貓冠狀病毒熒光定量PCR檢測方法的建立

陳秋陽,梁瑞英,梁 琳,湯新明,秦 彤,丁家波

(中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所,北京 100193)

貓冠狀病毒(Feline coronavirus,FCoV)是貓群中最常見感染的病原體之一。FCoVs根據生物類型分為貓腸道冠狀病毒(FECV)和貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV),FECV感染引起輕度或亞臨床消化道癥狀,持續排毒,導致貓群血清陽性率升高。FECV經基因突變演化為貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV),引起免疫介導的致命性貓傳染性腹膜炎(FIP)[1-2]。貓傳染性腹膜炎的臨床癥狀多樣,包括濕性腹膜炎,表現為胸膜腔或腹腔滲出性纖維蛋白漿膜炎;干性腹膜炎,在多個器官中出現彌散性血管周圍膿腫,使得臨床診斷變得困難。FCoV是一種有囊膜的單股正鏈 RNA病毒,基因組全長約30 kb,含有11個已確定的開放閱讀框(ORF),與犬冠狀病毒(CCoV)和豬傳染性胃腸炎病毒(TEGV)同屬于尼多病毒目、冠狀病毒科、冠狀病毒亞科、α-冠狀病毒屬的成員[3]。FCoV分為2種抗原性不同的血清型,Ⅰ型FCoV難以在細胞培養物中生長,Ⅱ型FCoV是Ⅰ型FCoV和CCoV重組的結果。2種FCoV血清型均可引起FIP,但血清學研究和最近的分子學研究證實,Ⅰ型FCoV迄今為止在全球貓種群中占主導地位[4]。

目前沒有可以快速、準確地檢測FCoV的方法,在幼齡貓發病的初期,出現輕微的腹瀉癥狀是唯一的表征。在臨床上,由于FIPV引起的癥狀和病理變化多樣,無法通過臨床癥狀和病理變化快速準確地診斷[5]。目前FIP的診斷一般采用臨床診斷和實驗室診斷相結合的方法做出綜合判斷[6],需要多種檢測方法的聯合[7]。傳統上貓傳染性腹膜炎診斷主要依賴組織病理學檢查和免疫組化檢測,目前腹腔積液檢測和病原基因檢測是FCoV檢測的常用方法。常見的診斷流程需要綜合考慮貓的品種、生活史、病史、體格檢查、臨床癥狀、影像學檢查、血常規檢查、間接免疫熒光試驗(IFA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、免疫組化、RT-PCR檢測以及組織病理學檢查。但是,ELISA相較于TaqMan熒光定量PCR方法具有靈敏度較低、成本高等缺點[8];普通 RT-PCR 具有檢測時間長、靈敏度相對較低的缺點;IFA、免疫組化及電鏡等檢測技術,對于儀器及人員的要求較高,且無法滿足大批量的臨床診斷[9]。相較于以上幾種方法,熒光定量PCR不僅具有操作簡便、成本低的優點,而且檢測時間短,可適用于基層的臨床檢測。針對病毒棘突基因(S)和非翻譯區基因(UTR)的逆轉錄聚合酶鏈式檢測方法(RT-PCR)已有報道,而核衣殼蛋白(N)基因保守,且在感染細胞中的含量較高,因此是較好的檢測基因。

FCoV是貓重要的致病性病原,臨床診斷難度大。靈敏可靠的檢測方法對該病的防控具有重要意義。本試驗建立檢測FCoV的TaqMan熒光定量PCR檢測方法,為該病毒的檢測提供特異、快速、準確的技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與病料 貓冠狀病毒、貓細小病毒(FPV)、貓杯狀病毒(FCV)、貓皰疹病毒(FHV)均由中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所動物生物安全與公共衛生防控科技創新團隊保存;75份樣本來源于全國多地寵物醫院,所有樣本于-80℃條件下保存。

1.1.2 主要試劑 FastPure?Viral DNA/RNA Mini Kit為諾唯贊產品,南京諾唯贊生物科技股份有限公司產品;Prime Star Max DNA Polymerase,TaKaRa公司產品;通用型DNA膠回收試劑盒、柱式質粒小量抽提試劑盒, OMEGA公司產品;反轉錄試劑盒,TIANGEN公司產品;EZ-Blunt Zero pTOPO II Cloning Kit、2×Real Star Fast Probe Mix,北京康潤誠業生物科技有限公司產品;DH5α感受態細胞和瓊脂糖,北京擎科生物科技有限公司產品;RNase-Free ddH2O ,北京索萊寶科技有限公司產品;Magpure病毒DNA/RNA純化試劑盒(預分裝板),杭州比格飛序生物科技有限公司產品。

1.1.3 主要儀器 凝膠成像系統,Tanon公司產品;-20℃冰箱,海爾股份有限公司產品;電泳儀、PCR儀,Bio-Rad公司產品;旋渦震蕩儀,海門市麒麟醫用儀器廠生產;細菌培養箱,上海一恒生物科技有限公司產品;超微量紫外可見分光光度計,Life Real公司產品;細菌超凈工作臺,北京亞泰科隆實驗科技開發中心產品;4℃離心機、液氮罐、二氧化碳培養箱、小型臺式離心機,生物安全柜、-80℃冰箱,Thermo公司產品;熒光定量PCR儀,西安天隆科技有限公司產品;全自動核酸提取純化儀,杭州比格飛序生物科技有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針的設計與合成 用SNAPGENE軟件對NCBI上FCoV的N基因序列進行比對,選擇保守區域設計引物及探針,由華大基因科技有限公司合成(表1)。

表1 Taqman熒光定量PCR引物及探針序列

1.2.2 質粒標準品的構建 按照諾唯贊FastPure?Viral DNA/RNA Mini Kit說明書提取病毒總RNA,參考TIANGEN反轉錄試劑盒說明書獲取病毒的cDNA,20 μL反轉錄反應體系及程序如下:4 μL 5×FastKing-RT Super Mix,16 μL RNA;反轉錄程序:42℃ 15 min,95℃ 3 min。cDNA 置于-20℃保存備用。

以反轉錄產物cDNA為模板,用FCoV-N-ZL-F和FCoV-N-ZL-R引物進行擴增,擴增片段長260 bp。擴增產物經膠回收后連接至EZ-Blunt Zero pTOPO Ⅱ Cloning Kit載體,然后轉化至DH5α感受態細胞,37℃培養12～16 h。挑取多個單菌落分別接入LB液體培養基37℃振蕩培養6～8 h。通過菌液PCR篩選含有陽性重組質粒的細菌并進行測序,選擇含有FCoV目的片段基因的菌落進行擴增,使用柱式質粒小量抽提試劑盒提取的質粒即為標準品。用分光光度計測定質粒濃度,計算其拷貝數,進行10倍梯度稀釋,置-20℃保存備用。

計算公式:拷貝數=6.02×1023(copies/mol)×[標準品濃度(ng/μL)×10-9]/標準品長度(bp)×660(Dalton/bp)。

1.2.3 熒光定量PCR檢測方法的建立

1.2.3.1 反應條件的優化 根據 2×Real Star Fast Probe Mix試劑說明書推薦的20 μL反應體系,分別對上、下游引物濃度(0.2～1.0 mol/L)、探針濃度(0.2～1.0 mol/L)、退火-延伸溫度(58～62℃) 進行優化,設置陰性對照組,通過比較Ct值、熒光強度和擴增效率來選定優化結果。

1.2.3.2 標準曲線的繪制 以100～10-9倍梯度稀釋的陽性質粒為模板,進行熒光定量PCR擴增,以標準品拷貝數的對數為X軸,Ct值為Y軸,繪制標準曲線。

1.2.3.3 特異性試驗 利用已經建立的FCoV熒光定量PCR方法對實驗室保存的FCV、FPV、FHV的核酸進行檢測,同時設置陽性對照和陰性對照,驗證該方法的特異性。

1.2.3.4 敏感性試驗 將標準品質粒進行10倍梯度連續稀釋作為模板,分別使用建立的熒光定量PCR方法和普通PCR方法進行擴增,比較二者的拷貝數檢測下限。

1.2.3.5 重復性試驗 取同一批次的3個稀釋度的標準質粒為模板進行實時熒光定量PCR擴增,并設置陰性對照組,每組設置3個平行進行重復性試驗,計算平均值,計算組內變異系數;以同樣的反應條件再分別進行3次組間重復性試驗,計算平均值,計算組間變異系數。根據變異系數判定該方法的組內及組間差異。

1.2.3.6 臨床樣品的檢測 使用全自動核酸提取純化儀提取75份臨床樣品核酸,應用已建立的FCoV熒光定量PCR方法和已發表的RT-PCR檢測方法進行比對。

2 結果

2.1 質粒標準品的構建

以FCoV cDNA為模板,用FCoV-N-ZL-F和FCoV-N-ZL-R引物進行PCR擴增,得到與預期大小相符的片段(圖1)。將膠回收產物連接至EZ-Blunt Zero pTOPO Ⅱ Cloning Kit,轉化至DH5α感受態細胞篩選出陽性重組質粒菌落送測序鑒定。選擇正確菌落擴增,用柱式質粒小量抽提試劑盒提取的質粒即為標準品。用分光光度儀測定重組質粒標準品濃度,通過計算得到拷貝數1.49×1011copies/μL,作為熒光定量PCR方法構建的質粒標準品。

M.DNA標準DL 2 000;1.目的片段

2.2 實時熒光定量PCR反應條件的優化

通過對引物、探針濃度和退火溫度的優化,以Ct值小、熒光值高為參考標準,結果表明該熒光定量PCR的最佳上、下游引物濃度為400 nmol/L,最佳探針濃度為200 nmol/L,最佳退火、延伸溫度為60℃。20 μL的熒光定量PCR反應體系中含有10 μL 2×RealStar Fast Probe Mix、0.8 μL 上游引物 FCoV-N-F、0.8 μL下游引物 FCoV-N-R、0.4 μL探針 FCoV-N-P、0.4 μL cDNA、7.6 μL RNase free H2O。反應程序:95℃ 2 min;95℃ 15 s,60℃ 30 s,共40個循環。

2.3 標準曲線的建立

用優化得到的方法,以10倍稀釋得到的濃度1.49×1011～1.49×102copies/μL的標準質粒作為模板進行熒光定量PCR擴增,繪制標準曲線(圖2)。線性回歸方程為:y=-3.137 4x+41.47,R2=0.998 1,擴增效率為108.3%,線性關系好。

圖2 FCoV的熒光定量PCR測定的標準曲線

2.4 特異性試驗

以FCV、FPV、FHV的基因組為模板,以FCoV質粒標準品為陽性對照,ddH2O為陰性對照,用優化得到的方法驗證其特異性。只有FCoV有特異性擴增,其他病原及陰性對照均無擴增曲線,表明該方法特異性好(圖3)。

1.FCoV; 2～5.FPV,FCV,FHV,RNase-free H2O作為陰性對照。

2.5 敏感性試驗

將標準質粒進行10倍梯度連續稀釋后作為模板,分別用建立的FCoV熒光定量PCR方法和普通PCR方法進行擴增。建立的熒光定量PCR方法的最低檢測極限約為1.49×100copies/μL,常規 PCR方法的最低檢測極限約為1.49×105copies/μL(圖4和圖5)。

1～12.1.49×1011～1.49×100copies/μL,13.RNase-free H2O作為陰性對照

1～12.1.49×1011～1.49×100copies/μL,13.RNase-free H2O作為陰性對照

2.6 重復性試驗

取同一批次的1.49×107、1.49×106、1.49×105copies/μL 3個拷貝數的標準質粒為模板,3個稀釋度分別設立3個重復孔進行組內重復性試驗;同樣的反應條件分別進行3次組間重復性試驗。結果組內和組間試驗Ct值的變異系數均小于3.0%,表明該方法重復性和穩定性良好(表2)。

表2 熒光定量PCR重復性試驗

2.7 臨床樣品檢測

用本試驗優化后的反應體系及程序對75份臨床樣品進行檢測,同時進行RT-PCR檢測,分別設置陽性對照和陰性對照。普通RT-PCR方法只檢出1份陽性病料,陽性率為1.33%,而本試驗建立的熒光定量PCR方法則檢出28份陽性病料,陽性率為37.33%,說明本試驗建立的熒光定量PCR方法比普通RT-PCR方法敏感性更強(表3)。

表3 熒光定量PCR和RT-PCR臨床樣本檢測結果

3 討論

FCoV在世界各地貓群中流行。FECV傳染性強,通過糞、口傳播,感染大多無癥狀或僅引起輕度、一過性腹瀉[10]。貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV)無法通過糞-口途徑傳播,但在一小部分感染貓中,FIPV由無毒力的FECV突變產生,然后引起致死性的FIP。近年來,FIP患病率逐年增加,病死率幾乎為100%[11],目前正在繼續努力尋找FIP的適當治療方法,現在比較常見的方法是用抗病毒藥物進行抑制[12],但是達到有效抑制劑量的藥物可能會有嚴重的毒副作用[13]。而由于FCoV會產生抗體依賴增強作用(ADE),一直以來對于FCoV疫苗的研發始終不順利。因此,有必要開發一種可以快速、準確地檢測FCoV的方法,以盡早檢出FCoV感染,并及時治療。

病毒分離培養法是實驗室檢測病原的金標準,該方法可以為后期病原特性研究提供重要材料并奠定試驗基礎,目前常用貓腎細胞(CRFK)或貓巨噬細胞(Fcwf-4)培養FCoV。在分離臨床樣本中FCoV時,第1代或者盲傳數代后,可觀察到細胞皺縮、變圓、脫落等細胞病變效應(CPE),但初期CPE不明顯、自然毒株對細胞系不適應、臨床樣本混合感染都會造成病毒的分離培養失敗,而且該方法花費時間較久,往往需要1～2周才可完成。而通過電鏡觀察,可直接觀察到表面有冠冕狀突起的病毒粒子,但是做電鏡要求樣本有較多的病毒粒子,該方法雖然直觀但敏感性不高,通常臨床病料中病毒粒子數量達不到電鏡觀察的要求。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)是常用的血清學診斷方法之一,有研究建立了用組氨酸標記的重組刺突蛋白檢測FCoV抗體的間接ELISA方法[8],但ELISA方法存在重復性不好,受自身抗體、嗜異性抗體等干擾易出現假陽性,干擾因素較多等問題。反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)也常被用于FCoV診斷和流行病學調查[9],很早就被用來檢測貓糞便、組織中的FCoV 。不過RT-PCR比起熒光定量PCR方法敏感性較差。染料法熒光定量PCR方法可以較為高效的診斷FCoV[14-15],但比起探針法熒光定量PCR特異性較差,有人在開發FCoV熒光定量PCR方法并嘗試應用于臨床[16]?？焖倏乖庖邔游鰴z測使用方便、快速,但是準確性較差[17]。一些新的檢測方法如重組酶聚合酶擴增熒光方法(RT-RPA)[18]和重組酶介導等溫核酸擴增(RT-RAA)[19]用于檢測FCoV。

為了進一步提高FCoV檢測靈敏度和診斷準確率,本研究選取FCoV N基因保守區片段進行引物與探針設計,在保證特異性的同時優化反應條件,構建重組質粒,建立了一種快速、靈敏、準確的TaqMan熒光定量PCR檢測方法。該檢測方法可用于檢測FCoV,根據基因序列比對,本研究選擇的FCoV序列與犬冠狀病毒(CCoV) 、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)等冠狀病毒序列具有高度一致性,也可用于這些冠狀病毒的檢測。

本研究建立的方法可對微量病毒進行檢測,對質粒DNA標準品的最低檢測下限為1.49×100copies/μL。通過特異性試驗,對貓常見病毒進行檢測,證明了該方法具備很強的特異性。本試驗通過重復性試驗和批內重復性試驗得到的變異系數均小于3.0%,顯示了該方法具有較好的重復性。

本試驗基于FCoV N基因保守區域成功建立了FCoV的TaqMan熒光定量PCR方法,為FCoV的早期檢測和流行病學調查提供了有效的技術支撐,可實現在臨床中對FCoV的全面篩查。