生長激素對結腸癌細胞侵襲和遷移的影響

蔣皓天,汪 攀,廖 彬,龔 勝,吳 南△

(1.重慶醫科大學,重慶 400016;2.中國科學院重慶綠色智能技術研究院,重慶 400714;3.中國科學院大學重慶學院,重慶 400714;4.重慶市人民醫院神經外科,重慶 401147)

生長激素(growth hormone,GH)型垂體腺瘤是垂體腺瘤中的常見類型,約占垂體腺瘤的20%～30%,其特征是GH持續分泌過多,并伴隨胰島素樣生長因子-1(IGF-1)升高,作用于全身組織,導致全身性神經內分泌綜合征[1-3]。兒童期與青春期患病由于GH分泌過多可導致骨骺閉合延遲、長骨生長加速,發展為巨人癥;成年后患病因骨骺已閉合則表現為面容改變及手足肢端增粗,發展為肢端肥大癥。研究表明,GH型垂體腺瘤患者相較于健康人群,患癌風險增加,尤其是結直腸癌、甲狀腺癌、乳腺癌、前列腺癌和血液系統惡性腫瘤[4-8]。已有研究發現,GH型垂體腺瘤可通過分泌GH影響乳腺癌血管生成、干性表達和化療耐藥性,并被證實在乳腺癌的發生、發展和轉移中起重要作用[9]。對于同時患有GH型垂體腺瘤的結腸癌患者,過量分泌的GH是否也會促進結腸癌浸潤及轉移有待進一步探討。據此,本研究擬通過體外研究探討GH對人結直腸腺癌LoVo細胞增殖、侵襲和遷移的影響,同時分析GH在結腸癌中的調控及分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與材料

人結直腸腺癌LoVo細胞株購自中國科學院上海細胞生物所細胞庫;GH型垂體瘤GH3細胞株購自武漢普諾賽生命科技有限公司;重組人GH購自美國Pepro Tech公司;胎牛血清、DMEM高糖培養基、0.25%胰酶消化液購自美國Gibco公司;基質膠、Transwell小室購自美國Corning公司;GH ELISA檢測試劑盒購自美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養

LoVo細胞采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基,于飽和濕度、37 ℃、5% CO2培養箱中培養,貼壁生長。GH3細胞采用含15%馬血清和2.5%胎牛血清的F12培養基,于飽和濕度、37 ℃、5% CO2培養箱中培養,貼壁生長。取對數生長期的細胞用0.25%胰酶消化液消化,經臺盼藍染色確定活細胞計數在95%以上,收集細胞。

1.2.2ELISA法檢測GH3細胞培養上清液中GH濃度

將GH3細胞培養72 h,收集上清液,500×g離心5 min去掉細胞碎片。標準品或標本100 μL加入96孔板中,37 ℃孵育1 h;吸取上清液后加入100 μL檢測溶液A,37 ℃孵育1 h;洗板3次后,加入100 μL檢測溶液B,37 ℃孵育30 min;洗板3次后,加入90 μL 3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺(TMB)底物溶液,37 ℃避光顯色10～20 min,加入50 μL終止液后用酶標儀檢測其450 nm處吸光度[A(450)]值。根據標準品A值,建立濃度-A值標準曲線,計算出GH3細胞培養上清液中的GH濃度。

1.2.3CCK-8法確定GH最佳干預濃度

取對數生長期的LoVo細胞,調整細胞濃度為1×104/mL,接種于96孔板,每孔加入100 μL細胞懸浮液。培養24 h后,分別加入0、50、200、400 ng/mL的重組人GH,每個濃度設置5個復孔。培養48 h后,每孔加入10 μL的CCK-8溶液,酶標儀檢測A(450)值。

1.2.4流式細胞術檢測細胞周期

取對數生長期LoVo細胞隨機分為對照組和實驗組,對照組中加入磷酸鹽緩沖液(PBS),實驗組中加入最佳干預濃度的重組人GH,兩組細胞在相同條件下體外培養48 h,后續實驗均以此分組。收集兩組細胞,用預冷的PBS洗滌1次,離心棄上清液。加入預冷的無水乙醇,混勻,4 ℃固定過夜。加入預冷的PBS洗滌1次,離心棄上清液。加入100 μL RNaseA,混勻,37 ℃水浴30 min。加入400 μL的碘化丙啶(PI)溶液,混勻,4 ℃避光孵育30 min。流式細胞儀在波長488 nm處進行細胞周期分析。

1.2.5Transwell實驗檢測細胞侵襲、遷移能力

細胞侵襲能力檢測：將基質膠在4 ℃冰箱過夜融化。在冰上用預冷的槍頭吸取基質膠加入冰上預冷的無血清培養基中,充分混勻,稀釋基質膠至1 mg/mL。取Transwell小室放入24孔板中,取稀釋的基質膠100 μL加入小室上室,37 ℃孵育30 min,將小室四周多余的基質膠洗出,繼續于37 ℃孵育,使基質膠聚合成膠備用。收集對照組和實驗組細胞,用PBS和無血清培養基先后洗滌一次,細胞計數后,用無血清培養基將細胞懸液調整為2×105/mL。在下室中加入500 μL含10%胎牛血清的培養基,在上室中加入200 μL各組細胞懸液。培養24 h后,取出小室,PBS洗滌2次,甲醇固定15 min,結晶紫染色10 min,PBS洗滌,棉簽擦去小室中細胞,晾干后剪下小室的膜并用中性樹脂封片,鏡下觀察。細胞遷移能力檢測除不加基質膠外,其余實驗步驟同上述相同。

1.2.6Western blot檢測上皮間質轉化 (epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關蛋白表達

收集對照組和實驗組細胞,提取總蛋白并用二奎琳甲酸(BCA)定量試劑盒測量蛋白濃度,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)1 h分離蛋白,再冰浴電轉2 h至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。10% 脫脂奶粉室溫封閉 2 h。洗滌膜,一抗β-actin(1∶2 000稀釋)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin,1∶1 000稀釋)、 N-鈣黏蛋白(N-cadherin,1∶1 000稀釋)、波形蛋白(Vimentin,1∶1 000稀釋)和蝸牛蛋白-1(Snail-1,1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜,洗滌膜,二抗(1∶2 500稀釋)室溫孵育2 h,洗滌膜,于化學發光成像分析儀中曝光,拍照。分析蛋白條帶灰度值,以β-actin為內參。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 ELISA法檢測GH3細胞上清液中GH濃度

ELISA結果顯示GH3細胞培養上清液中GH濃度為(1 208±9)ng/mL。

2.2 GH對LoVo細胞增殖能力的影響

CCK-8法結果顯示0、50、200、400 ng/mL各濃度GH組A(450)值分別為(0.994±0.025)、(1.084±0.051)、(1.259±0.051)、(1.284±0.009)。與0 ng/mL GH組比較,各濃度GH組A(450)值均增加,差異有統計學意義(P<0.05)。當GH濃度達到400 ng/mL GH后,與200 ng/mL GH組比較,A(450)值差異無明顯變化(P>0.05),因此選擇GH濃度200 ng/mL進行后續實驗,見圖1。

a：P<0.05,與0 ng/mL組比較。

2.3 GH對LoVo細胞周期的影響

流式細胞術實驗結果顯示,與對照組比較,實驗組中細胞周期從G1期向S期和G2轉變,G1期細胞比例下降,S期、G2期細胞比例升高,差異有統計學意義(P<0.05),見圖2。

A：流式細胞圖;B：流式細胞術定量分析圖。a：P<0.05。

2.4 GH對人結直腸腺癌LoVo細胞侵襲和遷移的影響

Transwell侵襲實驗結果顯示,對照組穿膜細胞數量為(204±6)個,實驗組穿膜細胞數量為(385±6)個,實驗組穿膜細胞數量較對照組明顯增加,差異有統計學意義(P<0.001),見圖3。Transwell遷移實驗結果顯示,對照組穿膜細胞數量為(192±5)個,實驗組穿膜細胞數量為(447±9)個,實驗組穿膜細胞數量較對照組明顯增加,差異有統計學意義(P<0.001),見圖4。

A：Transwell侵襲實驗圖;B：Transwell侵襲實驗定量分析圖。a：P<0.001。

A：Transwell遷移實驗圖;B：Transwell遷移實驗定量分析圖。a：P<0.001。

2.5 GH對LoVo細胞EMT相關蛋白表達的影響

Western blot實驗結果顯示,與對照比較,實驗組細胞中N-cadherin、Vimentin和Snail-1表達水平上調,E-cadherin表達水平下調,差異有統計學意義(P<0.05,P<0.001),見圖5。

A：Western blot圖;B：Western blot定量分析圖。a：P<0.01;b：P<0.001。

3 討 論

垂體分泌GH可通過膜相關生長激素受體(GHR)直接或間接作用于外周組織[10]。研究發現,GH不會直接導致正常細胞轉變成惡性細胞,但它可以通過縮短細胞周期,加速DNA斷裂修復的時間來增加基因突變風險,同時促進細胞增殖、EMT和血管生成,并抑制細胞凋亡來促進腫瘤進展[6]。從動物模型到流行病學再到臨床研究,目前已有大量證據顯示GH與致癌相關。相反,通過對誘導GH缺乏或破壞GHR的動物模型的研究,以及對患有先天GHR信號傳導缺陷人群的調查發現,GH缺乏可抑制惡性腫瘤的發生及進展[11-13]。侏儒綜合征(Laron綜合征)是一種GHR或受體后信號通路相關基因突變所致的先天性GH不敏感疾病[14]。在對637例Laron綜合征患者的長期隨訪中發現,Laron綜合征患者中未發現惡性腫瘤病例,而其親屬惡性腫瘤發病率>20%。與一般人群比較,Laron綜合征患者惡性腫瘤發病率明顯降低,先天性GH不敏感可抑制惡性腫瘤的發生[7]。結直腸癌是世界第三大常見癌癥,與一般人群比較,GH型垂體腺瘤患者患結直腸癌風險更高且所患結直腸癌的惡性程度較高[15-16]。為探討GH型垂體腺瘤對結腸癌的影響,本研究對GH型垂體腺瘤GH3細胞培養上清液進行ELISA檢測,結果提示GH3細胞分泌大量GH[(1 208±9)ng/mL],遠超健康成人血清濃度(<2 ng/mL)。因此,與一般人群比較,高濃度的GH可能是促進GH型垂體腺瘤患者結腸癌浸潤及轉移的重要原因。為驗證這一假說,本研究對LoVo細胞進行體外培養,并加入一定濃度的GH處理,探討GH對LoVo細胞的影響。為確定實驗所用GH的最佳濃度及GH對LoVo細胞增殖的影響,本研究使用不同濃度的GH處理LoVo細胞,并通過CCK-8法檢測細胞增殖活性,結果提示GH可促進LoVo細胞增殖,并在一定濃度范圍內呈劑量依賴性。受GHR飽和效應影響,當GH濃度達到400 ng/mL后,GH的促增殖效應不再增加。因此選擇200 ng/mL GH濃度進行后續實驗。此外,本研究發現GH可改變LoVo細胞周期,促進腫瘤細胞從G1期向S期和G2轉變,促進有絲分裂。雖然GH是否影響腫瘤細胞增殖目前尚存爭議[17-18],但本研究表明GH可改變細胞周期促進LoVo細胞增殖。為進一步研究GH對LoVo細胞的影響,取對數生長期LoVo細胞在高濃度重組人GH處理下體外培養,進行Transwell侵襲和遷移實驗,結果證實,高濃度GH可明顯促進LoVo細胞侵襲和遷移。因此,對患有GH型垂體腺瘤的結腸癌患者,過量分泌的GH可能是促進結直腸癌浸潤和轉移的原因。但GH促進結腸癌細胞侵襲和遷移的調控和分子機制尚未明確。

EMT是指細胞失去上皮表型并轉化為間質表型的生物學過程,在腫瘤的發生、發展中發揮著重要作用,與腫瘤的侵襲轉移密切相關,在分子生物學水平上通常表現為上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)表達缺失和波形蛋白(Vimentin)表達增強[19-20]。其中E-cadherin的表達降低是EMT的關鍵步驟,它能改變細胞形態,降低細胞間的黏附性,促進腫瘤細胞侵襲和遷移。Snail-1是一種富含鋅指結構的轉錄因子,可通過結合E-cadherin啟動子轉錄位點附近的E2-box,抑制基因表達[21]。目前Snail-1已被證實在腫瘤的進展和轉移中發揮重要作用,并可通過降低E-cadherin的表達和誘導EMT促進結直腸癌的轉移[22]。本研究結果顯示,高濃度GH可有效上調LoVo細胞N-cadherin、Vimentin和Snail-1的表達水平,抑制E-cadherin的表達水平,促進EMT。以上研究結果表明,GH型垂體腺瘤可通過分泌大量GH上調結腸癌細胞Snail-1的表達,進而下調E-cadherin的表達,上調N-cadherin和Vimentin的表達,影響細胞外基質和細胞黏附,使細胞骨架重塑,促進EMT。

綜上所述,本研究結果表明GH型垂體腺瘤細胞可分泌高濃度GH。高濃度GH可有效促進結腸癌細胞侵襲和遷移,其調控分子機制可能與高濃度GH促進結腸癌細胞EMT相關。同時研究證明GH可改變細胞周期促進結腸癌細胞增殖。臨床上對患有GH型垂體腺瘤的患者,應當進行結腸鏡篩查。對同時患有GH型垂體腺瘤和結腸癌的患者,應當關注結腸癌是否發生轉移。