白術多糖對Cr(Ⅵ)誘導PK-15細胞凋亡和小鼠腎損傷的影響

呂昌洋,范汝鵬,趙茜曼,高憶凡,蔣猛林,李林玨,鄭丕苗,劉建柱,趙曉娜

(山東農業大學動物科技學院,山東泰安 271018)

重金屬鉻(Cr)毒性大,在生物體具有富集強的特點。進入動物體后,通過血液循環到達全身,從而對機體產生不同的損害作用。畜禽吸收后將會嚴重損傷消化道,造成中樞神經系統、肝臟、腎臟等器官的損傷[1]。研究發現六價鉻[Cr(Ⅵ)]通過人類腫瘤細胞系以及大鼠肝臟和垂體細胞中的線粒體途徑刺激細胞死亡[2]。

《醫學啟源》記載:“白術除濕益燥,和中益氣,溫中,去脾胃中濕,除胃熱,強脾胃,進飲食,安胎”,具有健脾益氣,燥濕利水,止汗,安胎等功效。白術含有揮發油、多糖、黃酮類、氨基酸等活性成分,白術多糖是其主要活性成分之一,具有抗氧化、抗凋亡、免疫調節及保肝等作用,但其在Cr(Ⅵ)毒性中的保護作用及其機制報道較少。因此,通過探究RAMPSt對Cr(Ⅵ)致PK-15細胞氧化損傷和染Cr(Ⅵ)小鼠腎損傷的保護作用,為中藥多糖緩解Cr(Ⅵ)所致腎損傷提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、動物及白術多糖 豬腎上皮細胞(PK-15)由本實驗室保存;40只Balb/c小鼠購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司;RAMPSt為本實驗室提取保存,多糖含量為82%。

1.1.2 主要試劑 牛血清蛋白(BSA)和水溶性復合物(BCA)蛋白質測定試劑盒,北京康維世紀生物科技有限公司產品;蛋白裂解液、二甲基亞砜(DMSO)、十二烷基硫酸鈉(SDS)和Tris Base,北京索萊寶科技有限公司產品;1.5 mol/L Tris (pH8.8)和1.5 mol/L Tris (pH6.8),湖北賽維爾公司產品;PVDF膜,Millpore公司產品;封閉專用脫脂奶粉(D8340)、細胞膜蛋白及細胞漿蛋白抽提試劑盒、SOD、GSH和MDA檢測試劑盒、活性氧檢測試劑盒、線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)檢測試劑盒,上海碧云天技術有限公司產品;雅酶彩虹預染蛋白Marker,上海雅酶生物科技有限公司產品;Bcl-2抗體,武漢三鷹生物技術有限公司產品;Bax抗體,Gene Tax公司產品;小鼠活性氧簇(ROS)ELISA檢測試劑盒,上海源桔生物科技有限公司產品;超敏ECL化學發光檢測試劑盒、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG、小鼠抗GAPDH單克隆抗體Cat:60004,Proteintech公司產品;Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒,Dojindo公司產品;CCK-8試劑盒,Med Chem Express公司產品;DMEM培養基,Gibco公司產品;胎牛血清,浙江四季青生物科技有限公司產品;胰蛋白酶,北京索萊寶科技有限公司產品。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺,蘇州凈化設備有限公司產品;二氧化碳培養箱,北京眾力挽生物科技有限公司產品;倒置生物顯微鏡,上海帝綸;流式細胞儀,Becton Dickinson公司產品;電泳及轉膜設備,北京六一生物科技有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將PK-15細胞培養于含有50 mL/L胎牛血清的DMEM高糖培養基,在37℃、體積分數為5%的CO2飽和濕度箱中培養。

1.2.2 動物試驗 40只6周齡小鼠隨機分為對照組、Cr(Ⅵ)處理組(40 μmol/kg)、200 mg/kg RAMPSt組和200 mg/kg RAMPSt+Cr(Ⅵ)組,每組10只。采用灌胃方式連續給藥5 d,每天1次,治療組給藥RAMPSt按照小鼠體重計算(200 mg/kg),對照組以及Cr(Ⅵ)處理組灌胃等量的生理鹽水。于第6天剖檢并采集腎臟,并放-80℃冰箱保存備用。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞存活率 參照CCK-8試劑盒說明書測定細胞活力。將PK-15細胞在96孔板中培養。根據試驗進行分組,分別添加不同濃度的Cr(Ⅵ)(20、40、60、80、100 μmol)并處理不同的時間(6、12、24 h),以及40 μmol Cr(Ⅵ)和不同濃度的RAMPSt(50、100、200 、400 μg/mL)共處理,每組設置3個平行復孔。加入CCK-8檢測液,并用酶標儀在450 nm的波長檢測吸光度,評估細胞活力。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率 按照1.2.4方法進行細胞的培養及分組,參照Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡試劑盒說明書分析各組細胞凋亡,即采用預冷的PBS洗滌細胞3次,加入適量的緩存液進行重懸,加入10 μL Annexin V-FITC混勻后,4℃孵育15 min再加入10 μL PI溶液混勻,并采用流式細胞儀進行上機檢測。

1.2.6 激光共聚焦顯微鏡觀察凋亡細胞 將PK-15細胞接種于6孔板,置37℃、體積分數為5% CO2培養箱中并進行分組。按照操作進行爬片、洗滌、通透、封閉、孵育一抗并4℃過夜、孵育二抗1 h后并在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.7 流式細胞術檢測ROS 將PK-15接種于6孔板并置37℃、體積分數為5% CO2培養箱中。使用ROS檢測試劑盒,利用熒光探針DCFH-DA檢測細胞中ROS水平。即1∶1 000用無血清培養液稀釋DCFH-DA,最終濃度為10 μmol/mL,37℃培養孵育20 min。用無血清培養基清洗3次,以充分除去未進入細胞的DCFH-DA。收集細胞,并用1 mL的PBS重懸細胞用于流式細胞儀檢測。

1.2.8 MDA和GSH含量與SOD活力的檢測 將PK-15細胞置37℃、體積分數為5% CO2培養箱中,待細胞長到70%～80%,采用胰酶法消化細胞后,按照試劑盒說明書的方法測定MDA含量、GSH含量與SOD活力。

1.2.9 ELISA檢測ROS含量 將小鼠的腎臟組織在4℃冰浴下用生理鹽水制成10%組織勻漿,并取勻漿組織,參照試劑盒說明書的方法檢測ROS的含量。

1.2.10 蛋白免疫印跡試驗 將PK-15細胞置37℃、體積分數為5% CO2培養箱中培養24 h后,用細胞裂解液于冰上裂解各組細胞,提取細胞蛋白,BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白樣品濃度。并對所提取的蛋白進行蛋白變性,進行10% SDS-PAGE凝膠電泳,并轉至偏二氟乙烯(PVDF)膜上,然后在5%脫脂奶粉下封閉2 h。并用TBST洗滌,每次10 min,然后放入一抗Bcl-2、Bax、Caspase-3(1∶1 000)、GAPDH(1∶5 000)中,4℃過夜孵育;TBST充分洗滌PVDF膜3次,然后放入二抗中,室溫孵育60 min,TBST洗膜。然后通過顯影儀顯像得到的圖片用Image J 軟件對蛋白灰度值。

玉米粗縮病也稱玉米條紋矮縮病，是由灰飛虱吸食葉片汁液后，使玉米植株中毒感染病。染病癥狀是：植株扭曲生長，有的植株發生矮化、節間縮短，呈叢生型（君子蘭苗），葉色渾綠，葉片厚短而寬，硬而脆，密集叢生。背面葉脈上產生粗細不一的蠟白條紋突起，用手摸有明顯的粗糙感，植株矮化嚴重，一般是在四至五葉片染病，一般不能抽穗，造成絕產，七葉片之后感病的植株能抽穗結實，但發育不良，減產幅度很大，因此玉米粗縮病是玉米生產上的指名病害。

2 結果

2.1 Cr(Ⅵ)的細胞毒性作用

PK-15細胞的活性隨著Cr(Ⅵ)的濃度和作用時間的增加而降低(圖1)。用Cr(Ⅵ)處理PK-15細胞會引起細胞損傷,呈時間和濃度梯度依賴性關系;在40 μmol Cr(Ⅵ)處理PK-15細胞12 h后,細胞的相對存活率為51.6%,因此選擇40 μmol Cr(Ⅵ)處理12 h作為后續的試驗條件。

*P<0.05,**P<0.01。

2.2 RAMPSt對PK-15細胞活性的影響

在50～400 μg/mL時,RAMPSt對PK-15細胞沒有損傷作用(圖2)。與對照組相比,40 μmol Cr(Ⅵ)處理組細胞存活率顯著降低(P<0.01),200 μg/mL RAMPSt組細胞存活率較Cr(Ⅵ)處理組顯著增高(P<0.01)。因此,選用200 μg/mL RAMPSt作為后續試驗濃度。

**P<0.01,NS P>0.05

2.3 RAMPSt對Cr(Ⅵ)誘導細胞內氧化應激的影響

與對照組相比,Cr(Ⅵ)處理組PK-15細胞內ROS水平顯著升高(P<0.01),RAMPSt組較Cr(Ⅵ)處理組相比,細胞內ROS水平顯著降低(P<0.01)(圖3A和3B)。與對照組相比,Cr(Ⅵ)處理組細胞內的MDA水平顯著升高(P<0.01),GSH、SOD水平顯著降低(P<0.01),而RAMPSt組較Cr(Ⅵ)處理組相比,細胞內的MDA水平顯著降低(P<0.01),GSH、SOD水平顯著升高(P<0.01)(圖3C、圖3D和圖3E)。

A.ROS流式結果圖;B.ROS定量分析;C.細胞內MDA含量;D.細胞內SOD含量;E.細胞內GSH含量。*P<0.05,**P<0.01,NS P>0.05

A.MMP結果圖;B.MMP變化的定量分析,**P<0.01,NS P>0.05

A.通過蛋白質印跡檢測Bcl-2;B.通過蛋白質印跡檢測Bax;C.Bcl-2蛋白水平的定量分析;D.Bax蛋白水平的定量分析。*P<0.05,**P<0.01,NS P>0.05

2.4 RAMPSt對Cr(Ⅵ)誘導細胞內線粒體膜電位變化的影響

Cr(Ⅵ)處理組線粒體膜電位下降顯著高于對照組(P<0.01)(圖4),而RAMPSt干預后線粒體膜電位下降,較Cr(Ⅵ)處理組顯著降低(P<0.01)。

2.5 RAMPSt對Cr(Ⅵ)誘導細胞凋亡的影響

Cr(Ⅵ)處理組的細胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.01),RAMPSt干預后,細胞凋亡率較Cr(Ⅵ)處理組顯著降低(P<0.01)(圖5)。

2.6 RAMPSt對Cr(Ⅵ)誘導細胞凋亡相關蛋白的影響

與對照組相比,Cr(Ⅵ)處理后Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.01),Bax表達顯著升高(P<0.05),RAMPSt組干預后后顯著抑制了Cr(Ⅵ)引起的Bcl-2蛋白表達水平的降低(P<0.05)及Bax蛋白表達水平的升高(P<0.01)(圖6)。

2.7 氧化應激在Cr(Ⅵ)誘導的細胞凋亡的作用

添加抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)后,可以顯著抑制Cr(Ⅵ)誘導PK-15細胞內ROS水平的增加(P<0.01); RAMPSt也可以顯著抑制Cr(Ⅵ)誘導PK-15細胞內ROS水平的增加(P<0.01)(圖7A和圖7B);與對照組相比,Cr(Ⅵ)處理組的熒光強度顯著增多(圖7C),而NAC+Cr(Ⅵ)組和RAMPSt+Cr(Ⅵ)組與Cr(Ⅵ)處理組相比,熒光強度減少,結果表明ROS參與了Cr(Ⅵ)誘導的細胞凋亡,降低ROS的水平可以緩解Cr(Ⅵ)誘導的PK-15細胞凋亡。

A.流式細胞術檢測ROS;B.ROS統計結果;C.用Annexin V-FITC/PI雙染法熒光探針觀察細胞凋亡,*P<0.05,**P<0.01,NS P>0.05

2.8 RAMPSt對Cr(Ⅵ)誘導小鼠腎臟組織氧化應激相關指標的影響

與對照組相比,Cr(Ⅵ)處理后小鼠腎組織中ROS、MDA水平顯著升高(P<0.01),GSH、SOD水平顯著降低(P<0.01),RAMPSt組干預后抑制了Cr(Ⅵ)引起的ROS、MDA水平的升高和GSH、SOD水平的降低(圖8)。

圖8 小鼠腎組織中氧化應激指標的變化

2.9 RAMPSt對Cr(Ⅵ)誘導小鼠腎臟組織的影響

與對照組相比,Cr(Ⅵ)組小鼠腎組織中抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平顯著降低(P<0.01),促凋亡蛋白Bax表達水平顯著升高(P<0.01);而RAMPSt干預后Bcl-2蛋白表達水平顯著升高(P<0.01),Bax蛋白表達水平的降低(P<0.01)(圖9)。

A～B.Western blot檢測小鼠腎組織中Bcl-2和Bax蛋白;C～D.小鼠腎組織中Bcl-2和Bax蛋白定量分析,**P<0.01,NS P>0.05

3 討論

Cr(Ⅵ)通過食物鏈威脅公眾健康,腎臟是蓄積和排泄Cr(Ⅵ)的主要器官,通過篩選Cr(Ⅵ)致PK-15細胞損傷的濃度和時間,發現在12 h時Cr(Ⅵ)對PK-15細胞的IC50是40 μmol,因此選用Cr(Ⅵ)40 μmol和12 h作為本研究的試驗濃度和作用時間。根據Cr(Ⅵ)的作用時間選擇RAMPSt的最佳作用濃度,最終選用40 μmol/mL 的Cr(Ⅵ)和200 μg/mL 的RAMPSt進行共處理或者單獨處理12 h進行試驗。

多糖是中草藥中含量最為豐富的活性成分之一,植物多糖在緩解重金屬中毒方面效果很好[3]。本試驗設計了在PK-15細胞上探究RAMPSt對Cr(Ⅵ)誘導的細胞凋亡的保護作用。腎臟參與滲透調節和毒物的代謝導致組織病理學改變[4],選用小鼠作為動物模型,觀察RAMPSt對Cr(Ⅵ)誘導小鼠腎氧化應激及凋亡的作用。

氧化應激是指機體或細胞內ROS與內源性抗氧化防御失衡而引起的組織或細胞損傷狀態[5]。本研究證明RAMPSt能夠緩解Cr(Ⅵ)誘導的ROS產生,且RAMPSt緩解了Cr(Ⅵ)誘導的脂質過氧化,提高抗氧化酶GSH、SOD的活性。Cr(Ⅵ)處理誘導小鼠氧化應激,表現為過氧化物酶活性顯著降低,MDA和SOD顯著升高[6]。在小鼠試驗上,Cr(Ⅵ)可以引起小鼠腎臟組織中ROS、MDA的含量升高,GSH、SOD活性的降低,說明Cr(Ⅵ)可以引起小鼠腎組織氧化損傷,添加RAMPSt可以緩解小鼠腎組織的氧化損傷。MDA是脂質過氧化的穩定代謝物。MDA是氧化反應的主要副產物,被認為是氧化應激的有效標志物[7]。

線粒體負責許多基本的細胞功能,如新陳代謝、鈣(Ca2+)的調節、活性氧的產生和細胞凋亡的啟動。線粒體功能障礙是包括癌癥在內的許多病癥的基礎[8]。線粒體膜電位是細胞凋亡的特征性標志,由氧化應激誘導。正常的線粒體膜電位是維持線粒體氧化磷酸化和ATP產生的先決條件。ROS產生的累積負擔可導致MMP分解,進而導致能量缺乏和線粒體功能障礙[9]。試驗發現,Cr(Ⅵ)單獨處理會引起PK-15細胞線粒體膜電位的下降,誘導細胞內線粒體的損傷和功能障礙,而RAMPSt可以緩解線粒體膜電位的下降,表明RAMPSt可以緩解線粒體損傷。細胞死亡過程中激活的許多促炎途徑發生在線粒體外膜通透化過程中,這是線粒體凋亡過程中細胞死亡的關鍵點[10]。流式細胞術檢測發現Cr(Ⅵ)可以誘導PK-15發生細胞凋亡,而RAMPSt與Cr(Ⅵ)共處理后,細胞凋亡率下降。在細胞凋亡過程中,BCL-2家族蛋白通過激活BAX和BAK以及阻斷抗凋亡BCL-2成員來促進線粒體通透性[11]。蛋白質印跡分析表明,Cr(Ⅵ)誘導了細胞內凋亡相關蛋白Bax蛋白水平升高;Bcl-2蛋白水平降低,而RAMPSt減弱了線粒體凋亡通路信號蛋白的變化。caspase-3是線粒體依賴性細胞凋亡途徑中的關鍵酶和主要執行半胱天冬酶[12]。此外,Cr(Ⅵ)會誘導小鼠腎臟組織中Bax表達水平的升高和Bcl-2表達水平的降低,表明Cr(Ⅵ)誘導了小鼠腎臟細胞的凋亡,而RAMPSt可以抑制Cr(Ⅵ)誘導小鼠腎臟細胞的凋亡。細胞凋亡是細胞死亡的主要模式,受許多促凋亡基因和抗凋亡基因的調節[13]。試驗通過抗氧化劑NAC驗證了清除ROS對Cr(Ⅵ)誘導的細胞凋亡有緩解作用,RAMPSt有同樣的效果。這些結果都表明Cr(Ⅵ)能夠引起細胞凋亡及其小鼠腎損傷,而RAMPSt能夠通過清除線粒體中過量的ROS來緩解其造成的損傷作用。

綜上所述,RAMPSt通過清除過量的ROS,阻斷氧化應激介導的線粒體凋亡途徑發揮拮抗Cr(Ⅵ)致PK-15細胞和小鼠腎氧化應激及凋亡的作用。RAMPSt是一種天然活性物質,作為Cr(Ⅵ)中毒的解毒劑提供重要的理論依據。