表達IFN-α的重組豬繁殖與呼吸綜合病毒的構建及生物學特性分析

黃 靜,王玉旭,王 豪,陳 櫻,2,3,4,歐陽康,2,3,4,黃偉堅,2,3,4,黃穩妃,韋祖樟,2,3,4*

(1.廣西大學動物科學技術學院動物傳染病與分子免疫學實驗室,廣西南寧 530005; 2.廣西壯族自治區獸用生物制品工程研究中心,廣西南寧 530005; 3.廣西畜禽繁育與疾病防控重點實驗室,廣西南寧 530004; 4.廣西高校動物疫病預防與控制重點實驗室,廣西南寧 530005; 5.廣西農業職業技術大學動物科學技術系,廣西南寧 530007)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是影響養豬業的重要疾病之一[1],該病還會產生免疫抑制,繼發其他細菌和病毒感染[2],對養豬業造成極大的影響。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)顆粒呈圓球形,平均大小約為60 nm,為單股正鏈RNA病毒[3],全長約為15 kb,全基因組包含ORF1a、ORF1b、ORF2a及2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF5a、ORF6和ORF7等至少10個開放閱讀框(ORF)以及5′端和3′端的非編碼區[4],其中ORF1a和ORF1b編碼RNA依賴性RNA聚合酶等至少14個非結構蛋白,這些蛋白具有復制酶和蛋白水解酶功能,負責病毒基因組RNA的復制和亞基因組mRNA以及拮抗干擾素(interferons,IFNs)的產生。其中由ORF2-7編碼的為結構蛋白。PRRSV病毒感染豬體后可長期存在于體內,實現持續性感染,并且PRRSV感染后期會引起靶細胞凋零壞死,破壞豬肺泡巨噬細胞(porcine alveolar macrophages,PAM)。豬體感染病毒后會抑制Ⅰ型干擾素的表達[5],引起免疫抑制,豬接種PRRSV活疫苗3～4周后才能產生細胞免疫應答和中和抗體,但中和抗體滴度不高[6],這些現象為PRRSV的防控帶來了巨大的挑戰。

干擾素(interferon,IFN)是一類具有免疫調節功能和抗病毒作用的細胞因子[7],能與細胞表面的受體結合進而啟動JAK-STAT信號通路,誘導轉錄大量ISGs,能夠起到抗病毒作用。IFN根據細胞表面受體等差異將其分為三大類[8],其中Ⅰ型的抗病毒活性最強,而豬的Ⅰ型IFN包含了17個IFN-α亞型,除了抗病毒作用外能夠調節宿主的先天性和適應性免疫反應。外源性Ⅰ型IFN可增加抗病毒活性,已成功構建在PRRSV全長cDNA感染性克隆pGXAM[9],并在ORF1b和ORF2a之間插入兩個限制性酶切位點BstB Ⅰ和SbfⅠ,以及轉錄調控序列TRS6[10]。本研究擬通過將豬Ⅰ型干擾素IFN-α插入PRRSV基因組中,以期獲得能夠表達IFN-α的重組PRRSV,為進一步研發能有效刺激產生免疫應答的PRRSV疫苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細胞、質粒 本研究用的PRRSV感染性克隆質粒為本實驗室保存[9],Marc-145細胞、PK-15細胞和PAM細胞由廣西大學動物科學技術學院動物傳染病與分子免疫學實驗室分離保存。

1.1.2 主要試劑 引物由北京擎科生物科技有限公司合成;prime star Max DNA polymerase、T4 DNA ligase、TaqMix、dNTP、Mixture、RNase inhibitor、M-MLV、Gel extraction kit、Cycle pure kit,美國OMEGA公司產品;Axy Prep體液病毒DNA/RNA小量制備試劑盒、細胞總RNA的提取試劑盒,愛思進生物技術(杭州)有限公司產品;內切酶BstBⅠ、SbfⅠ,紐英倫生物技術(北京)有限公司產品;Trans Script?Green one-step RT-qPCR superMix、Trans5α chemically competent cell,北京全式金生物公司產品;新生胎牛血清、DMEM、MEM,GIBCO公司產品;BSA,碧云天公司產品。

1.1.3 主要儀器設備 PCR儀、細菌恒溫培養箱、細胞恒溫培養箱及熒光倒置顯微鏡,Thermo公司產品;恒溫水浴鍋,邦西儀器科技有限公司產品;離心機,Eppendorf公司產品;無菌操作臺,蘇州安泰空氣技術有限公司產品;瓊脂糖凝膠電泳儀,北京六一生物科技有限公司產品;凝膠成像儀,Bio-Rad公司產品;倒置顯微鏡,Nikon公司產品;羅氏96定量PCR儀,羅氏公司產品。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 參考GenBank上發表的豬源IFN-α基因序列和本實驗室pGXAM序列,用Primer premier 5.0設計特異性引物,送南寧擎科生物有限公司合成(表1),表1中下劃線為限制性酶切位點。

表1 本研究使用的引物

1.2.2 目的基因擴增 抽提PK-15細胞的RNA,以該RNA為模板克隆P-IFN-α目的基因。分別設計上游引物P-IFN-α-BstB I-F和下游引物P-IFN-α-SbfI-R,用細胞總RNA的抽提盒提取PK-15細胞的RNA,并用42℃、1 h的RT反應程序對該模板進行反轉錄獲得cDNA。用以下PCR反應程序:94℃ 3 min;98℃ 10 s,56℃ 5 s,72℃ 6 s,共計35個循環;72℃ 10 min,以獲得的cDNA為模板擴增目的基因P-IFN-α,用瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR產物并進行膠回收。

1.2.3 重組質粒的構建 以pGXAM為載體,在ORF1b和ORF2a之間插入目的基因P-IFN-α。pGXAM載體以及目的基因的膠回收產物用限制性內切酶BstB I和SbfI進行酶切,并對酶切產物進行回收。用T4連接酶將酶切回收后的目的基因和載體置于16℃過夜連接,反應體系為T4 DNA Ligase 1 μL,pGXAM 1 μL,P-IFN-α 7 μL。連接產物轉化大腸埃希菌DH5α感受態細胞,轉化產物涂布于含Amp抗性的LA平板上,37℃培養12～16 h。從平板上挑取單個菌于LB培養基中培養16 h,抽提質粒,并用BstB I和SbfI對質粒進行酶切鑒定,將鑒定正確的質粒送上海生工生物公司進行測序。

1.2.4 病毒的拯救和鑒定 將BHK-21細胞鋪至6孔板中,待細胞生長至80%匯合度時將鑒定正確的質粒轉染至BHK-21細胞中,加入含2%血清的DMEM培養基進行培養,細胞置體積分數為5%的CO2箱中37℃培養,48 h后將細胞上清接至鋪好的Marc-145細胞的6孔板上,盲傳3代后對細胞上清液用引物TF11804和PR12186對產物進行RT-PCR鑒定,PCR反應體系為:94℃ 3 min;98℃ 10 s,56℃ 5 s,72℃ 6 s,共計35個循環;72℃ 10 min。

1.2.4 重組病毒的間接免疫熒光鑒定 Marc-145細胞接種至6孔板中,細胞達到90%匯合時將P3代重組病毒rGXAM-P-IFN-α以及P3代的親本rGXAM感染至Marc-145細胞,同時設置陰性對照組,觀察細胞直至出現明顯CPE后即可進行間接免疫熒光實驗。按照1 mL/孔加入冰甲醇固定細胞,4℃固定30 min后棄去冰甲醇并用PBS清洗3次,每孔加入1%牛血清蛋白(BSA)置于室溫封閉30 min。PBS清洗3次,稀釋比例為1∶2 000的PRRSV N蛋白單克隆抗體SDOW作為一抗,37℃孵育2 h。PBS清洗5次,Alexa Fluor 568標記的山羊抗鼠IgG(H+L)作為二抗,稀釋比例為1∶500,37℃避光孵育1 h。PBS清洗5次至二抗充分洗滌干凈后,每孔加入500 μL DAPI染液孵育5 min,清洗2次后置于熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.2.5 重組病毒的生長曲線 將Marc-145細胞接種至96孔細胞板中,細胞生長至90%匯合度時,取100 μL成功拯救的P3代重組病毒rGXAM-P-IFN-α以及P3代的親本rGXAM,用含血清2%的MEM培養基按照10倍倍比稀釋至10-7,并在每孔加入100 μL的病毒稀釋液,用含血清2%的MEM培養基作為陰性對照,置于37℃、體積分數為5%CO2培養箱中進行培養。連續觀察細胞孔內CPE情況,直至不再出現CPE后,使用Reed-Muench法計算病毒的TCID50。Marc-145細胞鋪至12孔細胞板中,細胞生長至80%時,按照每孔細胞數和病毒的TCID50計算0.01 MOI所需的病毒量,將rGXAM-P-IFN-α-P3,rGXAM-P3感染至Marc-145細胞,每個病毒重復3個細胞孔,將細胞板放至培養箱中培養,定點收取12、24、36、48、60、72、96 h的病毒液,并對不同時間點收取的病毒液進行TCID50的測定,計算病毒滴度(lg TCID50/mL),用GraphPad Prism 8.0進行生長曲線的繪制。

1.2.6 重組病毒的穩定性鑒定 將鑒定陽性的細胞培養物上清接種于Marc-145細胞,培養9代,并使用檢測ORF1b與ORF2a之間的外源基因的TF11804/PR12186引物對P3、P6、P9代的細胞上清液進行RT-PCR鑒定。

1.2.7 抗病毒蛋白的測定 將PAM細胞培養于12孔板中,待細胞長至80%左右匯合度時,將rGXAM-P-IFN-α-P3和rGXAM-P3根據0.1 MOI病毒感染量感染PAM細胞,并設立陰性對照組。感染后12 h、24 h收取細胞,于-80℃保存。重復3次。病毒誘導PAM細胞表達的PKR、ISG-15、ISG-54蛋白基因由RT-qPCR檢測,熒光定量PCR引物和看家基因GAPDH為引物(表2)應用Roche LightCycler 96定量PCR儀檢測抗病毒蛋白相對表達量。每個樣本3次重復,并用2-ΔΔCt法計算結果。

表2 本研究使用的qPCR引物

2 結果

2.1 目的基因的擴增

通過PCR擴增出PK-15細胞的IFN-α片段,擴增出570 bp的條帶(圖1),結果符合預期。

2.2 重組質粒的構建與鑒定

將克隆擴增出的P-IFN-α片段克隆至載體pGXAM中,獲得重組質粒pGXAM-P-IFN-α。用BstB I和SbfI對重組質粒進行雙酶切鑒定(圖2),除載體片段外,還切出約600 bp的片段,與預期大小相符,將重組質粒送上海生工生物工程有限公司測序,結果顯示插入的片段為IFN-α。

M.DNA標準DL 15 000 ; 1.重組質粒pGXAM-P-IFN-α的BstB I和Sbf I雙酶切

2.3 病毒的拯救與和間接免疫熒光鑒定

將構建成功的重組質粒轉染至BHK-21細胞,在Marc-145細胞上盲傳3代,觀察Marc-145細胞上出現的CPE,收取細胞上清進行RT-PCR鑒定,結果顯示拯救成功。P3代重組病毒感染Marc-145細胞,固定細胞進行間接免疫熒光鑒定(圖3),感染rGXAM-P-IFN-α和rGXAM細胞中可觀察到明顯的綠色熒光,而未感染病毒的細胞無熒光,表明rGXAM-P-IFN-α拯救成功。

A1～A2.rGXAM感染Marc-145細胞;B1～B2.rGXAM-P-IFN-α感染Marc-145細胞;C1～C2.Marc-145細胞

2.4 病毒的生長曲線

對重組病毒的P3代進行TCID50測定,按照Reed-Muench法計算出病毒滴度(表2)。將P3代病毒rGXAM和rGXAM-P-IFN-α根據0.01 MOI的感染量感染Marc-145細胞,收取12、24、36、48、60、72、84、96 h的病毒上清,根據各毒株各時間點的病毒滴度進行生長曲線的繪制(圖4),感染36 h后,重組病毒每個時間點產生的感染性病毒低于親本病毒,72 h時rGXAM-P-IFN-α病毒滴度最高,親本病毒rGXAM的病毒滴度84 h最高。

圖4 拯救病毒的生長曲線

2.5 重組病毒的遺傳穩定性

將拯救成功的重組病毒在Marc-145細胞上進行連續傳代,根據引物TF11804/PR12186對P3、P6、P9代的重組病毒針對ORF1b和ORF2a之間插入的目的基因進行RT-PCR鑒定,并以rGXAM和pGXAM-P-IFN-α為對照(圖5),重組病毒無明顯缺失,可穩定傳至P9代,回收重組病毒克隆至pMD18-T,對陽性菌液進行測序,至P9代重組病毒均能穩定遺傳。

M.DNA標準DL 2 000 ;1.rGXAM-P-IFN-α-P3;2.rGXAM-P-IFN-α-P6;3.rGXAM-P-IFN-α-P9;4.陰性對照;5.rGXAM;6.pGXAM-P-IFN-α

圖6 rGXAM-P-IFN-α的氨基酸比對結果

圖7 PAMs被感染12 h、24 h后PKR、ISG-15和ISG-54的轉錄水平

2.6 抗病毒蛋白的表達

拯救成功的重組病毒感染PAM細胞,病毒誘導PAM細胞表達PKR、ISG-15、ISG-54蛋白基因由RT-qPCR檢測。PAMs分別被rGXAM-P-IFN-α或親本株rGXAM感染,未感染的PAMs作為對照,在感染后在12 h和24 h時收取細胞總RNA。用實時RT-PCR定量檢測PKR、ISG-15、ISG-54的轉錄水平。用2-△△Ct計算結果顯示,與未感染的對照組相比,抗病毒基因mRNA水平發生了成倍的變化(*P<0.05; **P<0.01;***P<0.001;****P<0.0001)。

3 討論

本研究成功構建了以豬繁殖與呼吸綜合征病毒為載體表達豬Ⅰ型干擾素α的質粒,并成功拯救出重組病毒rGXAM-P-IFN-α,該病毒在Marc-145細胞上能穩定遺傳至P9代。對重組病毒的生長特性進行分析發現,rGXAM-P-IFN-α在36 h前與親本病毒rGXAM有著相似的生長特性,36 h后rGXAM-P-IFN-α復制緩慢,病毒滴度顯著低于rGXAM,可能由于rGXAM-P-IFN-α病毒中IFN-α開始表達并刺激下游的抗病毒蛋白的產生,抑制PRRSV的復制。將rGXAM-P-IFN-α感染PAM細胞后的結果也證明了這一推測,對感染重組病毒PAM細胞中的抗病毒蛋白進行定量分析,發現重組病毒rGXAM-P-IFN-α可上調IFN-α下游的PKR、ISG-15和ISG-54的轉錄水平,表明外源插入的IFN-α可以調節IFN信號通路,促進PAM細胞的抗病毒狀態,限制病毒的復制[11]。本研究成功構建了以PRRSV為載體表達Ⅰ型α干擾素的重組病毒,為后續研制具有免疫調節作用的新型PRRSV疫苗奠定基礎。