Aβ25～35致阿爾茨海默病小鼠的腦海馬組織炎癥因子及BDNF表達分析

陸 雯,任錦燁,何湘偉,唐 亮,李建明△

(長沙醫學院：1.臨床學院;2.神經變性病基礎與臨床湖南省高校重點實驗室,長沙 410219)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)以進行性的學習和記憶功能下降為主要臨床表現[1],65歲以上人群AD的發病率約為5%[2]。AD的發病機制尚不明確,腦內局部炎癥被認為是AD發生、發展的重要因素[3-4]。目前,神經膠質細胞尤其是小膠質細胞的活化在神經炎癥中的作用已被廣泛證實[5]。腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)在哺乳動物海馬的發育、營養支持和神經可塑性中起著重要作用[6]。研究表明,BDNF或其受體酪氨酸激酶受體(tropomyosin-related kinase B,TrkB)水平降低的動物存在行為缺陷[7]。BDNF誘導缺失的小鼠涉及前腦包括皮質、海馬體和杏仁核特異性缺失[8]。此外,研究表明BDNF與AD、帕金森病和神經退行病變相關[9-11]。AD和帕金森病患者BDNF mRNA和蛋白表達降低[12-13]。但在AD動物模型中,BDNF表達趨勢說法不一致。本研究通過雙側腦室注射β-淀粉樣蛋白25～35(amyloid β-protein 25-35,Aβ25～35)構建AD樣小鼠模型,采用蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色、ELISA、Western blot、免疫組織化學、實時熒光定量逆轉錄PCR(real-time quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)等方法,探討Aβ25～35腦內注射對炎癥因子及BDNF表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物及分組

動物實驗均在長沙醫學院神經科學與行為研究中心完成。動物實驗過程遵循道德標準和《赫爾辛基宣言》,研究過程得到了長沙醫學院動物倫理委員會的批準。取40只6周齡雄性昆明小鼠(長沙天勤生物科技有限公司),均置于可控條件下飼養,溫度(23.0±0.6)℃,相對濕度(55±8)%,光暗周期12 h∶12 h。采用隨機數字表法,將小鼠分為4組(各10只),均采用單次雙側腦室注射Aβ25～3520 mg/kg建立AD小鼠模型,注射后分別觀察0 d(0 d組)、7 d(7 d組)、14 d(14 d組)和28 d(28 d組)。

1.1.2主要儀器與試劑

小鼠腦立體定位儀(安徽正華生物儀器設備有限公司)、Y迷宮(上海欣軟信息科技有限公司),新物體識別(new object recognition,NOR)儀(上海然哲儀器設備有限公司)。Aβ25～35(美國Sigma公司),BSA(瑞士Roche公司),BCA蛋白測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司),二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司),HE染液(上海源葉生物科技有限公司),抗磷酸化tau(p-Tau)抗體、抗CD11b抗體、抗BDNF抗體(英國Abcam公司),山羊抗兔IgG抗體(江蘇親科生物研究中心有限公司),SuperScript VILOTMcDNA試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)。HieffTM qPCR SYBR?Green Master Mix(大連TaKaRa公司);白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA檢測試劑盒(日本Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1Y迷宮

Y迷宮由3個相同的臂以120°相互連接組成,從一個中央平臺向外輻射。將小鼠放置在一只臂末端,并讓其在5 min內自由接觸所有臂,記錄5 min 內每只小鼠在各個臂的穿梭次數。小鼠進入每個臂的標準為四肢完全進入。小鼠依次進入3個不同臂是1個正確的交替;而每次探索中有2個臂未進入時,則為1個錯誤的交替。計算正確交替百分比,正確交替百分比=正確交替數/總交替數× 100%。

1.2.2NOR

測試儀器由一個黑色有機玻璃盒子組成,放置在光線昏暗的測試室內。測試中使用A、B、C 3個物體,其中A、B一樣,C與A、B不同。小鼠在裝置內(無物體)自由運動10 min,再放入A、B物體,A、B均無氣味且固定,距離兩側壁約10 cm。將小鼠背朝物體從距物體等距離處放入裝置中,記錄小鼠在3 min內探索每個物體的時間(用鼻子在1 cm半徑內嗅探物體和/或觸摸物體)。間隔24 h后將A、B其中一個替換成C,以同樣的方式將小鼠放入裝置中3 min,記錄小鼠在3 min內探索每個物體的時間。計算區分新物體和熟悉物體的辨別指數(discrimination index,DI),DI=(探索新物體的時間-探索熟悉物體的時間)/(探索新物體的時間+熟悉物體的時間)×100%。

1.2.3組織采集

采用0.4%戊巴比妥鈉進行腹腔注射麻醉,斷頭取腦。左側半腦組織(n=10)置于4%多聚甲醛中用于形態學分析;右側半腦取海馬組織(n=10)快速凍存于液氮,繼而置于-80 ℃冰箱中用于生化分析。

1.2.4HE染色

將小鼠左側半腦組織浸蠟包埋,蠟塊修整后切片。于40 ℃溫水中攤平組織, 60 ℃烤箱烘干。切片于蘇木素染5 min, 加入1%鹽酸乙醇、0.6%氨水,再于伊紅染液中染色3 min;經梯度乙醇干燥后,置于二甲苯中使組織透明,中性樹膠封片。光鏡下計數海馬神經元數量(個/mm2)。

1.2.5免疫組織化學染色

半腦組織切片復溫30 min,加入3%過氧化氫(H2O2)溶液去除內源性過氧化物酶;再置于含5%正常馬血清的反應管,搖床上室溫孵育2 h,封閉組織中的非特異性抗原位點。加入一抗[抗p-tau(1∶800)、抗CD11b(1∶1 000)、抗BDNF(1∶1 000)],室溫搖床孵育2 h,4 ℃搖床孵育過夜。每張組織切片加80 μL山羊抗兔IgG抗體,37 ℃孵育50 min;0.05% DAB覆蓋染色,預孵3 min后依次加入0.03% H2O2,避光顯色;浸泡于蘇木素染液中染色后,流水沖洗。將組織切片浸入弱堿性溶液中返藍,依次經 80%、90%、100%、100%梯度乙醇脫水,置于二甲苯中2次使組織透明。組織切片在每個梯度浸沒8～10 min;自然風干,隨后用中性樹脂封片保存。采用Ckx53倒置顯微鏡(日本Olympus公司)以200倍倍率拍攝光學顯微鏡圖像。采用Image-Pro Plus6.0軟件(美國Media Cybernetics公司)分析免疫反應物(p-tau、CD11b、 BDNF)的光密度值。

1.2.6ELISA

將海馬組織制成10%的勻漿,4 ℃下4 500 r/min離心10 min,收集上清液。采用ELISA試劑盒檢測海馬組織中IL-1β和TNF-α表達水平。檢測在DR-200Bs酶標儀(深圳DiaTek公司)中完成,過程嚴格按照說明書操作。

1.2.7RT-qPCR

采用TRIZOL(美國Invitrogen公司)分離海馬組織總RNA,用UV-9000紫外分光光度計(上海精密儀器有限公司)測定RNA水平和完整性。采用DNase純化總RNA,cDNA用SuperScript VILOTMcDNA試劑盒合成。采用HieffTM qPCR SYBR?Green Master Mix在LightCycler?2.0上進行RT-qPCR。以β-actin作為標準內參, BDNF mRNA相對表達水平按照2-ΔΔCt法進行計算。

1.2.8Western blot

采用BCA蛋白測定試劑盒分析腦組織標本總蛋白水平。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)80 V下電泳1 h,使用Trans-Blot?TurboTM(美國Bio-Rad公司)將蛋白轉移到膜上?？偟鞍追謩e與兔抗小鼠BDNF單克隆抗體(1∶1 000,英國Abcam公司)、兔抗小鼠β-actin單克隆抗體(1∶1 000,英國Abcam公司)在4 ℃過夜,然后用山羊抗兔IgG抗體(1∶8 000)在室溫下放置2 h,電化學發光(ECL)液曝光。使用Image-Pro Plus6.0軟件(美國Media Cybernetics公司)分析BDNF蛋白灰度值,與內參β-actin比值后進行統計學分析。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 Aβ25～35可損傷小鼠記憶和認知功能

Y迷宮測試結果顯示,各組間穿梭次數無明顯差異(P>0.05),見圖1A。與0 d組相比,14 d、28 d組正確交替百分比明顯降低(P<0.05),7 d組與0 d組正確交替百分比無明顯差異(P>0.05),見圖1B。NOR測試結果顯示,各組的總探索時間無明顯差異(P>0.05),見圖1C。與0 d組相比,14 d、28 d組小鼠DI明顯降低(P<0.05),7 d組與0 d組DI無明顯差異(P>0.05),見圖1D。

A：Y迷宮測試穿梭次數;B：Y迷宮測試的正確交替百分比;C：NOR測試的總探索時間;D：NOR測試階段的辨別指數;a：P<0.05,與0 d組比較。

2.2 Aβ25～35可損傷神經元和增加p-tau表達

HE染色結果顯示,0 d組海馬細胞排列規則,邊緣清晰,細胞核及核仁清晰,見圖2A;7 d、14 d、28 d組海馬細胞排列不規則,結構模糊,細胞核收縮,染色深,見圖2B～D。與0 d組相比,14 d、28 d組小鼠海馬組織神經元數量明顯減少(P<0.05),7 d組神經元數量與0 d組比較無明顯差異(P>0.05),見圖2E。免疫組織化學結果顯示,與0 d組相比,7 d組小鼠海馬區p-Tau表達光密度值無明顯差異(P>0.05),14 d、28 d組小鼠海馬區p-Tau表達光密度值明顯升高(P<0.05),見圖2F～J。

A～D：分別為0 d、7 d、14 d、28 d組HE染色;E：各組神經元數量比較;F～I：分別為0 d、7 d、14 d、28 d組p-tau免疫組織化學染色;J：各組p-tau表達光密度值比較;a：P<0.05,與0 d組比較。

2.3 Aβ25～35可活化小膠質細胞和增加TNF-α、IL-1β表達

免疫組織化學結果顯示,與0 d組相比, 14 d、28 d組小鼠海馬CD11b光密度值明顯增加(P<0.05),見圖3。ELISA結果顯示,與0 d組相比, 14 d、28 d組小鼠海馬組織IL-1β和TNF-α表達水平明顯升高(P<0.05),見表1。

A～D：分別為0 d、7 d、14 d、28 d組CD11b免疫組織化學染色;E：各組CD11b表達光密度值比較;a：P<0.05,與0 d組比較。

表1 小鼠海馬組織TNF-α和IL-1β表達水平比較

2.4 Aβ25～35可影響BDNF表達

與0 d組相比,7 d組小鼠海馬組織BDNF mRNA和蛋白表達水平明顯升高(P<0.05),14 d、28 d組小鼠海馬組織BDNF mRNA和蛋白表達水平明顯降低(P<0.05),見圖4。

A～D：分別為0 d、7 d、14 d、28 d組BDNF免疫組織化學染色;E：各組BDNF表達光密度值比較;F：各組BDNF mRNA相對表達水平比較;G：各組BDNF表達SDS-PAGE圖;H：各組BDNF相對表達水平比較;a：P<0.05,與0 d組比較。

3 討 論

AD的病因復雜,神經炎癥是AD發生、發展的主要因素之一,也是AD重要的治療靶點之一[14]。目前,神經膠質細胞特別是小膠質細胞在神經炎癥中的作用已成為研究熱點。研究表明,由小膠質細胞激活引起的炎癥反應是神經損傷的主要原因之一,亦是神經退行性疾病發病的重要機制之一[15-17]。大量研究表明,在AD患者大腦皮質的神經炎性斑塊病灶周圍存在大量激活的小膠質細胞[18-19]。小膠質細胞是炎癥反應與中樞神經系統疾病相互作用的載體。IL-1β和TNF-α是促使小膠質細胞進入活躍狀態并引起免疫反應的重要因子。在AD發展過程中,Aβ聚合物可通過核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLPR3)炎性小體與小膠質細胞結合,從而釋放出IL-1β和TNF-α等炎癥因子及神經毒性物質[20-22]。本研究結果顯示,Aβ25～35處理小鼠后,腦海馬組織小膠質細胞被大量激活,并有大量IL-1β和TNF-α表達,從而引起Tau蛋白磷酸化增加,神經元結構受損,最終損傷了小鼠記憶和認知功能,這與既往研究[23]有一定相似性。大量研究認為,基于小膠質細胞在神經炎癥反應中的作用對AD進行治療是可行的。非甾體抗炎藥可以抑制小膠質細胞活化并減少活化小膠質細胞積累[24]。具有抗氧化特性的酚類化合物,如橄欖苦苷和表沒食子兒茶素沒食子酸酯也被報道可抑制小膠質細胞活性,緩解神經炎癥反應及AD樣癥狀[25]。此外,中藥及中藥提取物如片仔癀[26]、石菖蒲提取物[27]、小續命湯提取物[28]等均可抑制小膠質細胞活性,從而減輕AD小鼠神經炎癥反應并緩解認知功能障礙。上述研究提示,抑制小膠質細胞炎癥可能有利于AD癥狀的改善。

臨床研究表明,AD患者會逐漸出現學習和記憶能力下降,并最終發展為行為障礙和人格缺陷[29]。BDNF具有增強突觸可塑性的作用,這與學習能力和記憶形成及存儲有著密不可分的關系。研究證實AD患者腦組織內BDNF水平可發生明顯改變[30]。BUCHMAN等[31]研究發現,腦組織BDNF水平與老年個體生前認知能力的衰退速度呈負相關。REX等[32]研究發現,AD患者BDNF及其受體(TrkB)隨著年齡的增長而減少;同時還表明,Aβ在體內外均影響BDNF的產生及其信號通路。此外,AD動物模型研究也發現腦內BDNF表達趨勢呈現多樣化。敖平等[33]研究發現,Aβ-AD大鼠模型組BDNF表達明顯低于對照組;外源添加BDNF后,可增加BDNF的表達水平。巴迎春等[34]研究發現,腦內局部炎癥時,BDNF在海馬CA1區的表達先升后降。本研究發現,Aβ25～35處理小鼠7 d后BDNF表達水平明顯升高,而處理14、28 d后BDNF表達水平較0 d組明顯降低。Aβ可激活小膠質細胞引起炎癥反應,誘發氧化應激產生氧自由基,促進細胞凋亡及細胞內鈣穩態失衡,導致神經元變性[35]。體內也存在對Aβ的清除機制,BDNF可保護神經元免受Aβ損傷。ARANCIBIA等[36]研究表明,在小鼠體內及體外研究中均可觀察到BDNF對Aβ聚集沉積所致的神經毒性有保護作用。上述結果提示,Aβ25～35處理的0～7 d為急性損傷期,神經元損傷較嚴重,為抵御外來異物刺激,維持神經元存活,內源性BDNF表達水平明顯升高,但具體機制尚不明確?？赡芘cBDNF通過結合TrkB激活信號傳導,調節鈣離子表達,拮抗自由基損傷,提升細胞內抗氧化酶活性等,從而促進細胞修復、抑制細胞凋亡有關。

綜上所述,Aβ25～35可損傷小鼠記憶和認知功能,其可能通過活化小膠質細胞,增加TNF-α、IL-1β及p-tau的表達實現。此外,AD樣小鼠腦海馬區損傷早期BDNF表達升高,而損傷中晚期表達降低。