江漢油田中高溫高礦化度油藏采油功能菌群落結構分析

徐 峰,姚 快,曲瑞雪,牟莎莎,鄧舒元,孫珊珊*,佘躍惠,王正良

(1.江漢油田石油工程技術研究院,湖北 武漢 430000;2.非常規油氣省部共建協同創新中心,湖北 武漢 430100;3.油氣鉆采工程湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430100;4.長江大學石油工程學院,湖北 武漢 430100;5.中國地質大學(北京)能源學院,北京 100083;6.長江大學化學與環境工程學院,湖北 荊州 434000)

稠油是世界原油資源的重要組成部分,與輕質原油相比,其黏度高、流動性差、開采難度較大[1]。江漢油田普通稠油油藏大多屬難動用儲量,難以實現經濟有效的開發。微生物提高原油采收率(microbial enhanced oil recovery,MEOR)技術是一種環境友好、成本較低、高效、可持續作用的方法[2]。油藏是一個寡營養的極端環境,通過向油藏中注入碳源、氮源及磷源等有機或無機營養物質來激活某些內源采油功能菌[3-4],利用內源微生物的繁殖產生代謝物(如小分子有機酸、氣體、生物表面活性劑、生物聚合物等),達到乳化原油、降解原油組分、改變儲層物性等目的,進而提高采收率[5-6]。由于油藏微生物的種類繁多,針對性激活內源采油功能菌、維持微生物高效可持續作用原油是MEOR技術的關鍵。目前,針對稠油油藏的微生物生態學研究是解決該關鍵問題的基礎。鑒于此,作者通過二代測序技術對江漢油田稠油油藏4個中高溫高礦化度區塊采出液中的細菌和古菌群落多樣性進行研究,為后續激活中高溫油藏內源微生物提高原油采收率技術的發展和應用提供理論支撐。

1 實驗

1.1 材料

采出液取自江漢油田的4個中高溫區塊,分別標記為H2-12、Z-2X、YP-9、W-1X;其中,H2-12和Z-2X取自60～70 ℃油藏,YP-9和W-1X取自50 ℃油藏。將采出液樣品放入厭氧瓶中,置于實驗室-4 ℃冰箱中冷藏保存,防止與空氣接觸。

1.2 方法

1.2.1 采出液的離子組成分析

1.2.2 DNA提取與檢測

用無菌磷酸緩沖液沖洗樣品(去除采出液中的原油組分),抽濾,收集樣品中的菌體,提取 DNA,采用瓊脂糖凝膠電泳對其中細菌和古菌的群落組成進行檢測。檢測后樣品置于-20 ℃下保存[8],進行后續分析。

1.2.3 PCR 擴增[9]

采用引物對 338F、806R對細菌16S rRNA基因V3-V4區進行PCR擴增;采用引物對519F(5′-CAGCCGCCGCGGTAA-3′)、915R(5′-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3′)對古菌16S rRNA基因V4-V5區進行PCR擴增。PCR體系為:Q5 high-fidelity DNA polymerase 0.25 μL,5×Reaction Buffer 5 μL,dNTP(10 mmol·L-1)2 μL,模板 DNA 2 μL,正向引物(10 μmol·L-1)1 μL,反向引物(10 μmol·L-1)1 μL,水 8.75 μL。擴增程序為:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min,52 ℃退火1 min,72 ℃延伸10 min,保持4 ℃,30個循環。前引物中的barcode是7個堿基的寡核苷酸序列,用來區分同一文庫中的不同樣品。PCR 采用 NEB Q5 DNA 高保真聚合酶,用 2%瓊脂糖凝膠對擴增產物進行電泳;切取目的片段,并用 Axygen 凝膠回收試劑盒回收。

在Microplate Reader(BioTek,FLx800)上利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit對PCR產物進行定量,然后將每個樣品按照其所需的數量進行混合。

1.2.4 文庫構建

利用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit構建文庫。首先利用試劑盒中的EndRepair Mix2將DNA 5′端突出的堿基切除,然后將3′端缺失的堿基補齊,同時在5′端加上1個磷酸基團,進行末端修復。

2 結果與討論

2.1 采出液的離子組成

4種樣品的離子組成如表1所示。

表1 4種樣品的離子組成/(mg·L-1)

2.2 細菌群落組成分析

2.2.1 物種分類學注釋

采用QIIME2的classify-sklearn算法[10](https://github.com/QIIME2/q2-feature-classifier),具體步驟如下:對于每個ASV(擴散序列變異)的特征序列或每個OTU(操作分類單元)的代表序列,在QIIME2軟件中使用默認參數,使用預先訓練好的Naive Bayes分類器進行物種注釋,即與參考序列數據庫進行比對,根據比對結果進行打分判定。通過16S rDNA測序,對4種樣品中的細菌進行分類學統計及多樣性揭示,物種分類學注釋結果如圖1所示。

圖1 4種樣品中細菌的分類學注釋Fig.1 Taxonomic notes on bacteria in four samples

從圖1可知,H2-12樣品中細菌種類最多,其次是W-1X樣品,Z-2X樣品中細菌種類最少,不足H2-12樣品中的一半。

2.2.2 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性指在一個生態系統內或者特定區域內反映物種豐度和均勻度的綜合指標[11]。4種樣品中細菌的稀疏曲線如圖 2 所示。

從圖2可知,隨著測序深度的增加,4種樣品中細菌群落的ASV/OTU總數均先增加后逐漸趨于穩定,說明測序深度合適、取樣合理。4種樣品中細菌群落的Alpha 多樣性指數如表2所示。

圖2 4種樣品中細菌的稀疏曲線Fig.2 Sparse curves of bacteria in four samples

表2 4種樣品中細菌群落的Alpha多樣性指數

Chao1和Observed species指數表征豐度,Shannon和Simpson指數表征多樣性[12]。從表2可知,H2-12樣品的Chao1、Shannon和Observed species指數均最高,分別為655.106、5.510 76和652.1,其Simpson指數為 0.927 947,僅次于YP-9樣品的Simpson指數(0.938 390),表明H2-12樣品的物種豐度和多樣性均最高;Z-2X樣品的Chao1、Shannon和Observed species指數均最低,表明Z-2X樣品的物種豐度和多樣性均最低,這與物種分類學注釋結果一致。

2.2.3 Beta多樣性分析

Beta多樣性聚類分析多采用層次聚類(hierarchical clustering)法,以等級樹的形式展示樣本間的相似度,通過聚類樹的分枝長度衡量聚類效果。聚類分析可以采用任何距離評價樣本之間的相似度。 4種樣品中細菌群落在屬水平上的層次聚類分析結果如圖 3所示。

從圖3可知,YP-9和H2-12樣品的距離最近,且同為一支,說明YP-9和H2-12樣品中細菌的微生物群落最為相似;W-1X 樣品屬于單獨一支,離其它樣品較遠,說明W-1X樣品與其它樣品中細菌的微生物群落差距較大。

圖 3 4種樣品中細菌群落在屬水平上的層次聚類分析Fig.3 Hierarchical clustering analysis of bacterial communities in four samples at genus level

2.2.4 物種組成分析

高通量測試結果通過BLAST比對后,將4種樣品的細菌群落組成在門水平和屬水平上進行分類統計,結果如圖4所示。

圖 4 4種樣品在門水平(a)和屬水平(b)的細菌群落組成Fig.4 Bacterial community composition of four samples at phylum level(a) and genus level(b)

從圖4a可知,在門水平上,Proteobacteria在4種樣品中占有絕對優勢,占比在53%～96%之間。研究[13-14]發現,Proteobacteria在自然水體、人工水體中均占比較大,在污水處理及氮磷形態轉換方面具有十分重要的作用 。H2-12 和 Z-2X 樣品中還有較多的Firmicutes(33%、42%)。

從圖4b可知,在屬水平上,4種樣品的細菌群落主要由Pseudomonas(9%～47%)、Thauera(0%～52%)、Halobacillus(0%～27%)、Marinobacter(0%～30%)、Acinetobacter(1%～12%)、Hydrogenophilus(0%～13%)、Rehaibacterium(0%～10%)、Oligoflexus(0%～4%)、Tepidiphilus(0%～5%)和Methylobacterium(0%～4%)組成。

其中,H2-12和YP-9樣品中細菌的優勢菌群為Pseudomonas(29%、47%)、Halobacillus(27%、8%)和Acinetobacter(12%、7%)。Pseudomonas是革蘭氏陰性好氧棒狀細菌,能從大多數環境中分離出來,可產鼠李糖脂型表面活性劑,具有降解石油烴、驅油、修復烴類污染、降黏等作用。馬鑫等[15]研究發現,Pseudomonasaeruginosa發酵液在模擬實驗中的驅油率較水驅提高了33.5%。Halobacillus屬于芽孢桿菌科(Bacillaceae),分離自鹽湖、鹽土、海洋太陽能鹽場等高鹽環境中,屬嗜鹽菌。Halobacillusspp.在石油烴類化合物的生物降解中具有重要作用[16]。Acinetobacter具有代謝多樣性,能降解己內酰胺、除草劑、有機磷農藥和多種石油烴組分等,可產鼠李糖脂型表面活性劑,也可進行反硝化和氨氧化作用。

W-1X樣品中細菌的優勢菌群為Thauera(52%)、Hydrogenophilus(13%)和Rehaibacterium(10%)。Thauera屬于脫氮菌,在反硝化系統運行 51 d以上時,Thauera的相對豐度在 60%以上[17-18]。

Z-2X樣品中細菌的優勢菌群為Pseudomonas(13%)和Marinobacter(30%)。Marinobacter是目前國外報道較多的一類能夠耐高鹽環境的反硝化微生物,具有潛在的工業應用價值[19-21]。

2.2.5 代謝通路分析

微生物生態學研究也需要關注菌群所具備的功能潛能,了解檢測樣本中菌群功能潛能的概況,能最大化擴增子測序性價比高的優勢,此外,分析結果或許還能幫助指導后續實驗的設計(如宏基因組測序)。獲得的功能單元可以依據代謝通路數據庫和一定的計算方法獲得代謝通路的豐度。4種樣品中的細菌代謝通路主要分為生物合成、降解/利用/同化、脫毒、前體代謝物和能量的產生、聚糖途徑、高分子修飾和代謝簇。通過對4種樣品中細菌群落的代謝通路分析可知,生物合成中豐度最高的是輔因子、輔基、電子載體、維生素生物合成和氨基酸生物合成;降解/利用/同化中豐度最高的是芳香族化合物降解、碳水化合物降解及核苷和核苷酸降解;前體代謝物和能量的產生中豐度最高的是TCA循環和發酵作用。

2.3 古菌群落組成分析

2.3.1 物種分類學注釋

通過16S rDNA測序,對4種樣品中的古菌進行分類學統計及多樣性揭示,物種分類學注釋結果如圖5所示。

圖5 4種樣品中古菌的分類學注釋Fig.5 Taxonomic notes on archaea in four samples

從圖5可知,H2-12樣品中古菌種類最多,這與細菌的物種分類學注釋結果一致,其次是YP-9樣品,W-1X樣品中古菌種類最少。4種樣品中古菌種類均高于細菌種類,表明樣品中古菌種類很豐富。

2.3.2 Alpha多樣性分析

4種樣品中古菌的稀疏曲線如圖6所示。

圖6 4種樣品中古菌的稀疏曲線Fig.6 Sparse curve of archaea in four samples

從圖6可知,隨著測序深度的增加,4種樣品中古菌群落的ASV/OTU總數均先增加后逐漸趨于穩定,說明測序深度合適,取樣數量合理,取樣數量更多只會產生少量新的OTU。

4種樣品中古菌群落的Alpha多樣性指數如表3所示。

表3 4種樣品中古菌群落的Alpha 多樣性指數

從表3可知,H2-12樣品的物種豐度最高,Chao1和Observed species指數分別為823.511和761.7,這與物種分類學注釋結果一致;YP-9樣品的物種多樣性最高,Shannon和Simpson指數分別為5.127 64和0.917 360;W-1X樣品的物種豐度和多樣性均最低。根據Chao1和Observed species指數可知,4種樣品中古菌群落的豐度均高于細菌群落。

2.3.3 Beta多樣性分析

4種樣品中古菌群落在屬水平上的層次聚類分析結果如圖7所示。

圖7 4種樣品中古菌群落在屬水平上的層次聚類分析Fig.7 Hierarchical clustering analysis of archaea communities in four samples at genus level

從圖7可知,Z-2X和H2-12樣品的距離最近,且同為一支,說明Z-2X和H2-12樣品中古菌的微生物群落最為相似;W-1X樣品屬于單獨一支,離其它樣品較遠,說明W-1X 樣品與其它樣品中古菌的微生物群落差距較大。

2.3.4 物種組成分析

4種樣品在門水平和屬水平的古菌群落組成如圖8所示。

圖8 4種樣品在門水平(a)和屬水平(b)的古菌群落組成Fig.8 Archaea community composition of four samples at phylum level(a) and genus level(b)

從圖8a可知,在門水平上,4種樣品的古菌群落主要以Euryarchaeota(29%～96%)為主;此外,H2-12樣品中的優勢菌門還有Crenarchaeota(11%),Z-2X樣品中的優勢菌門還有Thaumarchaeota(5%)。

從圖8b可知,在屬水平上,4種樣品的古菌群落主要由Halogeometricum(0%～69%)、Methanobacterium(0%～36%)、Methanothermobacter(0%～22%)、Salinarchaeum(0%～17%)、Halogranum(0%～9%)、Nitrososphaeraceae(0%～5%)、Methanohalophilus(0%～5%)、Methanohalobium(0%～4%)、Halodesulfurarchaeum(0%～1%)和Halapricum(0%～1%)組成。

W-1X樣品中古菌的優勢菌群主要為Salinarchaeum(17%)、Halodesulfurarchaeum(1%)和Halapricum(1%)。Salinarchaeum和Halapricum均為嗜鹽菌屬,能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,是一種較強的SRB抑制劑。Halapricum由革蘭氏染色陰性的球狀或卵球形多形性細胞組成,在含2.5～5.1 mol·L-1NaCl的培養基中生長,最適生長溫度為37 ℃。Halodesulfurarchaeum隸屬于嗜鹽菌綱,由專性厭氧、極端嗜鹽的廣古菌門組成,以單質硫、二甲基亞砜或硫代硫酸鹽為電子受體,通過 H2或甲酸氧化生長。

2.3.5 代謝通路分析

通過對4種樣品中古菌群落的代謝通路分析可知,生物合成中豐度最高的是核苷和核苷酸生物合成,其次是氨基酸生物合成;降解/利用/同化中豐度最高的是C1化合物利用與同化;前體代謝物和能量的產生中豐度最高的是TCA循環和發酵作用,這與細菌群落中的前體代謝物和能量的產生豐度是一致的。

3 結論

利用二代測序技術對江漢油田普通稠油油藏的4個采出液樣品中的細菌和古菌群落組成進行了多樣性分析。物種分類學注釋結果表明,H2-12樣品中的微生物種類最多,4種樣品中古菌種類均高于細菌種類,表明樣品中古菌種類很豐富。Alpha多樣性分析結果表明,4種樣品中古菌群落的豐度均高于細菌群落。在門水平上,細菌群落主要以Proteobacteria(53%～96%)為主;古菌群落主要以Euryarchaeota(29%～96%)為主。在屬水平上,細菌的優勢菌群主要為Pseudomonas(9%～47%)、Thauera(0%～52%)、Halobacillus(0%～27%)和Marinobacter(0%～30%);古菌的優勢菌群主要為Halogeometricum、Methanobacterium和Methanothermobacter。細菌群落組成分析可知,4種樣品中的內源微生物群落均具有降黏和脫氮的性能,表明江漢油田內源微生物具有降黏和脫氮的巨大潛力,可通過不同培養基富集篩選高效的降黏和脫氮菌株,進而大大提高江漢油田的原油采收率。