連續式微濾膜分離乳清蛋白的研究

于聲波，劉宇，白茹，高增麗，烏云，曹文慧，母智深*

（1.內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司全球研發創新中心，呼和浩特 011517；2.內蒙古自治區乳品營養健康與安全企業重點實驗室，呼和浩特 011517）

0 引 言

乳清蛋白和酪蛋白是牛乳蛋白的主要組成成分，在擁有不同的功能特性和營養價值的同時又都是食品工業中重要的基礎原料。乳清蛋白最早來源于干酪生產的副產品，根據干酪生產工藝的不同又分為酸乳清和甜乳清，通過不斷研究和應用發現乳清蛋白擁有良好的乳化性和起泡性[1]，因此對乳清蛋白的研究逐漸成為食品科學領域的熱點。使用膜分離工藝生產的乳清蛋白被稱為天然乳清蛋白，由于生產過程始終處于溫度較低的中性環境，所以能夠很好的保護乳清蛋白的活性不變，因此膜法制備的天然乳清蛋白相比酸乳清和甜乳清擁有更好的營養價值，是一種更優良的食品原料和添加劑[2-4]，同時還有良好的生物相容性和生物降解性[5]。

微濾膜分離技術是一種高效、節能環保的非熱物理分離技術，適合分離溫度敏感的熱敏性營養物質。牛乳中酪蛋白和乳清蛋白的質量比約為80∶20，其中95%的酪蛋白以膠束的形式存在，粒徑分布在40~300 nm之間且主要集中在200 nm 左右。微濾膜過濾技術常被用來分離乳中的乳清蛋白和酪蛋白膠束，通常選擇膜孔徑在0.1~0.2 μm 的陶瓷或高分子微濾膜，JRGENSEN 等[6]研究了微濾膜孔徑和跨膜壓力對分離效果的影響，最終確定0.1 μm 適合作為分離乳清蛋白的膜孔徑，分離溫度為50~55 ℃，在保證熱敏性物質穩定的情況下提高分離溫度有助于獲得更高的膜通量[6]。由于更低的分離溫度不但可以在分離過程中控制微生物生長，還能最大程度的保持熱敏營養物質的活性[7]，低溫微濾也逐漸成為研究的熱點[8-11]。當溫度低于4 ℃時，酪蛋白膠束中的β-酪蛋白能夠從酪蛋白膠束中解離并處于游離狀并通過微濾膜進入透過液中，實現β-酪蛋白的分離[12]。羊乳在組成成分上與牛乳不同，但同樣可以使用微濾膜分離技術分離羊乳酪蛋白和乳清蛋白，姜竹茂等[13]研究了利用多級微濾膜分離羊乳酪蛋白。張雨萌等[14]研究了不同孔徑國產陶瓷膜對脫脂牛、羊乳中酪蛋白和乳清蛋白過程和膜性能參數的影響。

目前由于大規模應用微濾膜分離技術的場景有限，研究主要集中在批次式的分離方式，這種分離方式與工業化連續式的生產需求存在一定的不同。批次式生產產能小，不可連續，更多的生產間隔易產生安全風險。因此本研究聚焦于中試規模的連續化分離方式，其優點在于生產連續，產能穩定。同時在洗濾方面，本研究使用了和批次式生產不同的連續在線加水洗濾方式，能夠達到在相同的洗濾效果下節約用水。但連續式分離也存在實驗時間較長，膜表面污堵逐漸沉積導致的膜通量下降等需要研究改進的問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生牛乳（總固形物13±1%），內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司牧場；鹽酸、硫酸、乙醚、硼酸、氫氧化鈉、甲基紅指示劑、溴甲基綠指示劑、亞甲基藍指示劑、硝酸、高氯酸，中國國藥集團有限公司；淀粉酶、α-乳白蛋白對照品、β-乳球蛋白對照品、乙醇、乙酸，Sigm a公司；三氟乙酸、三氟乙酸乙腈，百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設備

微濾膜系統（定制），潔翼流體公司；ISO FLUX 陶瓷微濾膜，法國TAMI 公司；Agilent 1200 高效液相色譜儀、poroshell 120 色譜柱，美國安捷倫公司；XPR 226CDR/AC 天平，梅特勒-托利比多儀器(上海)有限公司；CR 21GII 離心機，日本日立公司；PHS-25 pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；K jeltec8200 自動凱氏定氮儀，丹麥FOSS 公司；AA 6880 PLUS 原子吸收光譜儀，日本島津公司；TANK 40 微波消解儀，上海新儀微波化學科技有限公司；科恒101 恒溫鼓風干燥箱，青島科隆達儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微濾膜分離實驗

實驗使用陶瓷微濾膜，三級膜共使用21 支單體膜，每支膜面積為0.2 m2，總面積共計4.2 m2。采用連續式在線加水洗濾分離方式。

設備流程如圖1 所示，生乳經過巴氏殺菌（75 ℃，15 s）離心脫脂后進入Tank1 脫脂奶進料罐，在進料泵B1 驅動下依次經過串聯的M F1，M F2，M F3 三級微濾膜進行分離，三級膜所有的截留液收集至截留液儲存罐Tank2，純凈水經洗濾水泵B4 進入二三級微濾膜進行洗濾分離，三級所有透過液收集至透過液儲存罐Tank3 中，為方便計算，各個平衡罐均為帶有液位檢測功能的食品級不銹鋼儲罐。生牛乳部分理化指標為蛋白質3.21 g/100 g、脂肪4.0 g/100 g、乳糖4.86 g/100 g、總固形物含量為12.44 g/100 g，部分脫脂乳理化指標為蛋白質3.4 g/100 g、脂肪0.17 g/100 g、乳糖5.27 g/100 g、總固形物含量9.55 g/100 g。單次實驗使用脫脂乳約1 200 L。

圖1 設備流程

1.3.2 膜通量測定

膜通量是指在單位時間內通過單位膜面積的物質的量，通常作為衡量膜分離效率的依據，膜通量越大表示單位時間內膜兩側的物質交換越多，膜的處理量越大。

式中：JF為膜通量；V為T時間內從原料液中穿過M F 膜進入濾過（滲透）液中的水的體積；A為M F膜的膜面積。

1.3.3 清洗恢復率（RC）

式中：Rc表示清洗恢復率；fw為標準水通量（水通量通常被用來評價C IP 后M F 膜的清洗效果，M F 膜第一次使用之前或完全清洗干凈后的膜通量為標準水通量）；fc為C IP 后的膜通量。

1.3.4 分離率

本文中分離率的計算參考YANG B Y 等[15]的方法。

式中：rem oval 為各物質的分離率（%）；[SP]retentate為截留液中某物質的質量；[SP]SGM為脫脂奶原料中某物質的質量；CF為濃縮倍數。

1.3.5 跨膜壓力

式中：TM P 為跨膜壓力；Pin為截留液進口壓力；Pout為截留液出口壓力；Pp為透過液側壓力。

1.3.6 蛋白質含量測定參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》[16]進行檢測。

1.3.7 脂肪含量測定參照GB 5009.6—2016—3《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》[17]進行檢測。

1.3.8 總固形物含量測定參照GB 5413.39—2010《食品安全國家標準乳和乳制品中非脂乳固體的測定》[18]進行檢測。

1.3.9 α-乳白蛋白測定參照T/TDSTIA 002—2021《奶及奶制品中α-乳白蛋白的測定高效液相色譜法》方法進行檢測。

1.3.10 β-乳球蛋白測定參照T/TDST IA 007—2019《奶及奶制品中β-乳球蛋白的測定液相色譜法》方法進行檢測。

1.3.11 鈣、鎂、鈉、鉀測定

參照GB/T 5009.92—2016《食品中鈣的測定》[19]、GB/T 5009.241—2017 《食品中鎂的測定》[20]、GB/T 5009.91—2017《食品中鉀、鈉的測定》[21]。

2 結果與討論

2.1 連續式微濾膜分離通量隨時間變化情況

實驗使用脫脂奶為原料，實驗溫度為50 ℃，跨膜壓力為0.08 M Pa，濃縮倍數為3.5 倍。本文中使用L/(m2·h)作為膜通量的單位，記為LPH。

批次式微濾膜分離制備過程中，膜通量隨著時間增加而顯著降低且過程不可逆，清洗后才能恢復正常通量，從而導致相比于連續式生產，其生產時間長，生產效率低且批次之間的時間間隔會增加產品污染的風險[22]。本實驗所用連續式微濾膜分離設備設計為三級M F 膜以串聯方式連接，通過一級M F 膜分離濃縮，二、三級M F 膜在線加水洗濾的方式實現連續分離乳清蛋白和酪蛋白。分離、洗濾同時進行的方式避免了批次式生產每次洗濾后加水導致的停機，節約洗濾水用量，提高了生產效率；一級分離，二級洗濾的方式可以盡可能地減緩膜堵塞的時間，從而延長總體的生產時間。連續式膜分離通量隨時間的變化趨勢如圖2 所示。

圖2 膜通量隨時間變化曲線

一級膜在分離階段起到的作用最大同時由于一級膜在分離過程中沒有加水洗濾所接觸的物料濃度最大，污堵情況最嚴重，所以總體上一級膜初始通量最小，通量降低的速度也最快。隨著實驗時間增加，部分與膜孔徑相似的酪蛋白膠束堵塞部分膜孔，膜表面開始形成一層沉淀污堵，三級膜組都出現通量下降的情況，各級膜通量下降的程度有明顯區別。二、三級膜在分離過程中以洗濾為主，所以二，三級中循環的料液濃度較低，且可能導致污堵的100~200 nm 左右的酪蛋白膠束已部分在一級膜表面沉淀，所以二，三級膜通量下降情況優于一級膜。經過240 min 實驗之后，二級通量下降約8 %，3 級通量下降9.9 %，而一級膜通量從開始的44.6 LPH 經過240 min 后降到36.9 LPH，通量下降約17.2 %。同時通過圖中曲線趨勢可以看出一級膜通量下降趨勢明顯快于其他兩級，隨著實驗時間的進一步增加一級膜的通量將繼續下降，導致分離效率降低，因而將成為影響整體膜通量的主要因素。后續研究中可以通過單獨沖洗一級膜、增加一級循環流量及設置反沖洗裝置等方法減緩或恢復一級膜通量，從而延長整體生產時間。

2.2 跨膜壓力對膜通量的影響

跨膜壓力是影響微濾膜分離膜通量變化、分離效果和清洗效率等最主要的因素之一。理論上跨膜壓力越大，單位時間截留液和滲透液之間的跨膜物質交換越多，分離或濃縮效率越高。但同時帶來的負面效果是膜表面的污堵現象越嚴重，污垢積累的速度越快，膜通量下降的速度越快。膜表面形成的不可逆沉淀量與跨膜壓力成正相關關系，不可逆沉淀越多，終產率越低，清洗難度越大。實驗通過固定截留液側壓力，調節透過液出口壓力的方式實現跨膜壓力的變化，設置0.08、0.11、0.14 M Pa 3 個壓力梯度，實驗溫度為50 ℃，濃縮倍數為3.5。

由圖3 曲線可知，跨膜壓力與總通量為正相關關系。TM P 升高0.06 M Pa 總通量升高約24%，意味著相同的實驗時間更多的乳清蛋白跨過微濾膜進入透過液中。隨著實驗時間的增加，膜通量開始下降，生成一部分不可逆的沉淀堵塞膜孔道或在膜表面形成空間位阻影響物質的通過。本次實驗使用的微濾膜孔徑為0.1 μm，污堵的主要成分酪蛋白膠束粒徑大小實際分布在0.04~0.3 μm 之間，小部分粒徑和膜孔經相似的酪蛋白附著在膜表面或膜孔內，之后蛋白質之間通過相互作用形成沉淀污阻層?？缒毫υ酱髣t形成的膜堵越快，不可逆沉淀越牢固。膜表面的污堵沉淀分為可逆沉淀和不可逆沉淀2 種，可逆沉淀對于膜堵問題影響小，可以通過增大循環流量，改變膜面流速等方式減輕或規避。而不可逆沉淀的形成后只能通過有效的原位清洗(CIP)解決。通常情況下通過測量水沖恢復率來評價不可逆沉淀的產生情況，具體操作為實驗結束后水沖30 min 直至系統內水透明時記錄水沖恢復率f1。C IP 過程依次為水沖洗30 min，2.5%濃度氫氧化鈉溶液80 ℃循環30 min，0.75 %硝酸溶液60 ℃循環30 min，清洗結束之后記錄最終的恢復率。

圖3 不同跨膜壓力條件下膜通量與時間變化關系

如圖4 所示，跨膜壓力升高導致的不可逆沉淀顯著性增加，水洗恢復率f1逐漸降低，TM P 從0.08 M Pa 升高到0.14 M Pa 而f1從85.4%降低至60.6%?？缒毫﹄m然能夠帶來高通量，但是更嚴重、更快速的污堵則可能導致保證生產效率的生產時間簡短，如何平衡跨膜壓力與生產效率的關系仍待后續研究。經過完整CIP清洗之后各跨膜壓力實驗后清洗恢復率fc同初始水通量fw相比均恢復至實驗開始時的水平，證明清洗方案合適且仍有部分剩余清洗能力，所以在條件允許的情況下仍可以提高跨膜壓力或延長實驗時間從而進一步提升分離能力。

圖4 不同跨膜壓力實驗后的清洗結果

2.3 連續式膜分離過程分離效果隨時間的變化

受實驗設備所限目前關于微濾膜分離的研究大都集中在批次式實驗方式，中試級別的連續式技術可以參考的研究較少。本文研究了長時間連續式微濾膜分離過程中分離組分隨實驗時間變化的情況，設定的實驗溫度為50 ℃，跨膜壓力為0.14 M Pa 時，濃縮倍數為3.5 倍，連續實驗150 min，間隔相同時間檢測截留液中指標數據，實驗結果如表1 所示。

表1 截留液及透過液中蛋白質組成隨時間變化

在跨膜壓力、溫度及濃縮倍數均不變的情況下，截留液及透過液中各蛋白質組分隨時間變化情況如表1 所示。從表中數據可以看出，使用0.1 μm 孔徑微濾膜分離酪蛋白效果優異。其中透過液中幾乎不含酪蛋白。如圖5 所示，隨著實驗時間的增加，截留液中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白2 種乳清蛋白主要組成物質濃度隨著時間的增加逐漸變高，透過液中的乳清蛋白含量逐漸減少，分離效率逐漸降低。其原因主要是隨著實驗時間的增加，膜表面的污堵逐漸增加，部分蛋白質在膜表面沉積形成污堵層，使得微濾膜有效的過濾孔徑逐漸小于0.1 μm，膜通量降低導致相同時間內通過膜的目標分子數量減少。實驗進行150 min 之后，透過液中的α-La 濃度從開始時的823.9 m g/L 下降至517.1 m g/L(下降約37%)，β-LG 濃度從開始時的3 027.7 m g/L 下降至1 923.6 m g/L（下降約36.5%）。因此乳清蛋白和酪蛋白的分離效率受生產時間的影響，后續工業化應用時需考慮分離效率與成本之間的關系。與批次式實驗方式不同，連續式實驗使用在線加水洗濾的方式，實驗中不會停止，無法采用破壞體系穩定性的方法恢復部分通量，污垢會不斷在膜表面沉積，若想獲得更好的分離效果，需要使用其他的控制工藝，如實驗開始時使用較小跨膜壓力逐漸升高至目標壓力或增加膜內循環流量，提高膜表面流速等。

圖5 截留液中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白組成比例隨時間變化

2.4 跨膜壓力（TMP）對乳清蛋白組成比例的影響

乳清蛋白是牛奶中蛋白質的重要組成成分，約占牛奶總蛋白質的20%，其中絕大部分由α-乳白蛋白和β-乳球蛋白組成，α-La 是基本氨基酸和支鏈氨基酸的極好來源，有助于調節睡眠、情緒和壓力。β-LG是乳清蛋白的主要組成成分，同時也是嬰兒致敏性蛋白質的一種，但是添加適度水解β-LG 有益于調節嬰兒腸道健康[23-25]。組分單一的高純度蛋白質無論是試劑還是原料在未來的應用都將變得越來越重要。初步將乳清蛋白和酪蛋白分離后，進一步研究了分離的乳清蛋白中α-La 和β-LG 的分布情況，發現2 種蛋白質的比例會受到跨膜壓力的影響，實驗使用50 ℃溫度作為生產溫度，分別設定跨膜壓力為0.08、0.11、0.14 M Pa，實驗進行240 min 每隔相同的時間取樣檢測透過液中α-La 和β-LG 的含量并計算平均2 種蛋白質的分離率。2 種蛋白質分離率隨跨膜壓力變化情況如圖6 所示。

圖6 不同跨膜壓力下α-La 和β-LG 的含量變化

隨著跨膜壓力的升高，更多的乳清蛋白從截流液中穿過膜進入透過液中，其中α-La 隨跨膜壓力變化不明顯。β-LG 的跨膜運動情況有明顯的變化，跨膜壓力從0.08 M Pa 升至0.14 M Pa 時，β-LG 的分離率從79.3 %升高到92.7 %，升高的幅度較為明顯。而2 種蛋白比例變化的原因為α-La 和β-LG 分子量大小不同(α-La 分子量約為14 ku 左右，β-LG 分子量約為18 ku左右，以二聚體形式存在)，在正常膜表面沒有沉積的情況下2 種蛋白可以正常的通過膜孔，隨著膜表面的沉積，部分膜孔被與膜孔徑相似的蛋白質堵塞且沉積在膜表面的蛋白質交聯導致實際微濾膜選擇通過分子量變小，對于分子量較大的β-LG 更難通過膜孔。調整乳清蛋白中2 種主要蛋白質的比例對于后續進一步分離純化α-La 和β-LG 或相應的應用有重要意義，如根據不同應用場景對于乳清蛋白比例的要求，使用跨膜壓力進行調整。

2.5 金屬離子在截留液及透過液中的分布情況

牛奶中的金屬離子除了是重要的營養元素之外，對于乳蛋白的結構和性質都有重要的影響，而在膜分離的過程中由于離子體積很小，理論上將在膜的兩邊自由擴散使得膜兩邊的離子濃度相同，但是由于截留液和透過液的蛋白質濃度不同，使得截留液和透過液各蛋白質所處的離子濃度不同[26-28]。

實驗在50 ℃的溫度下進行，分別使用0.08，0.11，0.14 M Pa 3 種跨膜壓力下進行分離，待實驗過程穩定后（約45 min）分別取脫脂奶，截留液，透過液檢測樣品離子濃度，實驗過程無法使用同一批次的脫脂乳全部完成，不同實驗批次之間脫脂乳理化指標存在差異導致金屬離子含量最終檢測結果不同，實驗統一將金屬離子含量換算為每克蛋白質金屬離子含量以增加實驗結果的可靠性，結果如表2 所示。

表2 4 種金屬離子在截留液和透過液中的分布情況

牛奶中的70%左右的鈣離子分布于在酪蛋白膠束中，30%左右鈣離子處于游離的狀態，所以大部分的鈣離子都在截留液中。截留液每克蛋白質對應的鈣離子濃度與脫脂奶原料的濃度相差不大，處于正常的濃度范圍不會對酪蛋白膠束形態有影響。透過液中的每克蛋白質對應的鈣離子濃度顯著大于脫脂奶中每克蛋白質對應的鈣離子濃度，此時透過液中的蛋白質主要為乳清蛋白，受鈣離子濃度影響較小。

總體上整體離子濃度層面，檢測的一價離子在截留液和透過液中的分布相對較為平均，透過液中的鉀離子比截留液中的鉀離子高30 %左右，截留液中的鈉離子比透過液中的鈉離子高70 %左右。而二價的金屬離子則多分布于截留液中，鈣離子原因如上所述，鎂離子可以和磷酸根形成磷酸鹽化合物，同時部分鎂離子還可以和酪蛋白膠束結合，所以多數鎂離子存在于截留液中。

從每克蛋白質對應的離子濃度層面，截留液中的酪蛋白所處的離子濃度低于分離前的環境。同時，透過液中每克蛋白質對應的離子濃度則遠大于正常的脫脂奶，盡管透過液中的乳清蛋白往往對于金屬離子不敏感，不會對其結構產生影響，但是在后續的處理或實驗中，如濃縮制粉或復配使用過程中往往會帶入大量的金屬離子，所以需要對微濾分離的透過液進行脫鹽處理。

3 結 論

研究了0.1 μm 陶瓷微濾膜連續在線加水洗濾從脫脂奶中分離乳清蛋白的工藝。受實驗設備的限制，以往研究多集中于批次式的加工工藝，較難符合工業生產的需求，同時難以獲得組分隨制備時間的變化情況。相較于批次式生產工藝，連續式生產工藝擁有產量高、品質穩定及洗濾用水少等優勢。但由于生產過程為連續動態更易受到膜表面污堵沉積帶來的影響，分離的各組分濃度和組成會隨著工作時間的延長發生變化。實驗使用一級濃縮分離，二級、三級洗濾分離的分離模式，整體的膜通量隨工作時間的延長而逐漸降低，通過數據分析發現膜通量的主要下降原因是由于一級膜通量下降導致，所以為延長工作時間需要重點關注一級膜的污堵情況?？缒毫κ怯绊懳V膜分離的重要因素，更高的跨膜壓力可以產生更高的膜通量，提高分離效率，但是高跨膜壓力同時可能帶來更快更嚴重的膜堵情況，實驗發現跨膜壓力升高0.06 M Pa，膜通量可以提高26 %同時實驗結束后的水洗恢復率將下降28 %左右。在跨膜壓力一定的情況下，實驗時間增加截留液中的乳清蛋白含量會逐漸增加，意味著透過液中的乳清蛋白含量會逐漸減小，整體的分離效率會下降，需要平衡生產時間與分離效率之間的關系。隨著跨膜壓力的升高α-La 分離率變化較小，但是β-LG 分離率顯著升高?？缒毫@著地影響分離乳清蛋白的組成，可以根據生產需求和后續實驗的要求利用跨膜壓力對于乳清蛋白的組成比例進行調整。同時還研究了不同跨膜壓力下的截留液和透過液的金屬離子濃度，由于金屬離子對蛋白質結構和功能有影響所以需要重點關注蛋白質所處的離子環境。