細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑3在HPV16陽性宮頸癌中的表達及意義

譙 坤,徐殿琴,朱小雨,周鑫竹,張 瑜,譚玉潔,△

(1.貴州醫科大學醫學檢驗學院,貴陽 550004;2.貴州醫科大學附屬醫院高血壓科,貴陽 550004;3.貴州醫科大學附屬醫院臨床檢驗中心,貴陽 550004)

宮頸癌是女性生殖系統中最常見的惡性腫瘤,嚴重威脅女性生命健康,其發病率高達 80/10萬,每年約50萬新發病例且超過25萬患者死亡,其中80%以上的新發病例位于發展中國家,是發展中國家女性死亡的重要病因[1]。該病即使在腫瘤初期開始治療,很多患者的情況仍然持續惡化。但早發現、早治療仍是預防宮頸癌進一步惡化的關鍵;此外,尋找新的治療策略也變得至關重要。研究指出,女性惡性腫瘤的形成和發展與細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑(cyclin dependent kinase inhibitor,CKI)的異常表達緊密相關[2-3]。CKI的表達由細胞內多條途徑調控[4],通過研究這些途徑在不同腫瘤中的活躍程度及CKI的表達模式,可以深入了解這些腫瘤的形成機制,從而為治療女性惡性腫瘤提供關鍵信息[5]。細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑3(cyclin dependent kinase inhibitor 3,CDKN3)也稱細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1(cyclin dependent kinase inhibitor 1,CDI1)或核蛋白相關蛋白(kinetochore associated protein,KAP),是雙特異性蛋白磷酸酶家族的成員之一,作為一種細胞周期調控蛋白參與細胞周期調控[6]。CDKN3在腫瘤診斷、治療耐藥及預后判斷方面均發揮作用[7-8],但其在人乳頭瘤病毒16(human papilloma virus 16,HPV16)陽性宮頸癌中的表達及定位目前鮮有報道。因此,本研究旨在探討CDKN3在HPV16陽性宮頸不同程度病變中的表達及意義,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2018年4-12月貴州醫科大學附屬醫院病理科經病理診斷確診的12例HPV16陽性宮頸癌、12例HPV16陽性宮頸癌前病變、10例HPV16陽性慢性宮頸炎患者及7例HPV陰性正常宮頸者對應組織石蠟切片,所有患者術前均未接受放化療及靶向治療。宮頸癌SiHa(HPV16陽性)、HeLa(HPV18陽性)、HCC94(HPV陰性)細胞株均購自武漢普諾賽(Procell)生命科技有限公司。本研究經貴州醫科大學附屬醫院醫學倫理委員會審核通過[2019倫審第(166)號]。

1.2 方法

1.2.1生物信息學分析

1.2.1.1基因表達譜交互式分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)平臺分析CDKN3基因在宮頸癌及其他癌癥數據集中的表達

利用GEPIA網站(http：//gepia.cancer-pku.cn/)分析CDKN3在腺樣囊性癌、乳腺浸潤性癌和宮頸鱗狀細胞癌等33種人類癌癥,以及306份宮頸癌組織樣品和13份正常宮頸組織樣品中的表達情況,在網站選中CDKN3進行在線分析并以散點圖表示。

1.2.1.2基因表達綜合(Gene Expession Omnibu,GEO)數據庫分析CDKN3在HPV16陽性宮頸癌數據集中的表達

利用GEO數據庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)分析CDKN3 mRNA在HPV16陽性宮頸癌組織(43份)及正常宮頸組織(12份)中的表達。

1.2.2免疫組織化學檢測CDKN3在HPV16陽性宮頸癌組織中的表達

取貴州醫科大學附屬醫院病理科HPV16陽性宮頸癌(12份)、HPV16陽性宮頸癌前病變(12份)、HPV16陽性慢性宮頸炎(10份)及HPV陰性正常宮頸(7份)組織樣品,以10%甲醛溶液固定,隨后進行石蠟包埋。將固定后的組織切割為薄片,置于玻片上烤干;經過脫蠟和水化處理,檸檬酸鈉抗原修復液修復3 min;3%過氧化氫孵化30 min以阻斷內源性過氧化酶活性,隨后用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min;山羊血清中孵化30 min以阻止非特異性結合,然后加入CDKN3抗體(1∶100),并在4 ℃濕盒中孵化過夜。第2天,切片室溫平衡30 min,移除一抗;PBS清洗3次,每次10 min,再加入酶標山羊抗兔IgG聚合物(武漢三鷹生物有限公司),室溫孵化2 h;移除二抗并再次用PBS清洗,二氨基聯苯胺(DAB)顯色3～5 min;蘇木素復染,鹽酸乙醇分化、返藍、脫水、透明化,最后進行封片處理。根據組織切片著色的陽性細胞數量和染色范圍進行評分。在5個高倍鏡視野下觀察并使用二級計分法,染色強度和范圍結合形成最終的免疫組織化學評分,其中0分為陰性,1～2分為弱陽性,3～4分為中等陽性,5分及以上為強陽性。本研究將陰性和弱陽性歸類為陰性,中等陽性和強陽性歸類為陽性。

1.2.3細胞實驗

1.2.3.1細胞培養

SiHa(HPV16陽性)、HeLa(HPV18陽性)細胞置于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養基中,37 ℃、5% CO2條件下培養;HCC94(HPV陰性)細胞置于培養基RPMI-1640+10% FBS+1%青霉素(Penicillin,P)/鏈霉素(Streptomycin,S)中,37 ℃、5% CO2條件下培養。均每2～3天更換培養基,細胞達80%～90%融合時,使用0.25%胰蛋白酶進行傳代培養。

1.2.3.2Western blot檢測宮頸癌細胞CDKN3的表達水平

取對數生長期SiHa(HPV16陽性)、HCC94(HPV陰性)和HeLa(HPV18陽性)細胞,接種于6孔板,24 h后用RIPA液裂解并測定蛋白濃度。利用5%濃縮膠和10%分離膠進行電泳,將蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,含5%脫脂奶粉的TBST中封閉3～4 h,兔抗人CDKN3抗體(1∶1 000稀釋,美國Bioworld公司)孵育過夜;TBST清洗膜3次,在辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗(1∶10 000稀釋,美國Santa Cruz公司)中孵育2 h;TBST清洗3次,使用電化學發光(ECL)法顯影。以3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內參,用Image J1.53軟件分析CDKN3相對表達水平。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 CDKN3在泛癌中高表達

通過訪問GEPIA平臺,比較CDKN3在大部分腫瘤組織中的表達情況,并進一步檢索比較正常宮頸組織(13份)和宮頸癌組織(306份)CDKN3的表達,結果顯示：宮頸癌及其他腫瘤組織CDKN3表達水平明顯高于正常組織(P<0.05),見圖1、2。

Transcripts per million(TPM)：每百萬個轉錄本中的數量;ACC：腎上腺皮質癌;BLCA：膀胱尿道上皮癌;BRCA：乳腺浸潤性癌;CESC：宮頸癌;CHOL：膽管癌;COAD：結腸腺癌;DLBC：淋巴樣腫瘤彌漫大B細胞淋巴瘤;ESCA：食管癌;GBM：多形性神經膠質母細胞瘤;HNSC：頭頸部鱗狀細胞癌;KICH：腎褐色瘤;KIRC：腎透明細胞癌;KIRP：腎乳頭狀細胞癌;LAML：急性髓細胞樣白血病;LGG：腦低級別膠質瘤;LIHC：肝細胞癌;LUAD：肺腺癌;LUSC：肺鱗狀細胞癌;MESO：間皮瘤;OV：卵巢漿液性囊腺癌;PAAD：胰腺腺癌;PCPG：嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤;PRAD：前列腺腺癌;READ：直腸腺癌;SARC：肉瘤;SKCM：皮膚切除性黑色素瘤;STAD：胃腺癌;TGCT：睪丸生殖細胞瘤;THCA：甲狀腺癌;THYM：胸腺瘤;UCEC：子宮體部子宮內膜癌;UCS：子宮肉瘤;UVM：葡萄膜黑色素瘤;T：腫瘤組織;N：正常組織。

TPM：每百萬個轉錄本中的數量;CESC：宮頸癌;a：P<0.05。

2.2 CDKN3 mRNA在HPV16陽性宮頸癌高表達

訪問GEO數據庫宮頸癌GSE39001數據集,分析正常宮頸組織(12份)和HPV16陽性宮頸癌組織(43份)CDKN3 mRNA表達情況,結果顯示：HPV16陽性宮頸癌組織CDKN3 mRNA相對表達水平明顯高于正常宮頸組織(P<0.001),見圖3、4。

a：P<0.001。

control：正常宮頸組織;HPV16-positive cervical cancer：HPV16陽性宮頸癌組織。

2.3 不同宮頸病變組織CDKN3表達情況

免疫組織化學檢查結果顯示,HPV16陽性宮頸癌(12份)、HPV16陽性宮頸癌前病變(12份)、HPV16陽性慢性宮頸炎(10份)及HPV陰性正常宮頸(7份)組織切片中CDKN3陽性表達率分別為91.7%(11/12)、58.3%(7/12)、0(0/10)、0(0/7),均定位于細胞質,見圖5。

A：HPV陰性正常宮頸組織;B：HPV16陽性慢性宮頸炎組織;C：HPV16陽性宮頸癌前病變組織;D：HPV16陽性宮頸癌組織。

2.4 不同宮頸癌細胞CDKN3表達情況

Western blot檢測結果顯示,宮頸癌SiHa(HPV16陽性)細胞CDKN3表達水平高于宮頸癌HeLa(HPV18陽性)和HCC94(HPV陰性)細胞,差異均有統計學意義(P<0.05),見圖6。

A：Western blot檢測不同宮頸癌細胞CDKN3表達;B：不同宮頸癌細胞CDKN3表達水平比較柱狀圖;a：P<0.05。

3 討 論

細胞周期是細胞生命活動的基本過程,對正常細胞增殖、分化和死亡至關重要[9]。在癌癥中,細胞周期調節功能紊亂是一個重要的特征,可導致細胞癌變[10]。CDKN3是一種雙特異性蛋白磷酸酶,與細胞周期調節密切相關[11-12]。它與細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent protein kinase,CDK)相互作用,調節細胞進入S期,影響細胞增殖[13-15]。在不同類型的癌癥中,CDKN3的表達水平和作用不同,可能促進或抑制癌癥的發展[16-18]。例如,在前列腺癌中,CDKN3高表達與較低的復發率相關,敲除CDKN3可抑制癌細胞增殖和侵襲[19]。然而,在其他癌癥中,如鼻咽癌和胃癌,CDKN3的高表達與不良預后相關[20-21]。盡管CDKN3在許多癌癥中的作用已被研究,但其在HPV16陽性宮頸癌中的作用仍有待深入探究。因此,本研究從生物信息學角度及相關實驗中探討CDKN3在HPV16陽性宮頸癌中的表達和意義。

本研究首先采用生物信息學分析,通過公共數據庫分析候選基因(CDKN3)：(1)訪問共享GEPIA平臺,發現CDKN3在泛癌中普遍高表達;也有文獻報道,在許多類型癌癥中觀察到CDKN3表達增加[22-23]。此外,宮頸癌及其他腫瘤組織CDKN3表達水平均高于正常組織,這與BARRN等[24]的研究結果一致。(2)訪問GEO數據庫,發現HPV16陽性宮頸癌組織CDKN3 mRNA表達水平明顯高于正常宮頸組織(P<0.001)。進一步選取不同宮頸病變組織通過免疫組織化學法證實,HPV16陽性宮頸癌組織CDKN3陽性表達率高于HPV陰性正常宮頸組織和HPV16陽性慢性宮頸炎組織;此外,CDKN3在HPV16陽性宮頸癌前病變中亦表達,且均定位于細胞質,這與GEO數據庫中的結果相呼應。最后,本研究通過Western blot檢測細胞中CDKN3表達水平,發現CDKN3在宮頸癌SiHa(HPV16陽性)細胞中表達水平最高。這提示CDKN3可能與HPV16陽性感染的宮頸癌有關。本課題后期將選取SiHa細胞深入探索CDKN3在HPV16陽性宮頸癌發生、發展中的作用機制,為HPV16陽性宮頸癌的靶向治療提供理論基礎。

綜上所述,CDKN3可能是HPV16陽性宮頸癌中一種潛在的致癌基因,可作為一種宮頸癌前病變及宮頸癌篩選標志物,并為后續的機制研究及靶向治療提供理論基礎。