芒柄花黃素通過DRP1-NLRP3信號通路緩解過敏性哮喘的作用機制

陳 牧,白巧云,宋藝蘭,陳 嬌,金永德,延光海

(1.吉林省過敏性常見疾病免疫與靶向研究重點實驗室,2.延邊大學附屬醫院耳鼻咽喉科,3.延邊大學醫學院解剖學教研室,吉林 延吉 133002)

哮喘是一種以氣道高反應性和慢性氣道炎癥為特征的常見慢性疾病,全球有3.58億患者。哮喘的病理特征包括黏液產生過多、氣道阻塞和炎性細胞浸潤增加[1]。氧化應激和炎癥反應與哮喘密切相關,線粒體功能障礙和ROS過量產生導致的氧化應激是關鍵因素。因此,我們認為維持線粒體功能和體內平衡以及下調炎癥反應是改善哮喘的有效措施。

線粒體功能障礙影響活性氧的釋放,引起炎癥。過量的ROS會導致氧化應激損害細胞和組織,導致呼吸道不良。顆粒物(particulate matter, PM)暴露導致哮喘疾病中線粒體抗氧化酶Mn-SOD和OPA-1降低、炎癥標志物NLRP3和IL-1β升高,及線粒體裂變蛋白DRP1增加[2]。眾所周知,過多ROS的產生最終將導致線粒體生物能量失衡[3]。研究表明,LPS刺激增強 DRP1 依賴的線粒體 ROS 的產生,促進了 mtDNA 滲漏到細胞質中,激活Kupffer 細胞中STING信號[4]。在蟑螂變應原誘導的哮喘中,芳香烴受體通過抑制ROS觸發的NLRP3炎癥小體來保護氣道Muc5ac生成[5]。TNF-α誘導的氣道平滑肌(ASM)活性增加后,ROS產生增加,激活多種應答途徑,包括pIRE1α/XBP1s信號通路和相關的細胞因子表達改變,導致線粒體功能失調[6]。已知卵清蛋白在呼吸系統疾病中可激活NLRP3炎癥小體,誘發caspase-1激活及促炎因子釋放[7]。因此,ROS的清除與DRP1介導的線粒體裂變的抑制,對改善哮喘氣道炎癥極為重要。

芒柄花黃素(formononetin, FN)是黃芪中提取的生物活性異黃酮,具有抗炎抗氧化作用[8]。研究表明,FN可以通過降低 ROS 的水平和抑制細胞凋亡來減輕 H2O2誘導的細胞死亡[8]。FN 抑制肥大細胞脫顆粒以緩解化合物48/80誘導的假過敏反應[9]。報告指出,FN可減緩皮層神經元炎癥,保護大鼠腦損傷后的神經功能[10]。

然而,FN在哮喘中能否維持線粒體穩態仍然不清楚。在此,本研究旨在闡明FN是否通過DRP1-NLRP3途徑緩解哮喘氣道炎癥,為臨床靶向用藥提供基礎研究。

1 材料與方法

1.1 動物無特定病原體(SPF)級雌性BALB/c小鼠50只,20～22 g,8周齡,購自延邊大學健康科學中心飼養部(中國延吉動物許可證[JI]2020-00093)。所有小鼠均在無特定病原體、溫度(22±2)℃、相對濕度50%～60%、提供嚴格滅菌的水和食物及12 h光照和夜間循環條件下飼養。實驗中所有操作規程均符合《實驗動物管理條例》,并經延邊大學醫學院倫理委員會批準,批準文號(SYXK(JI)2020-0009)。

1.2 哮喘小鼠模型的建立及分組雌性BALB/c小鼠共50只,每組10只共5組：分別為對照(Control)、OVA(Model)、FN(劑量為20 mg·kg-1、40 mg·kg-1)和地塞米松(Dex,劑量為5 mg·kg-1)組(n=10)。哮喘模型的建立,在第0、7和14天將溶于在300 μL生理鹽水中的25 μg OVA和2 mg氫氧化鋁佐劑通過腹膜內(ip)注射使小鼠致敏。對照組小鼠注射等劑量的生理鹽水。最后一次OVA致敏一周后(第21天),OVA組小鼠每天接受含100 μg OVA的20 μL PBS溶液霧化激發,FN組和Dex組激發前30 min分別經口灌胃FN溶液或注射Dex。FN(THT011-20 mg),分子量268.26,純度 ≥ 98%,購自上海融禾醫藥科技發展有限公司。FN溶液的制備,將FN溶于生理鹽水中,并用鹽水稀釋。Control組給予等量生理鹽水。

1.3 樣本采集和處理小鼠最后一次激發(4周)后,收集眼眶后靜脈叢血液并離心(1 000×g,10 min)獲得血清。然后采集支氣管肺泡灌洗液(BALF),將BALF細胞在4 ℃下以400×g離心10 min。在-80 ℃儲存上清液以待下一步的細胞因子測定。收集左肺組織固定,用于之后病理及組織學分析,其他右肺組織儲存于-80 ℃,以待進一步的蛋白分析。

1.4 組織學分析肺組織切片(n=6)用蘇木精和伊紅 (HE, # G1120, Solarbio) 染色,用于炎性細胞分析。進行Masson染色(# G1340,Solarbio)以評價氣道周圍膠原沉積。掃描藍色的膠原纖維所占面積,并統計膠原沉積所占百分比。分別測量支氣管平滑肌層厚度(Md)、支氣管基底膜周徑(Pbm)、支氣管管壁厚度(Wd)和平滑肌層面積(WAm)以及管壁總面積(WAt)。其結果將各標本組織基底膜周徑(Pbm)進行統一標準化。對于DRP1的免疫組織化學分析,首先將石蠟包埋的肺組織脫蠟水化,用檸檬酸鹽抗原修復,然后用3%的H2O2在室溫下孵育10 min,再用5%的山羊血清封閉在室溫下孵育15 min,沖洗后,用兔DRP1 (# DF7037, 1 ∶200, Affinity) 抗體孵育肺切片,然后用山羊抗兔IgG H&L(HRP) (# 6721, 1 ∶2 000; Abcam) 孵育。再使用光學顯微鏡 (Eclipse Ni-U, Nikon)采集圖像。

1.5 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)BALF上清液中細胞因子,血清IgE采用ELISA(R&D Systems, Minneapolis)法進行,IL-4、IL-13、IL-5和IgE的靈敏度為2.0 ng·L-1。SOD、CAT活性和MDA的含量也采用ELISA法,按照使用說明書進行檢測。

1.6 ROS檢測為了檢測細胞中的總ROS,BEAS-2B細胞與DCFH-DA (10 μm·L-1, # S0033S,碧云天) 在37 ℃孵育30 min。最后,通過 Cytation 5 (BioTek) 觀察熒光,并使用 ImageJ 軟件 (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) 進行分析。

1.7 Western blot檢測按常規方法提取蛋白,BCA定量檢測蛋白濃度,蛋白變性處理,配制SDS-PAGE分離電泳膠,上樣20 μg蛋白,樣品轉到PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉1 h,與一抗4 ℃過夜。p-DRP1(# DF2980)、DRP1(# DF7037),MFN1(# DF7543)、MFN2(# DF8106)購自Affinity; NLRP3(A126974),Caspase-1(# A0964)購自ABclonal;IL-1β(12242s),GAPDH(#2118S)購自CST。使用二抗為山羊抗兔抗體(# 5151,CST)并與它在室溫下(25 ℃)孵育2 h。PVDF膜用顯影液顯影。通過Quantity One (BioRad, Hercules, CA, USA)計算蛋白水平。

1.8 細胞培養和處理人支氣管上皮(BEAS-2B)細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心(中國上海)。細胞在添加10%胎牛血清(Gibco)、100 kg·L-1鏈霉素和100 kU·L-1青霉素的DMEM(Gibco)中于37 ℃、5% CO2條件下培養。對于刺激,給予10 μg·L-1IL-13預處理30 min,然后與FN(1、10 μmol·L-1)或Dex(5 μmol·L-1)處理BEAS-2B細胞24 h。

1.9 免疫熒光染色對于DRP1和IL-1β的免疫熒光染色,BEAS-2B細胞和肺組織切片固定,室溫下在含0.25% Triton X-100的PBS中透化10 min,并用PBS清洗3次。隨后,用1%牛血清白蛋白 (BSA; Sigma-Aldrich) 的PBS中孵育1 h。然后與抗DRP1和IL-1β抗體在4 ℃下孵育過夜。緩慢沖洗后,與Alexa Fluor 488(綠色)標記的驢抗山羊IgG(Invitrogen)在1% BSA中在室溫下避光孵育2 h。清洗后,使用4′-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI; Invitrogen)對細胞核染色。在Cytation 5下進行觀察并采集圖像。

2 結果

2.1 FN能顯著減輕OVA誘導哮喘小鼠氣道炎癥,上皮下膠原沉積與纖維化為了檢測FN對哮喘小鼠氣道周圍炎性細胞浸潤和上皮下膠原沉積和纖維化的影響,我們通過肺組織HE染色(Fig 1A,C)和Masson染色(Fig 1B,D)測定氣道周圍炎性細胞與膠原沉積。與Control組相比,OVA組氣道周圍炎癥細胞浸潤增加。然而,與OVA組相比,FN高劑量治療小鼠氣道周圍炎癥細胞與膠原沉積和纖維化減少明顯。結果表明,FN可能通過抑制氣道炎癥和上皮下膠原沉積和纖維化來減輕OVA誘導的哮喘。

Fig 1 Effect of FN on airway inflammation and subepithelial collagen deposition and

2.2 FN減輕OVA誘導哮喘小鼠Th2細胞因子及血清中IgE水平我們通過ELISA法檢測了BALF中的Th2細胞因子(Fig 2A)。與Control組相比,OVA組IL-4、IL-5和IL-13的表達水平明顯增加(P<0.05)。與OVA組相比較,FN高劑量治療的Th2細胞因子水平明顯減少(P<0.05)。此外,ELISA法檢測了血清總的和特異性IgE水平(Fig 2B)。與Control組相比,OVA組血清IgE水平增加明顯(P<0.05)。與OVA組相比,FN高劑量治療后IgE水平減少明顯(P<0.05)。以上結果表明,FN可能通過減少Th2和IgE水平來減輕OVA誘導的哮喘。

Fig 2 Effect of FN on BALF inflammatory cell infiltration and serum ige in asthmatic

2.3 FN對氧化應激的影響ROS產生過多可導致線粒體損傷。我們用ELISA法測定了BALF中SOD、CAT和MDA表達(Fig 3A-C)。與Control組相比,OVA組SOD和CAT活性明顯降低,但MDA表達水平明顯增加(P<0.05)。與OVA組相比,FN高劑量治療后則可以逆轉該作用(P<0.05)。此外,我們還分析了BEAS-2B中ROS水平(Fig 3D)。與Control組細胞相比,IL-13誘導的BEAS-2B細胞ROS表達明顯增加。與IL-13誘導的BEAS-2B細胞相比,FN高劑量治療后的ROS生成明顯降低。由此可見,FN可能通過增加SOD、CAT,降低MDA,減少ROS積累來防止線粒體損傷。

Fig 3 Effect of FN on oxidative stress in asthmatic mice

2.4 FN對 p-DRP1、DRP1、MFN1、MFN2蛋白的影響我們通過Western blot測定了p-DRP1、DRP1、MFN1、MFN2(Fig 4A,B)。與Control組相比,OVA組p-DRP1水平增加,MFN1的表達明顯減少(P<0.05),而總DRP1與MFN2的表達無明顯變化。與OVA組相比,FN高劑量治療可明顯增加DRP1的減少,MFN1的表達增加(P<0.05),而總DRP1與MFN2的表達無明顯變化。此外,DRP1的免疫組織化學結果也顯示,FN治療后可以減少DRP1蛋白的表達水平(Fig 4C)。與此同時,免疫熒光檢測BEAS-2B細胞中DRP1的表達水平,與Control組相比,IL-13誘導的BEAS-2B細胞中DRP1的表達明顯上升(Fig 4D)。與IL-13誘導的BEAS-2B細胞相比,FN高劑量治療后可明顯減少DRP1的表達。上述結果表明,FN可能通過DRP1-NLRP3通路的影響,減少線粒體裂變,從而減輕哮喘氣道炎癥。

2.5 FN對DRP1介導的NLRP3的影響為了解FN對哮喘小鼠體內NLRP3炎癥小體的影響,我們通過Western blot 分析了NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達水平(Fig 5A,B),與Control組相比,OVA組NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達明顯增加(P<0.05),與OVA組相比,FN高劑量治療后可有效抑制NLRP3、Caspase-1、IL-1β表達(P<0.05)。此外,免疫組織熒光染色IL-1β(Fig 5C),結果表明OVA組NLRP3表達明顯增加,而FN高劑量治療后顯著減少該表達。以上結果表明FN能有效減少哮喘小鼠體內NLRP3炎癥反應。

Fig 5 Effect of FN on DRP1-Mediated NLRP3

3 討論

本研究探討FN通過調節ROS抑制DRP1介導的線粒體裂變在過敏性氣道炎癥中的作用及潛在機制。本研究證明,FN可以抑制OVA誘導的氣道周圍嗜酸性粒細胞浸潤和膠原沉積、BALF中炎癥細胞以及血清IgE水平。此外,FN可增加哮喘小鼠BALF中SOD和CAT活性,同時減少MDA表達以及BEAS-2B細胞中總ROS水平。而且,FN還可以增加OVA誘導哮喘小鼠MFN1的表達,同時減少DRP1的磷酸化與NLRP3炎癥小體活化。我們的發現表明FN在減輕 OVA 誘導的哮喘小鼠氣道炎癥方面發揮了很有前景的藥理作用,可能是通過抑制DRP1-NLRP3信號通路實現。

眾所周知,ROS的產生過多和氧化應激與OVA誘導的支氣管上皮細胞損傷和哮喘的發生發展有關[11]。FN具有多種藥理作用,如抗癌、抗凋亡、抗炎、抗氧化、抗高血壓和抗糖尿病等。研究證實,FN有效地提高了創傷性腦損傷大鼠腦組織谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和SOD的活性,同時降低了MDA、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)白細胞介素-6(IL-6)濃度。同時,核因子E2相關因子2(Nrf2)的蛋白表達有效上調[12]。一致地,我們發現FN上調OVA誘導的哮喘中SOD和CAT,且降低MDA。由此可見,FN可通過誘導抗氧化酶抑制哮喘炎癥,從而抑制氧化應激和組織損傷。眾所周知,ROS水平的減少是抑制氣道炎癥的有效策略。我們的數據表明FN能減弱IL-13誘導BEAS-2B細胞中總ROS的水平?；谏鲜霭l現,我們推測FN可能通過抑制氧化應激和ROS減輕氣道炎癥。

ROS調控的線粒體功能障礙可引發線粒體裂變。據報道,百草枯(paraquat, PQ)誘導的凋亡和線粒體裂變中,DRP1與ROS在小鼠肺泡II型(AT-II)細胞中具有相互作用[13]。由此可見,炎癥引起的ROS與線粒體裂變密不可分。研究證實,DRP1(Ser616)磷酸化可使DRP1失活導致線粒體裂變。此外,分泌型卷曲相關蛋白5(Sfrp5)可以通過增加p-AMPK和線粒體融合蛋白的同時降低p-DRP1(Ser616)改善心肌梗死后重塑[14]。此外,在鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)誘導的糖尿病大鼠中,FN減弱腎小管細胞凋亡、線粒體斷裂并恢復線粒體動力學相關蛋白,如DRP1、Fis1和MFN2,以及凋亡相關蛋白,如Bax、Bcl-2和 cleaved caspase-3的表達。我們的研究結果也揭示了OVA與IL-13誘導的氣道炎癥中ROS大量產生、DRP1被募集到線粒體膜并促進線粒體分裂,從而導致線粒體功能障礙。同時,我們的研究結果也證實FN通過減少DRP1的磷酸化和線粒體融合蛋白的增加,維持正常的線粒體形態。說明,FN是通過減少DRP1介導的線粒體裂變,改善線粒體功能,抑制氣道炎癥。

氧化應激和線粒體功能障礙已被證明能觸發炎癥的激活,如NLRP3炎癥小體[15]。當ROS產生增加時,細胞接收相關信號來刺激NLRP3炎癥小體[15]。激活的NLRP3刺激Caspase-1并介導IL-1β成熟,從而擴大炎癥反應。表明NLRP3的激活與線粒體損傷具有廣泛而緊密的聯系[16]。研究發現, DRP1介導的線粒體裂變可誘導視網膜細胞產生ROS和NLRP3炎癥小體的形成[15],從而引發一系列炎癥級聯反應。NLRP3驅動的炎癥反應是哮喘發病的關鍵驅動因素[17]。研究證實,FN有抗炎,抗氧化作用。在動物模型中,FN通過阻斷NF-κB和 AP-1 活化途徑顯著抑制炎癥相關基因表達[18]。有報道稱,FN治療顯著改善了小鼠肺功能,減輕了肺部炎癥,包括炎癥細胞浸潤、白細胞介素IL-4、IL-5和IL-13、免疫球蛋白IgE、C-C基序趨化因子配體5(CCL5,也稱為趨化因子)、CCL11(也稱為嗜酸細胞活化趨化因子-1)和 IL-17A 水平升高。此外,FN處理顯著減弱了杯狀細胞增生和膠原沉積,并顯著降低氧化應激。進一步的,我們的結果也證實了線粒體功能障礙與哮喘小鼠中NLRP3炎癥小體的相關性。由此可見,ROS的抑制與線粒體功能的維持有助于抑制NLRP3,caspase-1和IL-β蛋白的表達。這些結果揭示了FN可能通過抑制DRP1-NLRP3信號通路緩解哮喘氣道炎癥。

總之,基于體內外實驗,我們推測FN可能通過DRP1-NLRP3信號通路部分發揮其生物學效應。綜上所述,本研究結果表明FN可能通過抑制ROS相關的線粒體裂變減輕過敏性氣道炎癥。但其潛在機制仍需進一步驗證。我們的發現可能有助于了解FN在支氣管哮喘中的作用并且為闡明哮喘發病機制提供研究基礎。