牛膝-菟絲子藥對防治高血壓腎損傷網絡藥理學機制研究*

徐瑾，張文婷，王時光

1 安徽中醫藥大學第一臨床醫學院 安徽合肥 230012

2 安徽中醫藥大學第一附屬醫院 安徽合肥 230031

原發性高血壓是臨床上常見的疾病，其患病率及絕對負擔在全球范圍內正在上升[1]。以持續性的血壓升高為主要病理改變，且隨著疾病進展，對腎臟的功能有較大影響出現病理性改變，稱為高血壓腎損傷。高血壓腎損傷也會反饋性升高血壓水平，形成惡性循環。對于高血壓腎損傷的治療主要是用降血壓藥物治療使血壓控制在正常范圍以減少腎臟損害。中醫藥在分子水平上具有多靶點、多途徑的作用，中西藥聯合可能在控制血壓的同時保護腎臟，改善遠期預后。

《本草備要》中有提到菟絲子能夠：“補三陰，入足三陰（脾、肝、腎），強陰益精”。具有祛風明目，補益肝腎，助筋脈等功效?！睹t別錄》中記載懷牛膝能夠：“療傷中少氣，填骨髓，益精，利陰氣，止發白”。具有補肝腎，強筋骨，引血下行等功效。網絡藥理學通過構建生物系統網絡，分析活性成分、蛋白靶點、信號通路之間的生物學聯系，可以在分子水平上多成分、多靶點地分析中藥治療疾病的作用機制，為懷牛膝-菟絲子治療高血壓腎損傷尋找新的作用靶點提供理論依據，以及對實驗驗證及藥理研究奠定基礎。

資料與方法

1 活性成分及靶點的篩選

以“懷牛膝”“菟絲子”為關鍵詞，在中藥系統藥理數據庫分析平臺（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中檢索，篩選數據，篩選條件為：口服生物利用度（OB） ≥ 30%，類藥性質（DL）≥ 0.18。使用TCMSP數據庫篩選與活性化合物相關的靶點，在UniProt （http：//www.uniprot.org/）數據庫中將上述得到的靶點基因名稱匹配對應“人”的靶點基因，去除重復基因，收集重疊的靶基因和活性化合物，即可獲得所需的活性成分靶點，將活性成分輸入數據庫，檢索獲得對應的靶蛋白。利用Cytoscape3.9.1軟件建立網絡圖。

2 疾病候選靶點的篩選

在Gene Cards數據庫（http：//www.genecards.org/）中以“Hypertension renal damage ”為關鍵詞，獲取高血壓腎損傷相關基因，設定相關性分值設置為＞10，篩選出符合條件的基因，在Omim數據庫（https：//www.omim.org）中輸入關鍵詞“Hypertension renal damage”，符合條件的基因，將兩個數據庫獲得的基因整合在一起去除重復項獲得疾病候選靶點。采過Venny工具獲取菟絲子、懷牛膝活性成分靶點與高血壓腎損傷的基因靶點交集的基因，即潛在靶點。

3 蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網絡的構建

將潛在靶點輸入至STRING數據庫（https：//string-db.org/），以物種為“人”作為篩選條件，設置所需的最低交互分數最高置信度為0.9，篩選過后的PPI網絡圖以TSV格式下載，通過Cytoscape3.9.1軟件對TSV格式的文件內容進行可視化展示，即可獲得PPI網絡圖與關鍵核心靶點。

4 GO生物功能及KEGG通路富集分析

利用Metascape數據庫進行自定義分析，選擇物種參數為“人”，將所得富集條目按照P值由小到大順序排列，選擇Top10通路輸入微生信云平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn），進行可視化處理。通過GO功能富集分析：生物過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF），同時進行KEGG通路富集分析，對藥物作用靶點或差異表達基因進行信號通路分析。

結 果

1 活性成分的獲取

以1.1中的設置條件為篩選條件，在TCMSP、Uniprot數據庫中得到懷牛膝-菟絲子相應活性成分的待選靶基因共206個，得到24種有效活性成分（表1）。將藥物、活性成分、靶點基因導入Cytoscape3.9.1中構建藥理學網絡圖（圖1）。根據網絡數據分析可以得出槲皮素所對應的靶點最多為134個，其次是山柰酚為53個，再次是黃芩素、β-谷甾醇等，這些活性成分在懷牛膝—菟絲子藥對治療疾病中可能發揮重要作用。

圖1 懷牛膝、菟絲子藥物成分-靶點網絡

表1 懷牛膝、菟絲子活性成分信息

2 高血壓腎損傷靶點

用1.2項下的方法共檢索到高血壓腎損傷相關靶點1762個。將1762個高血壓腎損傷靶點與懷牛膝-菟絲子藥對的206個靶點基因做韋恩圖（見圖2），獲得113個交集基因，以此作為懷牛膝-菟絲子藥對治療高血壓腎損傷的預測靶基因。

圖2 懷牛膝、菟絲子與高血壓腎損傷靶點交集韋恩圖

3 PPI網絡的構建

PPI網絡分析可以更有效地、直觀地從系統的角度獲取藥物的靶蛋白基因，如圖3所示。利用Cytoscape畫圖軟件構建的PPI網絡圖由113個節點組成。將2.2中得到的113個交集靶點輸入到STRING數據庫中，下載TSV格式的結果文件，并將其導入Cytoscape3.9.1中構建PPI網絡圖（見圖3），圖中的靶蛋白的節點大小隨著degree值的增大而增大，顏色也隨著節點變大而逐漸加深，反映一個蛋白與蛋白互作關系的蛋白有多少度越大，這個點越容易影響其他蛋白，中藥程度有可能越高。圖中線越粗顏色越紅越大，中藥程度越強，表明得分越高。如腫瘤抑制蛋白P53（TP53）、蛋白激酶B1（AKT1）、原癌基因（RELA）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、腫瘤壞死因子（TNF）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、白細胞介素6（IL-6）等。

圖3 懷牛膝、菟絲子與高血壓腎損傷核心交集靶點的PPI網絡

4 GO生物功能及KEGG通路富集分析

利用Metascape數據庫，選擇物種為“人”，進行GO分析和KEGG通路富集分析（見圖4、圖5），其中GO分析共包含：生物學過程（BP）、細胞組分（CC）和分子功能分析（MF），其中BP分析表明相關靶點主要與對無機物的反應、對氧化應激的反應、對化學應激的細胞反應等功能有關；CC分析表明有關靶點主要與膜筏、膜微域、轉錄調控復合物功能有關；而MF分析結果則表明，這些靶點與癌癥中的通路、免疫系統的細胞因子、白細胞介素功能密切相關。KEGG通路富集分析結果癌癥中的通路、脂質和動脈粥樣硬化、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路等信號通路，均與高血壓腎損傷的發生發展關系密切。

圖4 懷牛膝、菟絲子治療高血壓腎損傷的GO功能分析

圖5 懷牛膝、菟絲子治療高血壓腎損傷的KEGG富集分析

討 論

高血壓腎損傷病位在肝腎，臨床上最常見的中醫證候分型為陰虛陽亢證，患者肝腎陰虛，陰不斂陽，肝陽上亢，腎虛固攝不利，發為本證。懷牛膝和菟絲子為補益肝腎代表藥物。懷牛膝在現代藥理學中具有抗炎、降壓、降脂、降糖、提高免疫力等作用，菟絲子具有提高免疫功能、改善心肌缺血、促進造血等作用。

本研究通過網絡藥理學分析得知，懷牛膝-菟絲子中槲皮素、山柰酚、黃芩素、β-谷甾醇是與靶點蛋白發生作用的前四位。槲皮素、山柰酚屬于黃酮醇類化合物，槲皮素對血管內皮細胞具有抗細胞凋亡和抗炎作用，能夠阻斷核因子-κB（NF-κB）和AP-1信號通路來抑制TNF-α誘導的細胞凋亡和炎癥[2]。槲皮素可誘導巨噬細胞M2極化，抑制炎癥反應[3]，槲皮素還可以通過SIRT1/PINK1/線粒體自噬軸減少腎小管上皮細胞衰老來緩解腎纖維化[4]，山柰酚具有保護血管形態和降低血脂，抑制炎癥和細胞凋亡[5]。有研究表明還可以抑制腎臟細胞上皮-間充質轉化過程，保護腎臟纖維化，改善腎功能[6]。黃芩素和β-谷甾醇都具有保護血管內皮細胞的作用。黃芩苷在體外防止氧化應激引起的血管內皮功能障礙和內皮細胞損傷，并通過抗氧化防止體內動脈粥樣硬化[7]。還可以減輕心臟氧化應激、炎癥和細胞凋亡[8]。β-谷甾醇能夠干擾多種細胞信號通路，包括細胞周期、細胞凋亡、增殖、血管生成、抗炎、抗氧化、心臟保護等作用[9]。研究表明下調了腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-6的水平，并上調了內皮一氧化氮合酶的水平。β-谷甾醇對腎臟和心臟壞死和細胞凋亡的具有治療潛力[10]。

PPI網絡分析發現，TP53、AKT1、RELA、MAPK1、TNF、MAPK14、IL6等是懷牛膝-菟絲子藥對治療高血壓腎損傷的主要作用靶點。在人的基因里面，TP53是非常重要的抑癌基因，TP53基因翻譯的P53蛋白是細胞生長、增殖和損傷修復的重要調節因子。研究表明TP53參與再狹窄和動脈粥樣硬化，血管平滑肌細胞生長和細胞死亡的發展。血管炎癥被認為參與多種心血管疾病的血管重塑，包括動脈粥樣硬化和高血壓[11]，且TP53可通過miR-31a-5p途徑作用于動脈平滑肌細胞凋亡參與高血壓的發病機制[12]。AKT1通過抑制細胞凋亡過程參與細胞存活途徑，可以阻止細胞凋亡從而促進細胞存活。AKT可以增加血管內皮生長因子的分泌。還調節其他血管生成因子（如一氧化氮和血管生成素）的表達[13]。 RelA是構成NF-κB轉錄因子家族的五種成分之一。介導新血管生成的相關蛋白的基因受NF-κB的調節。其中就有血管生成因子家族中最重要的成員——血管內皮細胞生長因子（VEGF），持續性激活的NF-κB能增強VEGF基因的轉錄。NF-κB通路主要介導炎癥反應，在缺氧上皮細胞中被激活，并通過調節其靶炎性細胞因子、粘附分子和促炎酶促進腎組織的纖維化[14]。MAPK1是絲裂原活化蛋白激酶MAPK信號途徑是重要的信息傳遞鏈，是細胞增殖、應激、炎癥、分化、功能同步化、轉化、凋亡等信號轉導通路的共同交匯通路之一，把胞外信號經信號網絡，傳遞到胞內，參與細胞增殖、分化、癌變、轉移、凋亡等，不同的生長刺激、應激刺激，在不同的細胞.經不同細胞骨架局限的不同信號通路，可產生多種效應。其中細胞外信號調節激酶（ERK）屬于絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑，其級聯受RAF蛋白MEK1/2和ERK1/2的控制。ERK2缺乏來改變ERK信號通路可以減少肝纖維化和炎癥反應[15]。Sirtuin 6（SIRT6）是一種NAD依賴性脫乙酰酶，與健康和生理學的許多方面有關。研究發現SIRT6與ERK1和ERK2的啟動子結合能夠抑制ERK1 / 2表達。此外，抑制ERK1/2活性消除了SIRT6敲除引起的腎損傷加重[16]。

懷牛膝-菟絲子治療高血壓腎損傷的靶點KEGG通路富集結果顯示，癌癥的途徑、AGE-RAGE信號通路、脂質和動脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子、IL-17信號通路等為與高血壓腎損傷治療相關度較高的主要通路。AGE-RAGE信號通路是一種重要的炎癥信號通路，它參與了多種疾病的發生和發展，包括糖尿病、心血管疾病、神經系統疾病。晚期糖基化終產物（AGE）及其細胞受體（RAGE）和可溶性受體（sRAGE）在老年人群高血壓的進展中有重要的作用，血清中的AGE水平與動脈硬度以及高血壓呈正相關。血清 sRAGE水平低與動脈硬化和高血壓有關。sRAGE的水平與年齡和血壓呈負相關。AGE-RAGE介導的心血管疾病可以通過AGEs消耗量的減少，RAGE的抑制和sRAGE的升高而減弱[17]。AGEs-RAGE軸激活誘導腎小球纖維化、腎小球基底膜增厚及細胞外基質增加等病理損傷，Jiajun Chen等發現抑制AGE/RAGE軸可以抑制相關的下游炎癥分子和粘附分子，減輕炎癥反應、保護腎臟[18]。TNF是由巨噬細胞分泌，能夠導致血管功能紊亂或損傷內皮細胞，使血管損傷。其中TNF-α與炎癥的關系極為密切。有關研究發現TNF-α能刺激腎小球系膜細胞產生氧自由基，會導致血管緊張素II誘導的血壓升高和腎小球損傷[19]。IL-17是促進炎癥的因子，與腫瘤壞死因子和白介素-1協同作用，在免疫反應中發揮重要作用，在高血壓患者中，血清IL-17水平顯著高于健康人。同樣，長期輸注血管緊張素II刺激IL-17的產生，并增加血管壁內IL-17的表達，能夠使高血壓患者的血壓升高和腎臟炎癥[20]。

綜上所述，懷牛膝-菟絲子可能通過調節多種途徑抑制炎癥反應，在高血壓腎損傷的治療中發揮抗炎作用。但本研究基于網絡藥理學對藥物和疾病進行理論分析，仍需要進一步的臨床實驗和實驗室研究對其進行驗證。