20味中藥體外抑制奇異變形桿菌的研究

馮玉樹,李貴琴,李冰慧,李勤凡,王 妍

(西北農林科技大學動物醫學院,陜西楊凌 712100)

奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)為無莢膜、無芽孢、有鞭毛和有菌毛的革蘭氏陰性桿菌,廣泛分布于自然界、動物腸道、糞便[1]。是一種重要的條件致病菌,可感染人[2]、牛[3]、犬[4]、雞[5]等,能夠引起食物中毒、尿路感染、腹瀉、肺炎、敗血癥等多種疾病。近年來奇異變形桿菌引起的人畜疾病屢見不鮮,對牛養殖業造成的損失也日益突出。由奇異變形桿菌引發的犢牛腹瀉病案例逐年增多[6-7],主要癥狀為腹瀉、脫水、敗血癥等、嚴重者死亡,同時感染的動物也可成為人類變形桿菌感染的潛在來源。為避免抗生素不合理使用導致的菌株耐藥性增強,迫切需要探究合理的用藥方案來控制此類疾病的發生。近年來針對變形桿菌的中藥抑菌研究頗多[8-9],但均是對單味藥進行研究,中藥聯合抑菌方面的研究較少。為尋找合理的中獸藥抗菌方案,本試驗選擇20味先前報道有抑菌作用的中藥,探究對奇異變形桿菌的抑菌作用,篩選抑菌效果較好的中藥,分析其不同組合的聯合抑菌效果,以期為感染奇異變形桿菌的動物臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和培養基 菌種由寧夏某牛場犢牛腹瀉樣本分離到并經鑒定為奇異變形桿菌,由本實驗室保藏。M-H肉湯培養基,海博生物技術有限公司產品;瓊脂粉、營養肉湯培養基,北京奧博星生物技術有限公司產品。

1.1.2 中藥材 薄荷、厚樸、艾葉、香附、黃連、連翹、桂枝、金銀花、青蒿、半枝蓮、丁香、知母、黃芩、穿心蓮、訶子、肉豆蔻、蘆薈、石榴皮、五倍子、魚腥草,購于陜西華仁堂大藥房。

1.1.3 主要儀器 高壓蒸汽滅菌鍋LS35HG,江陰濱江醫療設備有限公司產品;恒溫搖床100B,上海世平實驗設備有限公司產品;恒溫培養箱MJP150,上海精宏實驗設備有限公司產品;旋轉蒸發儀RE-52AA,上海亞榮生化儀器廠產品;循環水多用真空泵SHB-B,鄭州長城科工貿有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 中藥提取物的制備 取20 g中藥打磨成粉,加入10倍體積去離子水,浸泡過夜,大火煮沸之后文火煮1 h,減壓過濾,回收濾液,殘渣加入5倍體積去離子水煮沸之后文火煮30 min,減壓過濾,合并2次濾液旋轉蒸發濃縮至20 mL(中藥濃度1 g/mL)。

1.2.2 中藥提取物對奇異變形桿菌的MIC和MBC測定 采用微量二倍稀釋法進行測定。將MH培養基加入96孔板,對藥液進行稀釋,加入同體積載菌量為1×106CFU/mL的奇異變形桿菌菌液。平行對照3個,并設陽性對照、空白對照,37℃培養24 h。每孔避光加入10 μL濃度為0.2 mg/mL的碘硝基四唑紫指示劑,繼續培養30 min,眼觀無菌生長的最低濃度即為MIC值。將上述澄清透明液體各孔吸出0.1 mL,均勻涂抹于營養瓊脂平板,37℃培養24 h,未長菌的平板上所涂原液濃度為藥物的MBC,試驗重復3次。當MIC<7.80 mg/mL為高度敏感;7.80 mg/mL≤MIC≤250 mg/mL為中度敏感;MIC>250 mg/mL為不敏感。

1.2.3 棋盤法聯合抑菌試驗 選取1.2.2中抑菌效果好的中藥提取物,采用棋盤稀釋法檢測兩兩聯合用藥對奇異變形桿菌的抑制效果。菌液濃度為1×106CFU/mL,各藥物終濃度梯度為4、2、1、1/2、1/4、1/8 MIC,并設陽性對照、空白對照,37℃培養24 h。每孔避光加入10 μL濃度為0.2 mg/mL的碘硝基四唑紫指示劑,繼續培養30 min,觀察各孔細菌生長情況。所有試驗重復3次。

計算聯合抑菌指數(FIC):FIC指數= MICA藥聯用/MICA藥單用+ MICB藥聯用/MICB藥單用,FIC指數<0.5為協同作用,FIC指數0.5～1.0 為相加作用,FIC指數1.0～2.0為無關作用,FIC指數>2.0為拮抗作用。

1.2.4 時間殺菌曲線的測定及繪制 選取1.2.3中的中藥組合進行聯合效果確證試驗,設計不同藥物組合測定其對奇異變形桿菌的時間-殺菌曲線。將配制好的濃度為2×105CFU/mL菌懸液分別加于同體積藥液中,使菌懸液終濃度為1×105CFU/mL?；靹蚝蠓湃?7℃搖床內培養,并設陽性對照、空白對照。分別于0、2、4、6、8、12、24 h吸取培養液,用無菌0.9%氯化鈉溶液進行10倍梯度稀釋,選取合適稀釋度菌懸液,50 μL涂布于營養瓊脂平板上,37℃培養24 h后進行菌落計數,所有試驗重復3次。取平均數的對數繪制出時間殺菌曲線,根據菌落計數判斷抑菌效應。培養24 h后,聯合用藥的與單用藥效果最好的相比,如果降低≥2 Log10CFU/mL則認為協同作用;降低1～2 Log10CFU/mL,則認為相加作用;降低<1 Log10CFU/mL則認為無關作用;增加≥2 Log10CFU/mL,則認為拮抗作用[10]。

2 結果

2.1 中藥提取物對奇異變形桿菌的體外抑菌效果

不同中藥提取物的抑菌活性差異較大(表1),根據MIC值可以判定訶子、薄荷、黃連、艾葉、知母、金銀花、五倍子7種中藥提取物有較好抑菌效果。其中訶子水提物對奇異變形桿菌的抑制效果為高度敏感,其余6種中藥為中度敏感。選取這7味藥進行聯合抑菌試驗,進一步篩選表現協同作用的中藥組合。

表1 20味中藥對奇異變形桿菌的抑菌效果

2.2 中藥提取物對奇異變形桿菌的體外聯合抑菌活性

選取對奇異變形桿菌高敏的訶子與中度敏感的6種藥物兩兩組合,對奇異變形桿菌的體外抑菌活性如圖1。其中訶子和薄荷組合FIC值為0.31,表現為協同作用;訶子和黃連、訶子和金銀花、訶子和艾葉、訶子和五倍子的FIC值分別為0.56、0.56、0.75、0.56,表現為相加作用;訶子和知母的FIC值為1.13,表現為無關作用。

2.3 訶子、薄荷單用和聯用對奇異變形桿菌殺菌效果

將培養基中加有不同中藥提取物的奇異變形桿菌培養24 h,分別于0、2、4、6、8、12、24 h吸出部分菌液計算濃度、繪制曲線(圖2),培養24 h時,各單獨給藥組的細菌載量相對于陽性對照組減少1.9～12.2 Log10CFU/mL,表示7種藥物都對奇異變形桿菌的生長有不同程度的抑制作用。其中訶子和知母聯用組效果較好單藥訶子組菌落數升高約1.8 Log10CFU/mL,表現無關作用(圖2A);訶子和薄荷聯用組比效果較好單藥薄荷組菌落數降低約4 Log10CFU/mL,表現為協同作用(圖2B)。其余4組訶子和艾葉聯用組、訶子和金銀花聯用組、訶子和黃連聯用組、訶子和五倍子聯用組比最強單藥組菌落數減少約1～2 Log10CFU/mL,表現為相加作用(圖2C～F)。其中五倍子和訶子聯用組于接種后8 h時,菌落數降為0,表示兩藥聯用能發揮很好的殺菌作用(圖2F)。

圖2 不同中藥提取物組合的對奇異變形桿菌的時間-殺菌曲線

3 討論

隨著奇異變形桿菌性腹瀉發生率的持續增高[6-7],病原菌的耐藥性增強和抗生素殘留問題日益嚴重,使得“減抗、替抗”成為主流新藥研發方向。而大多數中藥有效提取物對細菌、病毒、寄生蟲等病原都有廣泛的抑制作用,使其逐步應用于臨床感染性疾病的治療。

為尋找抑制奇異變形桿菌生長的高效中藥,本試驗選取了20味中藥,通過體外抑菌試驗,從中篩選出訶子、薄荷、黃連、艾葉、知母、金銀花、五倍子7味藥對奇異變形桿菌的抑制作用較強,體外抑菌能力明顯優于其他中藥。其中訶子的抑菌效果最好,MIC值達到3.9 mg/mL,與訶子對大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌的抑菌效果8.51～8.61 mg/mL有差異[11],可能為不同產地和批次的中藥材所含有效抑菌物質量不同,或者藥物對不同菌株的抑菌能力不同有關。

本試驗對這7味中藥提取物進行聯合抑菌試驗分析,通過棋盤法和繪制時間-殺菌曲線兩種方法,證明了訶子和薄荷提取物的聯合抑菌效果表現為協同作用;訶子和黃連、訶子和金銀花、訶子和艾葉、訶子和五倍子表現為相加作用;訶子和知母表現為無關作用。其中訶子和五倍子組合在8 h內完全殺菌,在幾種聯用組合中效果最好。訶子與石榴皮、訶子與抗生素聯用都有協同效果[12-13],訶子與薄荷聯用具有互相增強的作用,可以適當減少用量節約成本。訶子提取物的主要抑菌成分為多酚類、三萜類、訶子酸等[14];薄荷提取物的主要抑菌成分為黃酮、萜類等[15]。但具體是哪種物質之間的相互作用使藥物對奇異變形桿菌生長的抑制作用增強還需進一步研究。

本試驗用牛源腹瀉樣本中分離鑒定的奇異變形桿菌進行中藥抑菌試驗,從中選出效果較好的中藥,進行組合測定體外聯合抑菌效果,為訶子、薄荷、五倍子等聯合用藥的進一步研究提供了資料。