嗜熱鏈球菌grx02 化學限定增殖培養基及變溫培養策略的研究

彭奎耀，關成冉，瓦云超，顧瑞霞

(揚州大學江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室，江蘇 揚州 225000）

0 引 言

嗜熱鏈球菌作為發酵劑，具有快速產酸凝乳和改善產品質構的特征，被廣泛用于乳制品的發酵[1]。早在二十世紀初，人們利用嗜熱鏈球菌與德氏乳桿菌保加利亞亞種作為發酵劑菌株生產酸奶[2]。在發酵過程中，嗜熱鏈球菌可以產生許多功能性物質，如胞外多糖、細菌素和維生素等，在降膽固醇、抗氧化、保護肝損傷、抑制腸道致病菌及抗炎癥等方面具有開發利用的潛力[3-7]。由此可見，嗜熱鏈球菌市場需求巨大，商業價值高。

目前用于培養嗜熱鏈球菌的培養基多采用M RS、M 17 等，這些商用培養基來源不同，培養效果重復性差，會造成批次間差異。此外，商用培養基中含有蛋白胨、牛肉膏和酵母提取物等復雜成分[8]，在代謝組學和蛋白質組學研究中，會對特定營養素或選定分子的監測帶來問題[9-10]?；瘜W限定培養基（chemically defined m edium,CDM）是一種營養均衡且化學成分已知的培養基，通常包含碳源、氮源、無機鹽及目標微生物所需的其他營養物質，具有良好的培養重復性[11-12]。CDM 可排除未知成分的干擾，更準確有效的用于嗜熱鏈球菌代謝途徑、基因調控與蛋白質表達的研究[13-14]。但利用化學限定培養基培養嗜熱鏈球菌獲得的最大生物量較低，限制其在嗜熱鏈球菌規?；囵B中的應用。

研究表明，溫度是影響乳酸菌生長的重要因素[15-16]。大部分研究都是關于單一培養溫度對乳酸菌生長的影響，如ARmin T[17]探究溫度對8 株嗜熱鏈球菌生長的影響，發現37 ℃更適合嗜熱鏈球菌生長。僅有少部分研究變溫培養對乳酸菌生長的影響。馮鎮[18]發現與單一溫度培養相比，適合變溫培養能夠提高乳酸乳球菌的生物量與發酵活力。目前，未發現關于嗜熱鏈球菌變溫培養的研究。

本文優化獲得嗜熱鏈球菌grx02 增殖的化學限定培養基及變溫培養條件，為嗜熱鏈球菌生產及其代謝與功能研究提供物質基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

嗜熱鏈球菌grx02 為揚州大學江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室分離、篩選和保存的專利菌株。

1.1.2 試劑

乳糖、葡萄糖、蔗糖、氯化鎂、氯化鈣、乙酸鈉、檸檬酸銨、尿素、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、抗壞血酸鈉，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；鹽酸硫胺素、泛酸鈣、葉酸、生物素、煙酸、鹽酸吡哆醇、對氨基苯甲酸、核黃素、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、纈氨酸，均為分析純，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 儀器與設備

全自動高壓蒸汽滅菌鍋，TOM Y 公司；DNP-9272 恒溫培養箱、HZP-150 恒溫搖床培養箱，上海精宏實驗設備有限公司；FP-110-C Bioscreen CTM 系統，Lab-system s 公司；101-1BS 恒溫鼓風干燥箱，力辰科技有限公司。

1.2 菌體生長曲線的繪制

Bioscreen C 系統可自動化進行測定并記錄菌體生長情況，該系統內置的EZ Experim ent 軟件能夠持續地記錄菌體密度。本實驗參數設置：相應培養溫度，培養時間24 h，測量間隔30 min，波長600 nm，測量前后震蕩時間30 s，震蕩完成靜止10 s 讀值。

每個加樣孔中加入294 m L 培養基與6 m L 二代菌懸液后混勻，將樣品板放入Bioscreen C 培養箱內，每組樣品設置3 個平行，培養24 h 后記錄數據。

1.3 活菌數的測定

活菌數的測定采用平板計數法。

1.4 化學限定培養基的配制

預先配制46 種組分的濃縮液，成分及濃度如表1，按照濃縮比例再進一步配制各組分的預混液。采用121 ℃滅菌15 min。

表1 化學限定培養基配方

1.5 必需營養成分的確定

根據表1 所示，逐個缺失每一種因素（乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖及半乳糖除外），繪制生長曲線，確定菌體生長的必需營養成分，從而精簡CDM 成分。乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖及半乳糖分別進行單因素實驗，確定菌株的最佳碳源及濃度。

1.6 CDM 成分濃度優化實驗

CDM 中每種因素的含量設置5 個水平，選取范圍如表2 所示。

表2 化學限定培養基組分以及單因素營養素水平選取

1.7 不同溫度培養

將菌體接種于CDM 中，培養溫度為42、39、37 ℃和35 ℃，利用全自動生長曲線儀繪制生長曲線，并在對數末期計活菌數，測定發酵pH 值。每組實驗設3 個平行，重復2 次。

1.8 變溫培養策略

將菌體接種于CDM 中，初始溫度39 ℃培養，延滯期末期培養溫度分別為42 、39 ℃和37 ℃，對數末期培養溫度分別為42 、39 ℃和37 ℃。測定菌體生長曲線，對數末期活菌數，發酵pH 值，每組實驗設3 個平行，重復2 次。

1.9 數據統計與分析

使用軟件O rigin 2018 繪圖，Excel 2010 和SPSS 19.0 進行數據處理，數據通過單因素方差分析（ANOVA）統計，檢驗結果取平均值（P<0.05）作為統計學差異判斷標準。

2 結果與討論

2.1 嗜熱鏈球菌grx02 的CDM 碳源及其濃度的確定

為研究碳源對嗜熱鏈球菌grx02 生長的影響，在預配制的CDM 中，分別添加1%濃度的乳糖、葡萄糖、半乳糖、果糖及半乳糖，測定對數期末期OD600、計算生長速率，結果如圖1(a)所示。

圖1 碳源及乳糖濃度對嗜熱鏈球菌grx02 生長的影響

由圖1(a)可知，嗜熱鏈球菌grx02 在CDM-Lac中生物量和生長速率最優，分別為每小時0.862、0.105，在CDM-Gal 中生長最差，生物量僅為0.220，表明乳糖為嗜熱鏈球菌grx02 生長最適碳源。進一步研究乳糖濃度對嗜熱鏈球菌grx02 生長的影響如圖1（b）所示，隨乳糖濃度的升高，嗜熱鏈球菌grx02 的生物量和生長速率呈先增長后降低的趨勢，在乳糖濃度為2%時達最大值，分別為每小時0.910、0.112 ，表明嗜熱鏈球菌grx02 生長最適的乳糖濃度為2%。在LIU G F[19]的研究中也發現乳糖最適合嗜熱鏈球菌的生長。

2.2 CDM 必需營養成分的確定

2.2.1 礦物質成分的確定

礦物元素是微生物生長和代謝產物合成的重要影響因子，如M g2+參與許多酶促反應，影響核苷酸等的代謝[20-22]，M n2+能夠緩解氧氣對菌體的毒副作用[23]，Ca2+可以促使ADP 磷酸化為ATP，為微生物細胞的增殖代謝提供能量并促進菌株的生長[24]。通過單一扣除礦物元素，確定嗜熱鏈球菌grx02 生長需要的礦物質，結果如圖2 所示。

圖2 單一缺失礦物質對嗜熱鏈球菌grx02 生長的影響

與對照組相比，缺少M n2+、M g2+時，嗜熱鏈球菌grx02 基本沒有生長（生物量＜0.1）；缺少Ca2+時，生物量明顯降低，Zn2+的缺少對生物量沒有顯著變化；而缺少Fe2+時，生物量明顯升高，表明M n2+、M g2+是嗜熱鏈球菌grx02 生長必需礦物質，Ca2+促進菌體生長，Fe2+抑制菌體生長。因此，選取M n2+、M g2+及Ca2+作為嗜熱鏈球菌grx02 生長CDM 中的礦物質成分。

2.2.2 維生素成分的確定

在菌體生長過程中，B 族維生素作為輔助因子或輔酶在碳水化合物、蛋白質及核酸的代謝中具有至關重要的地位，如核黃素、煙酸在菌體的代謝過程中參與輔酶Ⅰ和輔酶Ⅱ的合成，作用于胞內的許多生物氧化反應[25-26]。本實驗通過單一缺失維生素，確定嗜熱鏈球菌grx02 生長需要的維生素，結果如圖3 所示。

圖3 單一缺失維生素對嗜熱鏈球菌grx02 生長的影響

與對照組相比，缺少泛酸鈣、煙酸時嗜熱鏈球菌grx02 基本沒有生長（生物量＜0.1）；缺少鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、抗壞血酸時，嗜熱鏈球菌grx02 生長生物量降低；而對氨基苯甲酸、葉酸的缺少對于嗜熱鏈球菌grx02 生物量沒有顯著影響。結果表明：泛酸鈣、核黃素及煙酸是嗜熱鏈球菌嗜熱鏈球菌grx02 生長必需營養成分，鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、抗壞血酸有促進菌體生長的作用，對氨基苯甲酸、葉酸對于菌體生長是非必要成分。因此，選取泛酸鈣、核黃素、煙酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、抗壞血酸作為嗜熱鏈球菌grx02生長CDM 中的維生素成分。

2.2.3 氨基酸成分的確定

嗜熱鏈球菌是營養需求型菌株，需要氨基酸來維持最佳生長。如GARAU LT P C[27]發現亮氨酸、異亮氨酸及纈氨酸是嗜熱鏈球菌必需氨基酸。因此，本實驗通過單個缺失氨基酸，確定嗜熱鏈球菌grx02 生長需要的氨基酸，結果如圖4 所示。

圖4 單一缺失氨基酸對嗜熱鏈球菌grx02 生長的影響

在缺少谷氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、亮氨酸及纈氨酸時，嗜熱鏈球菌grx02 基本不生長（生物量＜0.1），是嗜熱鏈球菌grx02 必需營養素。異亮氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺扣除后，生物量均減少。分別扣除丙氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、精氨酸、色氨酸、丙氨酸及谷氨酰胺時，生物量沒有明顯地變化，但延長了菌體生長延滯期，導致菌體生長速率的下降。當酪氨酸、甘氨酸、絲氨酸、脯氨酸缺乏時，菌體濃度高于對照組，表明嗜熱鏈球菌grx02 生長不需要這些氨基酸。因此，選取谷氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、精氨酸、色氨酸及谷氨酰胺作為嗜熱鏈球菌grx02 生長CDM 中的氨基酸成分。

2.2.4 其他必需成分的確定

在嗜熱鏈球菌生長過程中還需要其他營養物質，如無機鹽、無機氮源等。通過單一扣除實驗，確定嗜熱鏈球菌grx02 生長需要的礦物質成分，結果如圖5 所示。

圖5 單一缺失其他營養物質對嗜熱鏈球菌grx02 生長的影響

與對照組相比，尿素和檸檬酸銨被扣除后，嗜熱鏈球菌grx02 基本沒有生長（生物量＜0.1），是嗜熱鏈球菌grx02 必需營養素。因為尿素和檸檬酸銨為嗜熱鏈球菌grx02 提供氮源。缺少乙酸鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，菌體生物量均有減少，表明這些成分是嗜熱鏈球菌grx02 生長所需的。

2.3 CDM 成分濃度優化

為了進一步研究除碳源以外其他營養物質對嗜熱鏈球菌grx02 生長的影響，將32 種營養成分設置5個濃度梯度，測定對數期末期OD600，結果如表3 所示。

表3 營養成分濃度對嗜熱鏈球菌grx02 生長的影響

根據表3 結果，將32 種營養物質分為3 類：第一類，隨著營養物質濃度的升高，菌體濃度先顯著升高后顯著降低，包括K2HPO4、KH2PO4、N a2HPO4、N aH2PO4、尿素、乙酸鈉、煙酸、抗壞血酸、核黃素、半胱氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸共16 種成分，確定各物質添加量分別為3、3、4.25、3.59、0.72、2、0.0025、1，0.0025、1.21、1.46、1.19、1.31、1.49、1.31、1.33 g/L。第二類，隨著成分濃度升高，菌體濃度先顯著升高后不變，包括組氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、丙氨酸、色氨酸、鹽酸吡哆醛、硫酸錳、檸檬酸銨共8 種成分，確定各物質添加量分別為0.75、0.73、0.825、0.445、1.02、0.0125、0.056、0.6 g/L。第三類，濃度升高，菌體濃度一直不變，包括纈氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、鹽酸硫胺素、泛酸鈣、硫酸鎂、氯化鈣共8 種成分，添加物質濃度為0.117、0.174、0.147、0.150、0.001、0.001、0.2、0.05 g/L。

2.4 溫度對菌體生長的影響

2.4.1 單一溫度培養研究

為研究溫度對嗜熱鏈球菌grx02 生長的影響，將嗜熱鏈球菌grx02 接入優化后CDM 培養基中，分別在35、37、39 和42 ℃培養，測定生長曲線、pH 變化曲線及對數末期活菌數，結果如圖6 所示。

由圖6（a）可知，當嗜熱鏈球菌grx02 在不同溫度下培養時，其到達穩定期的時間在8 ~12 h，其中42 ℃培養時，嗜熱鏈球菌grx02 能夠更快的進入穩定期，但最終的生物量是39 ℃最高。圖6(b)也表明相同的結果，嗜熱鏈球菌grx02 在39 ℃下培養，活菌數最高為8.92 log CFU/m L。嗜熱鏈球菌grx02 在42 ℃培養時，嗜熱鏈球菌grx02 能夠快速產酸，發酵液pH 下降最快。

單一溫度培養時，嗜熱鏈球菌grx02 在39 ℃培養時，活菌數最高，而42 ℃培養時，發酵液pH 下降最快。這也表明在嗜熱鏈球菌grx02 發酵中，單一溫度培養不能滿足菌株更好的生長。為了獲得高活菌數、高活力的菌體，分別在延滯期末期與對數期末期改變培養溫度，以提高嗜熱鏈球菌grx02 活菌數和菌活力。

2.4.2 變溫培養研究

2.4.2.1 延滯期末期變溫培養

為研究延滯期末期變溫培養對嗜熱鏈球菌grx02生長的影響，將39 ℃作為起始培養溫度，延滯期末期變溫為37、42 ℃。測定生長曲線、pH 變化曲線及對數末期活菌數，結果如圖7 所示。

圖7 延滯期末期變溫培養對嗜熱鏈球菌grx02 生長及pH 的影響

由圖7 可知，延滯期末期改變培養溫度分別為37、39 、42 ℃時，進入穩定期的培養時間有明顯差異，分別是10.5 、9.5 、8.5 h，表明變溫培養能夠有效的改變菌體的生長周期，且轉變較高溫度培養，能夠縮短培養周期，但不利于生物量的積累，相反37 ℃培養更有利于生物量的積累，活菌數顯著高于其他2 組，為8.99 log CFU/m L。根據pH 變化曲線可知，與其它2組相比，37 ℃變溫培養的pH 下降速率最快，表明其有助于提高嗜熱鏈球菌grx02 的發酵活力，活菌數與發酵活力呈正相關。因此，延滯期末期變溫至37 ℃培養更有利于嗜熱鏈球菌grx02 的生長。

2.4.2.2 對數期末期變溫培養

為研究對數期末期變溫培養對嗜熱鏈球菌grx02生長的影響，將39 ℃作為起始培養溫度，延滯期末期變溫為37 ℃，對數期末期分別變溫為39 ℃、42 ℃。測定生長曲線、pH 變化曲線及對數末期活菌數，結果如圖8 所示。

圖8 對數期末期變溫培養對嗜熱鏈球菌grx02 生長及pH 的影響

由圖8 可知，對照組進入對數末期后，菌體生長速率逐漸減少，而實驗組均出現不同程度的躍升，實驗組菌體密度均有所增加，實驗組的活菌數均高于對照組，其中對數末期變溫至39 ℃培養活菌數最高，為9.04 log CFU/m L。然而由pH 變化曲線可知，對數末期變溫培養對pH 變化沒有顯著的影響。

綜上，嗜熱鏈球菌grx02 最優變溫培養策略是：初始溫度39 ℃，延滯末期改變培養溫度為37 ℃，到達對數末期時變溫為39 ℃，能夠顯著提高嗜熱鏈球菌grx02 活菌數及發酵活力。馮鎮等[18]在研究變溫對嗜熱鏈球菌生長時，也得到了相似的結果。

3 結 論

本研究通過對CDM 成分及濃度的優化，確定了能夠促進嗜熱鏈球菌grx02 增殖的CDM，包括：1 種碳源、16 種氨基酸、6 種維生素、3 種礦物質、4 種無機鹽、2 種有機鹽。又進一步研究溫度對嗜熱鏈球菌grx02 生長的影響，發現采用初始溫度39 ℃，延滯末期改變培養溫度為37 ℃，到達對數末期時變溫為39 ℃的培養方式，能夠顯著提高嗜熱鏈球菌grx02 生物量。優化前嗜熱鏈球菌grx02 生物量達到0.862，通過對化學限定培養基的成分、濃度及菌株培養溫度策略的優化，嗜熱鏈球菌grx02 生物量達到1.40，較優化前提高了1.63 倍，活菌數達到9.04 log CFU/m L。