2 h,再加入等體積的飽和硫酸銨溶液,2～8℃靜置30 min,7 000 r/min離心10 min,棄上清,用PB緩沖液重懸,在PB緩沖液2～8℃透析15 h,收集透析袋內容物。

1.2.11 單克隆抗體的表位分析 通過相加ELISA試驗鑒定篩選到的不同單抗是否針對同一抗原表位。以0.25 μg/mL重組IFN-γ包被酶標板,先以其中一種飽和濃度的單抗37℃作用1 h,洗滌后再與另一種飽和濃度的單抗于37℃作用1 h,洗滌后加入HRP-羊抗鼠IgG 37℃溫育1 h,洗滌后加入TMB底物顯色,測定OD450nm值并記錄為A1+2。按照以下公式分別計算兩種單克隆抗體疊加后的AI值,AI=(A1+2-A1)/A2×100%;其中A1+2表示2株單抗疊加后的OD450nm值;A1表示第1株單抗的OD450nm值;A2表示第2株單抗的OD450nm值。當兩兩疊加后的AI值大于10%時,表明這兩株抗體所識別的抗原位點不同;當兩兩疊加后的AI值小于或等于10%時,表明這兩株抗體所識別的抗原位點相近或相同[16-17]。

1.2.12 單克隆抗體與重組IFN-γ蛋白的反應原性鑒定 重組IFN-γ蛋白純化后進行SDS-PAGE電泳,轉至PVDF膜上,TBST洗滌3次后用5%脫脂奶粉封閉4℃過夜,再次洗滌,選擇不同株單克隆抗體作一抗室溫孵育1 h,TBST洗滌3次,二抗HRP-羊抗鼠稀釋至1∶5 000后室溫孵育1 h,最后洗滌5次,ECL顯色。

1.2.13 雙抗夾心ELISA效果驗證 用方陣滴定法驗證雙抗夾心效果。用包被液將單克隆抗體(起始濃度均調整為1 mg/mL)按1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800和1∶25 600稀釋后,分別橫向加入酶標板中,每個稀釋度重復12孔,每孔100 μL,包被酶標板,置2～8℃過夜。次日棄去板孔中包被液,洗板1次,加入200 μL封閉液,置37℃作用2 h,棄去板孔中封閉液,拍干;將已獲得的陰性樣本(N)和陽性樣本(P)分別加入酶標板中,N加入1～6列,P加入7～12列,均是50 μL/孔,再將IgG-HRP酶標抗體(起始濃度為1 mg/mL)按1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000和1∶16 000稀釋,縱向加入酶標板中,每個稀釋度加1列(8孔)。37℃孵育30 min,洗板3次;拍干后加入TMB底物,室溫避光反應10 min,以2 mol/L硫酸溶液終止。酶標儀測定OD450nm值,計算P/N值。

2 結果

2.1 重組表達質粒的構建與鑒定

挑取單菌落,對重組PUC57克隆載體進行BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切,酶切產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,電泳結果可見1條約2 668 bp的載體條帶和一條約561 bp的目的片段條帶,與預期大小相符(圖1)。將獲得的IFN-γ基因擴增產物經BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切后連接到pFastBac1載體上,轉化到DH5α后,將菌液涂布在平板上,挑取單菌落后提取質粒經BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切鑒定,經1%瓊脂凝膠電泳后出現了一條約5 500 bp左右的載體片段和一條約561 bp左右的目的片段,大小與預期一致(圖1),表明重組表達質粒pFastBac1-IFN-γ已構建成功。

M.DNA標準DL5 000; 1.IFN-γ基因克隆載體雙酶切產物; 2.重組質粒pFastBac1-IFN-γ雙酶切產物

2.2 重組桿粒Bacmid-IFN-γ的構建與鑒定

將質粒pFastBac1-IFN-γ轉化至DH10Bac,涂布到平板上,倒置培養,48 h后挑選白色單菌落涂布到平板,連續兩次后,挑選白色單菌落擴大培養,使用桿狀病毒穿梭載體Bacmid小量抽提試劑盒提取桿粒,并用M13引物對桿粒進行鑒定,經1%瓊脂凝膠電泳分析,結果顯示一條約2 800 bp左右的載體片段,大小與預期一致(圖2)。IFN-γ引物擴增后將片段送去測序,序列比對結果表明,插入到載體中的序列與 GenBank 中公布的牛IFN-γ序列完全一致,閱讀框也未發生移碼,說明重組質粒插入序列正確。

M.DNA標準DL5 000; 1.M13的PCR產物

2.3 重組蛋白的表達、純化與鑒定

收獲P2代桿狀病毒,感染處于對數生長期的Sf9細胞,72 h后收集細胞培養液上清,純化后經SDS-PAGE鑒定,在19 ku左右出現一條帶(圖3),與預期大小相符合。Western blot結果顯示,在19 ku、22 ku和38 ku處各有一條帶(圖3),說明該重組蛋白具有良好的反應原性。商品化的試劑盒檢測純化的IFN-γ蛋白,當蛋白濃度為0.125 μg/mL時,OD450nm值仍高于1.0(表2),說明該蛋白具有較好的反應原性。

M.蛋白分子質量標準; 1.純化的rIFN-γ-Bac重組蛋白; 2.rIFN-γ-Bac重組蛋白

表2 商品化試劑盒檢測IFN-γ蛋白結果

2.4 單克隆抗體的制備與鑒定

共獲得4株能穩定分泌抗牛IFN-γ蛋白的單克隆抗體雜交瘤細胞株,用單抗亞類鑒定試劑盒鑒定,4C3單抗亞類為IgG2a型,2A9、4H11和5B12單抗亞類均為IgG2b型(圖4),輕鏈均為κ鏈。間接ELISA法檢測腹水效價均高于1∶5.12×106,4C3腹水效價最高(圖5)。誘生的小鼠腹水純化后,經SDS-PAGE電泳鑒定,在50 ku和25 ku附近有兩條清晰的帶(重鏈、輕鏈各一條),而無其他條帶(圖6)。BCA測定單克隆抗體濃度,并將濃度調整為1 mg/mL。HRP標記每株單克隆抗體1 mg,其他未標記的單克隆抗體置于-20℃保存備用。

圖4 單克隆抗體亞型鑒定

圖5 腹水中單克隆抗體效價檢測

M.蛋白分子質量標準; 1～4.純化后的單克隆抗體

2.5 單克隆抗體的表位分析

用相加ELISA試驗檢測各株單抗針對牛IFN-γ抗原表位情況,按照公式計算AI指數,可知篩選到的單抗4H11與2A9、4C3與2A9、5B12與2A9、4H11與2A9、4H11與5B12所針對的抗原表位相同或相近;單抗4C3與4H11、4C3與5B12所識別的抗原表位可能不同(表3和表4)。

表3 相加ELISA試驗OD450nm值

表4 相加ELISA試驗AI計算結果

2.6 單克隆抗體與重組IFN-γ蛋白的反應原性

進一步驗證4C3、4H11與重組IFN-γ蛋白的反應原性,Western blot結果顯示,4C3和4H11在19 ku和38 ku處各有一條較明顯的帶(圖7),表明該重組蛋白具有良好的反應原性。

M.蛋白分子質量標準; 1.4C3; 2.4H11

2.7 雙抗夾心ELISA效果驗證

根據相加ELISA試驗結果,4C3與4H11、4C3與5B12所識別的抗原表位可能不同。以4C3作為包被抗體,4H11-HRP和5B12-HRP分別作為檢測抗體,進行雙抗夾心ELISA效果驗證。結果顯示,當4H11-HRP作為檢測抗體時,P/N值最高可達22.875,具有較明顯的夾心效果(表5～表8)。

表5 4C3/4H11-HRP雙抗夾心ELISA OD450nm值

表6 4C3/4H11-HRP雙抗夾心ELISA P/N計算結果

表7 4C3/5B12-HRP雙抗夾心ELISA OD450nm值

表8 4C3/5B12-HRP雙抗夾心ELISA P/N計算結果

3 討論

牛結核病的主要防控策略是“檢疫-撲殺”,因此早期快速有效的診斷有利于控制和切斷病原傳播。IFN-γ體外釋放檢測法是目前比較認可的早期診斷方法[18-19]。牛IFN-γ是一種分泌性糖蛋白,活性形式是牢固的二聚體或四聚體,具有復雜的空間結構和抗原表位[20]。用真核表達系統表達的重組蛋白制備單克隆抗體優于原核表達的蛋白[14]。本研究用桿狀病毒系統表達重組IFN-γ蛋白,與細菌、酵母和哺乳動物細胞表達系統相比,桿狀病毒表達系統具有表達產量高,產物可以進行翻譯后加工的優點。另外,重組IFN-γ蛋白為分泌性表達,保證了其正確的折疊和翻譯后修飾,進而保證免疫原性,更適用于單克隆抗體的制備。本研究用桿狀病毒系統成功表達了重組牛IFN-γ,經純化后獲得了較高純度的重組蛋白;Western blot結果顯示表達的重組蛋白在19 ku、22 ku和38 ku處各有條帶,可能與糖基化修飾和形成二聚體有關,而天然IFN-γ一般以二聚體的形式存在,同時存在2個潛在的糖基化位點,因此其空間結構更接近天然IFN-γ的構象。通過商品化試劑盒檢測純化的重組IFN-γ蛋白的結果,也進一步證實了該蛋白具有較強的反應原性。本研究用常規方法進行單克隆抗體的制備,共獲得4株針對重組IFN-γ的單克隆抗體,用臨床篩選的陰性和陽性樣本進行驗證,篩選出了2株具有較好夾心效果的單克隆抗體,為后續牛結核病IFN-γ體外釋放ELISA檢測試劑盒的研發奠定了基礎。