響應面法優化高順式蝦青素的制備工藝研究

馬永強,隋佳琦,黎晨晨,馬調梅

(哈爾濱商業大學 食品工程學院,黑龍江 哈爾濱,150028)

蝦青素(3,3′-二羥基-4,4′-二酮基-β,β′-胡蘿卜素)是一種含氧類胡蘿卜素,廣泛存在于鮭魚、南極磷蝦等水產品中,也存在于藻類、細菌、真菌等特定微生物中。蝦青素分子結構中存在的長鏈共軛不飽和雙鍵、酮基等與其生理功能密切相關。蝦青素不僅有抗氧化作用,而且還有很多生理活性,包括防治心血管疾病和增強免疫系統等[1]。蝦青素在自然界中大部分是全反式-(all-E-)。蝦青素在光照、熱量、O2和酸堿的作用下,很容易被降解和破壞,這些都有利于全反式轉化為順式蝦青素[2]。人體內可檢測到9-順式蝦青素及13-順式蝦青素,另外在食品加工產品還發現15順蝦青素及(9順-,13順-)(9順-,15順-)(13順-,15順-)雙順式蝦青素,其中主要的順式異構體為9-順式蝦青素、13-順式蝦青素。YANG等[3]研究指出,9-順和13-順蝦青素的抗氧化性和生物利用率遠高于全反式蝦青素。天然存在的蝦青素大多是全反式構型,但是蝦青素想要更好的在體內發揮其生物活性,需要將全反式構型轉變為順式結構。

目前常見的蝦青素異構化方法有熱異構、光異構、碘催化等,這些方法在異構化速率和其他方面都各不相同[4-5]。陳曉楓[6]通過添加碘單質進行光催化,碘日光照射生成的順式蝦青素占比高,且方法便捷、耗時短。楊成[7]使用熱異構的方法比較了多種溶劑對全反式蝦青素異構化的影響,結果表明二氯甲烷是促進全反式蝦青素異構化的最佳溶劑,將含有蝦青素的二氯甲烷溶液于35 ℃加熱,50 h內反應即可達到平衡;同時楊成[7]發現采用二甲基亞砜作為溶劑時,高溫(50 ℃)可以增加全反式蝦青素異構化的轉化率,轉化率比25、35 ℃時更高。蝦青素異構體的檢測方法主要有HPLC,利用不同的檢測器根據保留時間和光譜特征進行定性分析。LI等[8]利用HPLC法鑒定類胡蘿卜素的幾何異構體;楊成[7]采用半制備液相分離蝦青素順式異構體;鞏風英[9]通過對合成過程中異構化進行分析,利用HPLC分析了幾何異構體的占比。然而常見的全反式蝦青素異構化方法中多數存在催化劑不易脫除和實驗耗用時間長的缺陷[10-16]。目前關于高效大量制備順式蝦青素的研究較少,且蝦青素異構化過程中有機溶劑、催化劑的選擇等方面還需進一步研究。

本研究的原料為全反式蝦青素,采用微波加熱法對蝦青素進行異構化,探究有機溶劑、催化劑、蝦青素濃度、微波條件對蝦青素異構化的影響,優化高順式蝦青素制備工藝。為其在功能性食品中的應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蝦青素(純度98%),陜西金康泰生物科技有限公司;蝦青素標準品,阿拉丁試劑上海有限公司;丙酮、二氯甲烷、二甲基亞砜、乙酸乙酯(分析純),天津市科密歐化學試劑有限公司;異硫氰酸甲酯、異硫氰酸己酯、二甲基三硫(分析純)、乙腈、甲酸(色譜級),阿拉丁試劑上海有限公司。

1260型高效液相色譜儀,安捷倫科技中國有限公司;XH-MC-1微波干燥器,北京祥鵠科技發展有限公司;MC型精密電子天平(精度0.1 mg),北京賽多利斯儀器系統有限公司;Thermo Scientific Q-Exactive質譜儀,美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 高順式蝦青素異構體的測定

1.2.1.1 蝦青素順式異構化方法

采用微波加熱法對全反式蝦青素進行異構化。取5 mg全反式蝦青素,溶于5 mL乙酸乙酯,配制成1.0 mg/mL的蝦青素溶液,倒入三口燒瓶,置于微波干燥器中,接回流冷凝裝置。微波功率600 W、微波溫度65 ℃,加熱5 min后取樣,反應后的溶液用甲醇定容,0.22 μm有機濾膜過濾;HPLC檢測分析并計算蝦青素異構體的含量。

1.2.1.2 HPLC條件

HPLC條件參照楊成[7]的方法稍有修改:使用Infinity-II-126型高效液相色譜儀搭配二極管陣列檢測器(diode array detector,DAD),色譜柱:UltimateXB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,4 μm);柱溫25 ℃,流速0.7 mL/min,進樣量10 μL。梯度洗脫的條件為:流動相: A(0.1%甲酸-水溶液),B(95%甲醇與5%乙腈), 0～2.5 min,40%～20%A;2.5～7.5 min,20%～0%A;17.5～20 min,0%A;20～20.5 min,0%～40%A,20.5～26 min,40%A。

DAD波長掃描范圍:220～700 nm。參照標準品的保留時間及UV/Vis光譜數據(Q值)以及文獻[17-18]對不同蝦青素異構體進行了初步鑒定。

1.2.1.3 順式占比的計算

通過計算液相色譜圖中順式峰峰面積的所占比,從而得到不同順式結構的順式占比。

1.2.2 單因素試驗

1.2.2.1 有機溶劑的確定

采用不同的有機溶劑研究蝦青素在溶液中的異構化反應。選擇了一些在室溫下容易溶解蝦青素的溶劑,如二甲基亞砜、乙酸乙酯和丙酮。取5 mg全反式蝦青素溶于不同有機溶劑,配制成1.0 mg/mL的蝦青素溶液,倒入三口燒瓶,置于微波干燥器中,接回流冷凝裝置。微波功率600 W、微波溫度65 ℃,加熱5 min后取樣,反應后的溶液用甲醇定容,0.22 μm有機濾膜過濾;HPLC檢測分析并計算蝦青素異構體的含量?？疾炝?種不同有機溶劑在蝦青素異構化過程中的作用,并篩選出順式比例最大的作為后續試驗對象。

1.2.2.2 催化劑及添加量的確定

稱取5 mg蝦青素,將其溶于乙酸乙酯,配制成1.0 mg/mL的蝦青素溶液,水浴超聲讓蝦青素完全溶解。分別加入催化劑異硫氰酸甲酯、異硫氰酸己酯和二丙基三硫,每種催化劑的質量濃度分別為20、40、60、80、100 mg/mL。倒入三口燒瓶,置于微波干燥器中,接回流冷凝裝置。微波功率600 W、微波溫度65 ℃,加熱5 min后取樣,反應后的溶液用甲醇定容,0.22 μm有機濾膜過濾,HPLC檢測分析并計算蝦青素異構體含量?？疾炝?種不同類型的催化劑及其添加量對蝦青素異構化的影響,篩選出其中順式比例較高的催化劑和添加量。

1.2.2.3 蝦青素溶液質量濃度的確定

稱取蝦青素(5、7.5、10、12.5、15 mg),將其溶于乙酸乙酯,配制成不同質量濃度(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL)的蝦青素溶液,水浴超聲讓蝦青素完全溶解,添加催化劑(異硫氰酸甲酯添加量60 mg/mL)。倒入三口燒瓶,置于微波干燥器中,接回流冷凝裝置。微波功率600 W、微波溫度65 ℃,加熱5 min后取樣,反應后的溶液用甲醇定容,0.22 μm有機濾膜過濾,HPLC檢測分析并計算蝦青素異構體含量。研究蝦青素溶液質量濃度對異構化的作用效果,選擇順式占比最高的蝦青素溶液質量濃度進行后續實驗。

1.2.2.4 微波加熱條件的確定

稱取7.5 mg蝦青素,將其溶于乙酸乙酯,配制成1.5 mg/mL的蝦青素溶液,水浴超聲讓蝦青素完全溶解,添加催化劑(異硫氰酸甲酯,60 mg/mL)。微波時間5～25 min、微波功率300～700 W、微波溫度55～75 ℃。反應后的溶液用甲醇定容,0.22 μm有機濾膜過濾,HPLC檢測分析并計算蝦青素異構體含量。確定最優的微波加熱條件。

1.2.3 響應面試驗

以單因素試驗結果為依據,自變量為A、B、C、D,分別為溫度、功率、時間及蝦青素溶液質量濃度,因變量為Y:蝦青素順式占比。設計實驗方案,表1為因素及水平編碼。

表1 響應面試驗因素和水平Table 1 Experimental factors and level for response surfaces

1.3 數據統計與分析

所有實驗至少進行3次平行實驗。曲線圖使用Origin對數據進行繪制,采用Design-Expert進行響應面分析。

1.4 順式蝦青素的構型鑒定

異構化后的產物采用超高效液相-質譜(ultra-HPLC-mass spectrometry, UPLC-MS)聯用技術進一步鑒定并確定了順式蝦青素的結構組成[19]。質譜條件:離子源HESI,毛細管263 ℃,氣化溫度425 ℃,源電壓3.5 kV,掃描范圍:100～1 000m/z。通過LC-MS得到不同時間峰對應的質譜圖,再與蝦青素的分子質量進行比對分析,判斷新生成的物質是否為蝦青素異構體。

2 結果與分析

2.1 高效液相色譜法鑒定蝦青素結構

高效液相色譜法能較好地將樣品中天然色素分離出來,它具有分離效果好,檢測靈敏度和分離效率高的優點,目前已成為類胡蘿卜素分析應用非?；钴S的方法之一,是蝦青素定性定量檢測最重要的技術[20-21]。從圖1-a可以看出,全反式蝦青素檢測出現了一個色譜峰,且在此液相條件下的保留時間為17.67 min。

微波加熱將全反式蝦青素異構化形成高順式蝦青素。經微波加熱后的液相色譜圖表明,檢測獲得了3個色譜峰,從3個色譜峰和各色譜峰的UV-Vis光譜中得知,1號色譜峰保留時間為17.35 min與全反式蝦青素的保留時間基本一致,由此可以推斷峰1為全反式蝦青素。圖1-b色譜峰上峰1的保留時間(17.35 min)、峰2的保留時間(19.45 min)、峰3的保留時間(19.62 min)對應色譜峰的UV-Vis光譜與全反式蝦青素的UV-Vis光譜相似,可確定圖1中峰2和峰3是2個順式異構色譜峰。

由圖2可知,不同峰位在某一波長區間吸光度的變化情況,其中全反式蝦青素特征吸收峰出現在470 nm處,這一波長為蝦青素的最大吸收波長。另一些異構體除了主要的吸收峰以外,還同時會在300～400 nm出現特征順式峰。YUAN等[22]認為全反式蝦青素異構化生成順式異構體后,紫外吸收波長最大值發生位移,光譜近紫外區有一個新的吸收最大值出現,體現在色譜圖中即為“藍移”。如圖2所示,其中峰2的紫外最大吸收波長為470 nm,發生了2～10 nm的藍移,被認定為9-順式異構體,與YUAN等[22]的實驗結果吻合。同時,峰3不同的地方在于370 nm以及468 nm時出現2個最大吸收峰,被認定為13-順式蝦青素異構體,與ZHAO等[23]的實驗結果一致,表明該試驗可以成功鑒定蝦青素的異構體。將順式峰的吸光度和主峰的吸光度之比定義為Q值,并將Q值進行對比來判斷蝦青素的幾何構型[24]。如表2所示,圖1中2、3號峰所對應的Q值分別為0.39和0.95。Q值越高,C鏈中間出現異構的可能性也就越大[25]?？梢源_定熱異構化后蝦青素多個不同的異構體:其中峰1是全反式蝦青素,峰2是9-順式蝦青素,峰3是13-順式蝦青素。由于使用了不同的流動相及色譜條件,該研究中Q值及UV-Vis光譜與文獻中所報道的資料略有不同。

a-全反式蝦青素標準品;b-蝦青素異構化后

表2 蝦青素異構體的初步鑒定Table 2 Initial identification of the astaxanthin isomers

a-全反式蝦青素;b-9-順式蝦青素;c-13-順式蝦青素

2.2 單因素試驗

2.2.1 不同有機溶劑對蝦青素順式占比的影響

不同的反應條件會影響蝦青素異構化產物的種類和產率,已有研究報道不同溶劑加熱時全反式蝦青素異構體的異構化效果,并發現高溫有利于全反式蝦青異構體的形成,溶劑效應也會影響不同順式異構體的形成和積累[26]。本研究將全反式蝦青素分別溶于丙酮,乙酸乙酯和二甲基亞砜中加熱,如圖3所示,在65 ℃高溫加熱條件下,不同溶劑中蝦青素轉化效率順序為乙酸乙酯(22.6%)>二甲基亞砜(20.8%)>丙酮(14%)。全反式蝦青素溶于乙酸乙酯,2種順式蝦青素異構體比例存在顯著性差異,所得的9-順式蝦青素的占比為4.62%,13-順式蝦青素占比為17.98%。

圖3 不同有機溶劑對蝦青素順式占比的影響Fig.3 Effects of different organic solvent on the cis-ratio of astaxanthin

2.2.2 催化劑對蝦青素順式占比的影響

當催化劑加入全反式蝦青素溶液中微波加熱處理后,蝦青素的順式異構化增強,其轉化程度因催化劑不同而不同[27]。本文研究3種催化劑(二丙基三硫、異硫氰酸甲酯、異硫氰酸己酯)及其添加量對熱處理后的蝦青素順式異構化的影響。由圖4可知,添加60 mg/mL異硫氰酸甲酯催化效率最高,總順式占比達到25.99%,其中9-順式蝦青素占8.39%,13-順式蝦青素占17.59%。隨著催化劑質量濃度的增加,反應加速,進而促進了蝦青素的順式異構化反應,蝦青素異構體的順式比例有上升趨勢,順式異構體在催化劑質量濃度為60 mg/mL的時候趨于穩定。當質量濃度大于60 mg/mL時,加大催化劑質量濃度會影響蝦青素異構化率。故選用60 mg/mL的異硫氰酸甲酯進行后續實驗。

圖4 不同催化劑對蝦青素順式占比的影響Fig.4 Effects of different catalyst on the cis-ratio of astaxanthin

2.2.3 質量濃度對蝦青素順式占比的影響

圖5為不同質量濃度的蝦青素溶液,以乙酸乙酯為介質65 ℃下加熱得到的順式異構體占比。蝦青素順式比例隨蝦青素溶液質量濃度升高呈現先升高后降低的變化趨勢。這是因為乙酸乙酯的處理能力有限,蝦青素溶液質量濃度過高時會出現掛壁的現象,造成蝦青素會有一部分損失,同時對異構化后的順式占比產生影響。提高蝦青素溶液質量濃度,可以明顯提高順式蝦青素的生成效率進而促進蝦青素異構化,蝦青素溶液質量濃度提高到1.5 mg/mL時,蝦青素的順式異構體比例較高,異構化效果好。故選取1.5 mg/mL蝦青素溶液進行后續實驗。

圖5 不同蝦青素溶液質量濃度對蝦青素順式占比的影響Fig.5 Effect of different astaxanthin solution mass concentration on the cis-ratio of astaxanthin

2.2.4 微波時間對蝦青素順式占比的影響

蝦青素異構化作用隨熱處理時間的延長而增強。不同順式異構體在熱處理時異構化程度不同,順序上也有所不同[28-29]。由圖6可知,微波加熱20 min時,蝦青素總順式占比最高為43.48%,9-順式蝦青素含量增加到13.10%,13-順式蝦青素30.38%。在5～20 min,蝦青素順式比例隨著時間延長呈上升趨勢,而在加熱時間大于20 min以上的時候,蝦青素順式占比呈下降趨勢。加熱時間的延長可以對蝦青素的異構化起到促進作用。但是,在加熱時間過長的情況下,其所形成的順式異構體也會發生降解,從而造成蝦青素總含量降低,蝦青素順式轉化率降低。故選取微波時間20 min進行后續實驗。

圖6 不同微波時間對蝦青素順式占比的影響Fig.6 Effects of different microwave time on cis-ration of astaxanthin

2.2.5 微波功率對蝦青素順式占比的影響

微波功率對蝦青素的異構化程度具有一定的影響。由圖7可知,微波功率為600 W時,蝦青素總順式占比最高為47.83%。在300～600 W,隨著微波功率的增大,蝦青素總順式占比逐漸增大,其中9-順式蝦青素比例變化較小,而13-順式蝦青素的占比則持續增加。當超過600 W時,蝦青素順式占比不斷下降。這是由于功率不斷提升,對于蝦青素異構化有促進作用,但功率過大會導致順式蝦青素的占比降低,蝦青素異構化速率小于降解速率,從而對蝦青素的順式占比造成了影響。故選取600 W的功率進行實驗。

圖7 不同微波功率對蝦青素順式占比的影響Fig.7 Effects of different microwave power on cis-ration of astaxanthin

2.2.6 微波溫度對蝦青素順式占比的影響

蝦青素的異構化程度也取決于微波加熱的溫度[30]。由圖8可得出,微波溫度為70 ℃時,蝦青素總順式占比最高48.73%。溫度較低時,9-順式和13-順式蝦青素的比例上升速度比較緩慢;隨微波溫度的不斷上升,9-順式和13-順式蝦青素含量比例均呈上升趨勢;但當微波溫度超過70 ℃時,蝦青素總順式占比下降至43.88%。這是因為微波加熱溫度提高促進順式異構體生成,且該溫度范圍內順式異構體的降解速率相較緩慢;當溫度過高時,全反式蝦青素很快發生異構化反應,但是會因為順式異構體的熱不穩定降解[31],造成蝦青素的損失,影響了蝦青素順式占比,故選取70 ℃的微波溫度進行后續實驗。

圖8 不同微波溫度對蝦青素順式占比的影響Fig.8 Effects of different microwave temperature on cis-ration of astaxanthin

2.3 響應面試驗結果分析

根據單因素試驗,選擇微波溫度(A)、微波功率(B)、微波時間(C)、蝦青素濃度(D),以順式占比(Y)為響應值。按照Box-Behnken的設計試驗,進行四因素三水平的試驗,表3為試驗設計和結果。

表3 Box-Behnken實驗設計及結果Table 3 Box-Behnken test design and results

采用Design-Expert數據分析軟件進行擬合分析,根據表4建立四因素三水平多元回歸擬合,得到二次回歸模型方程為:Y=48.49-0.54A-0.46B+1.89C+0.36D+1.97AB-2.08AC+0.55AD-2.38BC+0.85BD+0.19CD-6.21A2-4B2-3.16C2-4.2D2。根據表4可知模型F=10.81,P<0.000 1。說明所建立的模型達到顯著水平(P<0.000 1),失擬性檢驗差異不顯著,R2=0.915 3,表明所得模型的擬合程度較好,可用于預測分析。從各個因子F值大小可以看出,各個因子對蝦青素順式比例影響程度排序依次是:C(微波時間)>A(微波溫度)>B(微波功率)>D(蝦青素濃度)。微波溫度和微波功率(AB),微波溫度和微波時間(AC),微波功率和微波時間(BC)存在一定的交互作用,對蝦青素順式占比率具有顯著影響。

表4 回歸方程系數及顯著性檢驗Table 4 Regression equation coefficients and significance test

根據回歸方程得出響應面圖,分析任意兩因素交互作用對蝦青素順式占比的影響。觀察響應面圖,因素的改變對響應值越明顯,響應曲面坡度越彎。如圖9所示,任意兩因素對蝦青素順式占比的影響大小:微波功率和微波時間(BC)>微波溫度和微波時間(AC)>微波溫度和微波功率(AB)。在等高線圖中,交互作用的強度能夠從等高線圖的形狀反映出來,等高線圖形越橢圓,響應面坡度愈陡,表示交互作用對于順式占比有顯著影響。

a-微波溫度、微波功率交互作用;b-微波溫度、微波時間交互作用;c-微波溫度、蝦青素濃度交互作用; d-微波功率、微波時間交互作用;e-微波功率、蝦青素濃度交互作用;f-微波時間、蝦青素濃度交互作用

2.4 最佳工藝條件與驗證性實驗

通過擬合模型方程,得到最佳條件:微波溫度69.24 ℃,微波功率578 W,微波時間22.16 min,蝦青素質量濃度1.51 mg/mL,蝦青素順式占比為48.99%。根據實際條件,對最佳條件進行調整:微波溫度為69 ℃,微波功率為600 W,微波時間為22 min,蝦青素的質量濃度為1.5 mg/mL,在此條件下進行3次平行驗證實驗,取其平均值,蝦青素總順式占比為49.34%、9-順式蝦青素占比為40.48%、13-順式蝦青素占比為8.86%,與模型無顯著差異。

2.5 蝦青素異構體結構鑒定

以上實驗,全反式蝦青素經過熱異構化反應生成新物質,為了進一步證實產生的新物質是順式構型蝦青素,使用UPLC-MS檢測,鑒定蝦青素標準品樣品,如圖10所示。

圖10 蝦青素標準品的質譜鑒定結果Fig.10 Mass spectra of astaxanthin standard

對蝦青素順式異構化后的樣品進行液相質譜檢測,其質譜圖如圖11所示。

圖11 蝦青素異構體的質譜鑒定結果Fig.11 Mass spectra of astaxanthin isomers

從蝦青素異構體的HPLC結果可知1號峰是全反式蝦青素,經液質檢測發現如色譜圖中峰2和峰3的質譜圖和峰1的質譜圖相似,他們具有共同的分子離子峰[M+H]+為597.39,且3個質譜圖高度一致,基本可以斷定2、3峰都屬于蝦青素的異構體,也就是3個峰的分子質量都和蝦青素質荷比一致,從而推測這3種物質是蝦青素的同分異構體。結合文獻[7],通過匹配出峰保留時間,光譜圖、Q值以及UPLC-MS等方法可以鑒定出峰1、2和3分別是全反式蝦青素、9-順式蝦青素異構體、13-順式蝦青素異構體。

3 結論

本文通過單因素和響應面試驗優化蝦青素的異構化條件,確定了高順式蝦青素的制備方法;使用HPLC和LC-MS對蝦青素幾種不同幾何構型進行了分析和鑒定。通過試驗,得出最佳條件:60 mg/mL異硫氰酸甲酯,微波溫度69 ℃,微波功率600 W,微波時間22 min,蝦青素的質量濃度為1.5 mg/mL。在此條件下,蝦青素總順式占比率為49.34%。本研究在前人研究基礎上進行優化,提供一種可以快速制備順式蝦青素的異構化方法,同時也提高了蝦青素的順式占比,可為蝦青素在食品和藥品等領域進一步的應用與發展提供一定參考,具有潛在應用價值。