基于gE蛋白的羊偽狂犬病病毒間接ELISA的建立與應用

劉廣闊,吳發興,于皓同,王凱茸,張銳錚,張 琪*,許信剛*

(1.西北農林科技大學動物醫學院,陜西楊凌 712100;2.中國動物衛生與流行病學中心 國家動物血清庫,山東青島 266114)

偽狂犬病(Pseudorabies,PR)又稱為奧葉基氏病(Aujeszky disease,AD),是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的具有傳染性的病毒性疾病。自該病毒報道以來[1],距今已有210年的歷史。雖然豬是此病毒的唯一自然宿主,但其在人與其他哺乳動物中仍具有廣泛的宿主,如山羊感染PRV后常以死亡告終[2],給養羊場(戶)造成很大損失。

近年已有血清學技術及分子生物學方法用于偽狂犬病的診斷,但大部分血清學方法無法用于羊偽狂犬病的診斷,而病毒分離和分子生物學方法中的PCR、qPCR技術所需要的試驗條件在中小型養殖場難以達成。因此,開發羊偽狂犬病診斷的血清學方法非常必要。近年采用的血清學檢測方法中[3-9],間接ELISA方法因操作簡單,所依賴的試驗條件較低,并且具有較高的特異性和敏感性,在病原及抗體檢測中應用廣泛。本研究在克隆表達羊PRV gE蛋白的基礎上,獲得重組蛋白包被酶標板,建立檢測羊源PRV抗體的間接ELISA檢測方法(gE indirect ELISA,gE-iELISA),國內部分羊場用gE基因缺失疫苗對羊群進行免疫,該方法可以區分野毒感染和免疫接種動物,gE-iELISA方法填補了羊偽狂犬病血清學檢測方法的空白,為規?；驁鎏峁┝艘环N可供選擇的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 羊偽狂犬病病毒(SDPD-14)由中國動物衛生與流行病學中心國家動物血清庫(以下簡稱血清庫)鑒定、分離與保存。pET-32a(+)載體購于博邁德基因技術有限公司,DH5α感受態細胞、BL21(DE3)細胞購于天根生物科技有限公司。

1.1.2 血清樣品 羊偽狂犬病病毒標準陽性血清、羊偽狂犬病病毒抗體陰性血清、羊口瘡病毒陽性血清、羊痘病毒陽性血清由中國動物衛生與流行病學中心國家動物血清庫鑒定并保存;羊口蹄疫A型及O型病毒抗體陽性血清為北京金諾百泰生物技術有限公司試劑盒中的標準品,檢測中使用的376份山羊臨床血清樣品采自云南、陜西、山東部分地區山羊場。

1.1.3 主要試劑 DNA/RNA提取試劑盒,西安天隆科技有限公司產品;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質?？焖傩√嵩噭┖?、T4 DNA連接酶,天根生物科技有限公司產品;PrimeSTAR?HS、BamHⅠ和XhoⅠ內切酶,Takara公司產品;TMB顯色液,北京索萊寶科技有限公司產品;Ni-NTA His Bind Resin鎳柱,七海復泰生物科技有限公司產品。

1.1.4 主要儀器 NP968核酸提取儀、基因擴增熱循環儀,西安天隆科技有限公司產品;OSE-470P TGel藍光凝膠成像儀,北京天根生物科技有限公司產品;精騏恒溫振蕩器,捷美電子有限公司產品;Flash Max 850型光吸收酶標儀,閃譜生物科技有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 參考此前本實驗室對SDPD-14株的測序結果(KY398797.1),用Primer 5.0進行特異性引物的設計(表1)。

表1 gE基因引物序列

1.2.2 羊PRVgE基因擴增與重組表達載體構建 用DNA/RNA提取試劑盒與NP968核酸提取儀提取PRV SDPD-14株的基因組,以得到的DNA為模板,用1.2.1中的特異性引物進行gE基因擴增。PCR反應體系為:PrimeSTAR HS 10 μL,gE-F/gE-R各1 μL,DNA模板2 μL,用RNase-free ddH2O補足至20 μL。PCR反應程序為:95℃ 5 min;95℃ 30 s,58℃ 45 s,72℃ 1 min,30次循環;72℃延伸10 min。反應結束后經電泳判定是否得到目的條帶。膠回收目的片段后,經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切并與相同酶雙酶切的pET-32a(+)載體連接構建重組質粒。對重組質粒分別進行雙酶切鑒定和測序鑒定,將鑒定正確的重組質粒命名為pET-32a-gE。

1.2.3 重組gE蛋白誘導表達條件的優化 取1.2.2中的pET-32a-gE重組質粒10 μL轉化至BL21(DE3)感受態細胞中,通過菌液PCR篩選出陽性表達菌株,表達前先將菌株活化,按照1∶100的比例轉接于含有氨芐青霉素的液體LB培養基中,置于搖床37℃、220 r/min培養120 min測定其OD600nm值,當OD600nm值為0.6～0.8時,加入不同濃度的IPTG(使IPTG的最終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)對表達菌株進行誘導,37℃繼續培養8 h。離心收集菌體沉淀,處理后經SDS-PAGE凝膠電泳以確定最佳誘導濃度。以最佳誘導濃度在37℃下對菌液進行誘導,在2～8 h內每間隔1 h離心后收集沉淀。通過SDS-PAGE凝膠電泳結果確定最佳誘導時間。

1.2.4 重組gE蛋白的表達形式的確定及純化 參照1.2.3結果,大量誘導表達重組蛋白,誘導結束后離心并收集沉淀。將沉淀重懸后進行超聲破碎,分別將離心得到的上清液、超聲裂解后的上清液與沉淀各取30 μL,用2×蛋白上樣緩沖液進行制樣,通過SDS-PAGE凝膠電泳結果確定目的蛋白所在區間以明確重組gE蛋白的表達形式。用鎳柱對重組gE蛋白進行純化,用不同濃度尿素透析復性重組蛋白,用BCA蛋白定量方法測定重組蛋白濃度。

1.2.5 重組gE蛋白的Western blot分析 將1.2.4中復性得到的重組gE蛋白制樣后進行SDS-PAGE,將目標區域切下,在半干轉膜儀上進行轉膜。將膜取下后用5%脫脂奶粉液封閉2 h,隨后將其置1∶200稀釋的羊偽狂犬病毒陽性血清中在4℃孵育12 h,次日洗膜后用1∶10 000稀釋的HRP標記兔抗山羊IgG在室溫下孵育1.5 h,洗膜后滴加ECL發光液至膜上,棄去多余液體后進行曝光。

1.2.6 gE-iELISA檢測方法的建立、優化與應用

1.2.6.1 抗原包被量、一抗及酶標二抗稀釋度的確定 用三因素正交試驗確定最優條件,分別用1、2、4、8 μg/mL的gE蛋白包被酶標板;羊偽狂犬病毒陽性及陰性血清分別采用為1∶50、1∶100、1∶200稀釋度;HRP標記兔抗山羊IgG的稀釋比例分別為1∶2 500、1∶5 000、1∶10 000,進行間接ELISA,操作步驟參照文獻[10],根據測定結果計算P/N,將P/N最大組合確定為抗原包被量、血清和酶標抗體的最佳工作條件。

1.2.6.2 其他試驗條件的優化 在1.2.6.1中確定的最佳工作條件下,37℃分別以60、90、120 min的孵育時間對脫脂奶粉封閉時間、一抗及二抗孵育時間進行優化;以15、30、45 min進行TMB顯色時間的優化,將P/N最大組確定為最適封閉時間、孵育時間和顯色時間。

1.2.6.4 特異性試驗 在1.2.6.1及1.2.6.2中確定的最適條件下,對羊痘病毒陽性血清、羊口蹄疫病毒A型及O型陽性血清、羊口瘡病毒陽性血清進行檢測,同時以羊偽狂犬病病毒陽性血清為陽性對照,用實驗室保存的SPF山羊陰性血清作為對照,評價建立方法的特異性。

1.2.6.5 靈敏性試驗 對羊偽狂犬病病毒陽性血清分別進行1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1 024、1∶2 048、1∶4 096的稀釋,同時設置陰、陽性對照,用本研究建立的方法進行靈敏性試驗。

1.2.6.6 重復性試驗 用同批次表達純化復性的重組gE蛋白包被酶標板,對3組不同的羊偽狂犬病病毒陰、陽性血清重復檢測3次,根據結果評價批內重復性;用3組不同批次純化復性重組gE蛋白包被酶標板,分別對3組不同的羊偽狂犬病毒陰、陽性血清重復檢測3次,根據結果評價批間重復性。

1.2.6.7 臨床樣本檢測 以本研究建立的gE-iELISA方法,對血清庫保存的云南、陜西、山東部分地區羊場的376份山羊血清進行檢測,計算羊偽狂犬病病毒的陽性率,并對此檢測方法的臨床應用效果做出評價。

2 結果

2.1 gE基因的擴增及重組質粒構建

以PRV SDPD-14株的DNA為模板,通過PCR擴增gE基因,得到639 bp的基因片段(圖1),其大小與預期試驗結果一致。對構建得到的pET-32a-gE重組質粒使用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后,得到639 bp的目的條帶與約5 000 bp的載體條帶(圖2),結果與預期一致,說明重組表達載體pET-32a-gE構建成功。

M.DNA標準DL 2 000;1.gE基因擴增產物;2.陰性對照

M.DNA標準DL 5 000;1.重組載體pET-32a-gE經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切

M.蛋白分子質量標準;1.誘導的pET-32a空載體;2～6.37℃下0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mmol/L的IPTG終濃度條件下誘導8 h的重組pET-32a-gE;7.重組pET-32a-gE未誘導

M.蛋白分子質量標準;1.誘導pET-32a空載體;2-8.pET-32a-gE在BL21中誘導2、3、4、5、6、7、8 h的表達產物

M.蛋白分子質量標準;1.菌液上清;2.菌體超聲裂解液上清;3.菌體超聲裂解沉淀;4.純化gE蛋白

2.2 重組gE蛋白表達條件優化

以不同濃度的IPTG誘導重組菌株表達目的蛋白。結果顯示,當IPTG終濃度為0.6 mmol/L時,目的蛋白達到最高產量(圖3);37℃、0.6 mmol/L的IPTG終濃度下進行誘導表達,并在不同的時間收集菌體,結果顯示該目的蛋白于8 h時達到最高的表達量(圖4)。

2.3 重組gE蛋白的表達及純化

在上述最適條件下誘導表達重組蛋白,收集菌體處理后進行SDS-PAGE。結果顯示,重組gE蛋白主要在超聲裂解后沉淀中以包涵體形式大量存在,用鎳柱純化得到目的蛋白大小為42 ku(圖5)。

2.4 重組gE蛋白的Western blot鑒定

用羊PRV陽性血清作為一抗對純化后的重組gE蛋白進行Western blot分析,發現在42 ku處出現一條清晰的特異性條帶。表明重組gE蛋白可以被羊PRV陽性血清特異性識別,即具有良好的反應原性(圖6)。

M.蛋白分子質量標準;1.重組gE蛋白;2.陰性對照

2.5 最佳工作條件確定

經過三因素正交試驗可知,當重組gE蛋白的抗原包被濃度為1 μg/mL,血清以1∶100比例稀釋,酶標二抗以1∶10 000比例稀釋時P/N最高,將其確定為最佳工作條件(表2)。

表2 抗原包被濃度、血清及酶標抗體稀釋比例的確定

2.6 其他優化條件結果

在確定的最佳工作條件下進行試驗,在37℃下進行其他條件的優化,結果顯示封閉效果最優為5%脫脂奶粉封閉60 min,樣品最佳孵育時間為60 min,HRP標記兔抗山羊酶標抗體最適孵育時間為60 min,TMB最佳顯色時間為30 min。

2.7 陰陽性臨界值的確定

2.8 特異性試驗結果

用確定的最適條件,對羊痘病毒、羊口蹄疫A型及O型病毒、羊口瘡病毒陽性血清進行檢測,并以羊偽狂犬病毒抗體陽性血清為陽性對照,羊偽狂犬病毒抗體陰性血清為陰性對照。結果顯示,陰陽性對照成立,其余血清OD450 nm值均小于0.284,為PRV抗體陰性,證明所建立的PRV gE-iELISA方法具有良好的特異性。

2.9 靈敏性試驗結果

對羊偽狂犬病毒陽性血清分別以1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1 024、1∶2 048、1∶4 096比例稀釋,同時設置陰陽性對照進行檢測。結果顯示,在陰陽性對照成立的前提下,當羊偽狂犬病毒陽性血清稀釋至1∶2 048時,OD450 nm值為0.293,仍大于臨界值,表明建立的方法具有較好的靈敏性。

2.10 重復性試驗結果

用確定的最適條件,分別進行批內試驗(變異系數為2.45%～5.00%)和批間試驗(變異系數為2.55%～7.41%),變異系數均不超過10%,表明此方法重復性良好。

2.11 臨床樣本檢測結果

用本試驗建立的方法,對采自云南、陜西、山東部分地區羊場的376份山羊血清樣本進行檢測,其中40份血清呈羊偽狂犬病毒陽性,陽性率為10.6%。

3 討論

2011年新出現的PRV變異株[11],使PR在Bartha-K61株弱毒疫苗免疫過的動物中重新暴發[12],PRV變異株對易感動物和人類的毒力比經典株更強[13],本研究建立的gE-iELISA方法對于目前缺乏相應檢測手段的小型羊場有重要意義。偽狂犬病毒gE蛋白的主要抗原區集中在52-238位氨基酸[14]。本研究以此為依據,設計構建原核表達重組載體的引物,對gE蛋白的主要抗原區域進行表達,以保證其在用于包被抗原時具有較高的準確性。用鎳柱對表達的重組gE蛋白進行純化,并進行Western blot試驗,結果表明重組gE蛋白具有良好的反應原性,可以作為診斷抗原用于酶標板的包被。

此前已在病死山羊的腦組織及肺臟組織中分離到偽狂犬病毒[15],雖然接種了偽狂犬病病毒活疫苗(Bartha-K61),但疫苗的安全性無法得到保障,有關于注射疫苗后導致羊死亡的報道[18],說明該病在羊群中的防控仍以病毒的及時檢出為主。人也可感染偽狂犬病病毒,可引起神經癥狀,如眼內炎和腦炎,人類對本病的感染多是由于體表存在傷口。

本研究建立的gE-iELISA方法對云南、陜西、山東部分羊場收集到的376份山羊血清檢測,PRV陽性率為10.6%,此數值比2008年青海省的4.65%有所升高[16],說明偽狂犬病病毒在羊群中的感染率呈上升趨勢,應予以足夠重視。