脂氧素A4對Ⅱ型肺泡上皮細胞-間質轉化的抑制作用及其機制

王貴佐,楊淑梅,劉 璐(陜西省人民醫院呼吸與危重癥一科,西安 710068;通訊作者,E-mail:liulu290@126.com)

肺纖維化(pulmonary fibrosis, PF)是一種慢性間質性肺疾病,以肺泡上皮損傷、成纖維細胞活化、細胞外基質(extracellular matrix,ECM)沉積和組織結構破壞為特征[1]。該病好發于老年人,發病機制尚未完全明確,目前缺乏有效治療藥物,預后差[2]。肺泡上皮細胞(alveolar epithelial cell, AEC)向間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)被認為在肺纖維化過程中發揮重要作用[3]。AEC包括Ⅰ型肺泡上皮細胞(alveolar epithelial type Ⅰ cell, ATⅠ)和Ⅱ型肺泡上皮細胞(ATⅡ)。其中,ATⅡ占AEC的60%,占所有肺細胞的10%～15%,覆蓋約4%的肺泡表面[4]。除了可合成、分泌表面活性物質,ATⅡ還具有參與免疫反應以及轉分化等多種功能,在肺發育和損傷修復過程中發揮重要作用[5]。近年來研究發現,ATⅡ不僅可分化為ATⅠ[6],還可向間質細胞轉變,是肺纖維化過程中肌成纖維細胞的部分來源[7]。因此,揭示ATⅡ發生EMT的機制可為尋求預防和/或治療肺纖維化提供干預新靶點。

轉化生長因子β1(transforming growth factor, TGF-β1)可誘導肌成纖維細胞轉分化、EMT以及ECM沉積,在多種器官纖維化過程發揮重要調節作用[8-10]。研究表明TGF-β1可通過激活經典Smad和非經典信號通路介導肌成纖維細胞激活、ECM沉積,最終誘導肺纖維化[11]。核因子紅細胞2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)是TGF-β1下游非經典信號通路關鍵分子之一,可調節包括抗氧化、解毒酶等相關基因表達[12],在維持細胞內穩態、氧化還原平衡反應方面發揮重要作用[13-15]。研究發現,Nrf2下調可誘導EMT以及肺纖維化[16]。脂氧素A4(lipoxin A4, LXA4)是花生四烯酸的代謝產物,通過與細胞膜上的LXA4受體結合發揮作用[17]。激活LXA4受體可減輕機械通氣誘導的EMT和肺纖維化[18];LXA4穩定類似物BML-111可抑制TGF-β1誘導的肺成纖維細胞活化,減輕博來霉素誘導的肺纖維化[19]。但LXA4通過何種機制減輕肺纖維化,還需進一步研究。本研究通過評估LXA4是否可抑制ATⅡ間質轉化,探討其機制是否與LXA4上調Nrf2表達相關,為肺纖維化臨床防治策略提供理論基礎和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

TGF-β1粉劑(純度≥98%)購于美國PeproTech公司,LXA4酊劑(純度≥95%)購于美國Cayman Chemical公司,DMEM高糖培養基粉劑購于美國Gibco公司,胎牛血清購于中國浙江天杭生物科技股份有限公司,RIPA裂解液購自于中國上海碧云天公司,化學發光液購自于美國Milipore公司,大鼠抗人E鈣黏蛋白(E-cadherin)單克隆抗體、小鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)單克隆抗體、兔抗人Nrf2多克隆抗體、小鼠抗人β-actin單克隆抗體均購于美國Merck公司,HRP標記羊抗兔及小鼠二抗購于美國Sigma-Aldrich公司,LipofectamineTM2000購于美國Invitrogen公司。

1.2 細胞培養、分組及干預

人肺腺癌A549細胞作為腺癌中的肺泡基底上皮細胞,具有AT Ⅱ的生物學特性,已作為AT Ⅱ的體外模型廣泛應用。人肺腺癌A549細胞購于中國科學院典型培養物保藏委員會上海細胞庫。將A549細胞培養于含有10%胎牛血清和100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養基中,在37 ℃ 5% CO2培養箱內培養,取對數生長期的細胞進行實驗。

將A549細胞分為對照組、TGF-β1組、空質粒+TGF-β1組、pcDNA3.1-Nrf2+TGF-β1組、LXA4+TGF-β1組。TGF-β1組以5 ng/mL TGF-β1干預A549細胞48 h;空質粒+TGF-β1組和pcDNA3.1-Nrf2+TGF-β1組A549細胞先分別轉染空質粒和Nrf2過表達質粒,再以5 ng/mL TGF-β1干預48 h;LXA4+TGF-β1組A549細胞先用100 nmol/L LXA4預處理6 h再給予5 ng/mL TGF-β1干預48 h。

1.3 免疫熒光染色檢測細胞E-cadherin、α-SMA表達

A549細胞消化后接種于預先放置有載玻片的6孔板中,移液管吸除培養液后PBS洗3次,4%多聚甲醛溶液固定15 min,0.1% Triton X-100作用20 min,用含10%血清的封閉液封閉25 min,加入E-cadherin(1∶200)、α-SMA抗體(1∶400),濕盒內4 ℃孵育24 h,加入熒光二抗,室溫下避光孵育1 h,封片,熒光顯微鏡觀察E-cadherin和α-SMA表達。

1.4 轉染質粒過表達Nrf2

調整A549細胞密度至1×106個/mL,取2 mL接種于6孔板,將細胞分為空質粒組、pcDNA3.1-Nrf2組,采用LipofectamineTM2000將濃度為0.5 μg/μL的空質?；騈rf2過表達質粒分別轉染細胞48 h。

1.5 免疫印跡法檢測細胞Nrf2蛋白水平

免疫印跡法檢測E-cadherin、α-SMA、Nrf2蛋白水平,β-actin作為內參。使用RIPA裂解液提取總蛋白,測定蛋白濃度后按體積4∶1加入上樣緩沖液,100 ℃水浴變性。SDS-PAGE分離蛋白樣,采用濕轉法將凝膠上的蛋白轉至PVDF膜。使用封閉液充分封閉,與一抗(大鼠抗人E-cadherin單克隆抗體、小鼠抗人α-SMA單克隆抗體、兔抗人Nrf2多克隆抗體,稀釋度均為1∶1 000;小鼠抗人β-actin單克隆抗體,稀釋度1∶5 000)孵育,4 ℃過夜,洗膜后與HRP標記羊抗兔及小鼠二抗(稀釋度1∶10 000)室溫孵育2 h,再次洗膜后進行化學發光。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 TGF-β1誘導AT Ⅱ發生EMT

倒置顯微鏡下觀察細胞形態,與對照組相比,TGF-β1組部分細胞失去原有的“鵝卵石”樣形態,呈現出更加拉伸或伸長的紡錘形,這也是上皮細胞發生EMT的典型改變(見圖1A)。與對照組相比,TGF-β1組細胞間充質標志物(α-SMA)蛋白表達水平較對照組升高(P<0.01),而上皮標志物(E-cadherin)的表達較對照組降低(P<0.05,見圖1B)。免疫熒光結果與免疫印跡結果一致,即TGF-β1組A549細胞α-SMA水平上調、E-cadherin水平下調(見圖1C)。

注:紅箭頭所指綠色熒光信號為α-SMA,黃箭頭所指綠色熒光信號為E-cadherin,白箭頭所指藍色熒光信號為細胞核。C.免疫熒光染色檢測細胞α-SMA和E-cadherin表達圖1 TGF-β1誘導A549細胞發生EMTFigure 1 TGF-β1 exposure induces EMT in A549 cells

2.2 Nrf2介導TGF-β1誘導的AT Ⅱ發生EMT

與對照組相比,TGF-β1組A549細胞Nrf2蛋白水平下調(P<0.05,見圖2A),pcDNA3.1-Nrf2組細胞Nrf2蛋白水平增加(P<0.05,見圖2B)。與TGF-β1組相比,pcDNA3.1-Nrf2+TGF-β1組A549細胞α-SMA蛋白水平降低(P<0.01),E-cadherin蛋白水平升高(P<0.05,見圖2C)。免疫熒光結果與免疫印跡結果一致(見圖2D)。

注:紅箭頭所指綠色熒光信號為α-SMA,黃箭頭所指綠色熒光信號為E-Cadherin,白箭頭所指藍色熒光信號為細胞核。D.免疫熒光染色檢測細胞α-SMA和E-cadherin表達圖2 Nrf2介導TGF-β1誘導A549細胞發生EMT作用 (n=3)Figure 2 Nrf2 mediates TGF-β1-induced EMT in A549 cells (n=3)

2.3 LXA4通過激活Nrf2抑制TGF-β1誘導的AT Ⅱ發生EMT

與對照組相比,TGF-β1組A549細胞α-SMA蛋白水平升高(P<0.01),E-cadherin及Nrf2蛋白水平降低(P<0.05);與TGF-β1組相比,LXA4+TGF-β1組A549細胞α-SMA蛋白水平降低,E-cadherin及Nrf2蛋白水平升高(P<0.05,見圖3A)。免疫熒光結果與免疫印跡結果一致(見圖3B)。

注:紅箭頭所指綠色熒光信號為α-SMA,黃箭頭所指綠色熒光信號為E-cadherin,白箭頭所指藍色熒光信號為細胞核。B.免疫熒光染色檢測細胞α-SMA和E-cadherin表達圖3 LXA4通過上調Nrf2抑制TGF-β1誘導的A549細胞發生EMTFigure 3 LXA4 inhibits TGF-β1-induced EMT in A549 cells by upregulation of Nrf2

3 討論

肺纖維化以ECM的過度產生和聚集,以及肺組織結構的異常重構為特征[20]。目前尚無有效措施治愈或逆轉肺纖維化的進展,免疫抑制劑(如環磷酰胺)和皮質類固醇(如地塞米松)已被用于治療特發性肺纖維化急性加重,旨在減輕癥狀和炎癥反應,但因療效有限以及不容忽視的不良反應限制了它們的臨床應用[21,22]?？估w維化藥物尼達尼布和吡非尼酮雖可延緩肺纖維化進展[23,24],但卻不能治愈肺纖維化。目前,肺移植是終末期肺纖維化患者最終選擇的治療手段,但存在手術費用高、肺供體稀缺和遠期生存率差等客觀問題。因此,本研究以在肺纖維化中發揮重要作用的AT Ⅱ為研究對象,探討EMT的潛在機制,旨在為肺纖維化臨床干預提供靶點。

ACE失去頂端-基底極性和細胞間黏附性(兩者為上皮細胞的特征),并獲得間充質細胞的分子及生理特性,具備膠原蛋白合成及收縮能力,即EMT參與肺纖維化的發生發展過程[25]。肺纖維化患者和動物模型中均可檢測到ACE向間質轉化;在肺纖維化中約有1/3的成纖維細胞是經EMT形成[26],因此探討ACE發生間質轉化的潛在機制、尋求干預靶點,具有重要臨床意義。目前研究認為,Nrf2在包括肺纖維化在內的多種以氧化應激和炎癥反應為潛在病理機制的器官系統疾病中發揮保護作用[27-29]。激活Nrf2可分別抑制肝細胞及腎小管上皮細胞發生間質轉化,減輕小鼠肝纖維化、腎間質纖維化嚴重程度[30-32],但上調/激活Nrf2是否也可抑制ACE發生間質轉化,進而延緩/減輕肺纖維化嚴重程度,尚無相關報道。本研究結果顯示,TGF-β1可通過抑制Nrf2誘導A549細胞發生間質轉化,而預先過表達Nrf2可抑制TGF-β1誘導EMT的作用,提示Nrf2在肺纖維化EMT中發揮重要作用。這與Zhang等[16]研究結果一致,即TGF-β1可通過下調Nrf2誘導大鼠AT Ⅱ和A549細胞發生間質轉化。

LXA4在炎癥后的組織修復調節中發揮重要作用,特別是在肺、腎臟和皮膚纖維化中[33-35]。LXA4穩定類似物BML-111可抑制乳腺癌細胞[36]、子宮內膜上皮細胞[37]以及肝癌細胞[38]發生EMT。在大腦皮質星形膠質細胞[39]、視網膜色素上皮細胞[40]、心肌細胞[41]等多種非ACE中,LXA4可激活Nrf2信號通路。此外,LXA4還可降低肺纖維化模型肺組織中TGF-β水平,并表現出抗纖維化作用[33]。但LXA4的抗肺纖維化作用是否與其抑制ACE向間質轉化,及其潛在機制尚未明確。本研究在此基礎上深入探索,結果顯示,在A549細胞中,LXA4可抑制TGF-β1誘導的Nrf2下調及EMT作用。

綜上所述,LXA4通過上調Nrf2表達,抑制AT Ⅱ發生EMT,為肺纖維化臨床治療提供新的思路。但本研究僅進行體外實驗,不能完全反映體內的真實情況,還須體內實驗進一步證實。另外,除了上調Nrf2外,可能還有其他機制介導LXA4抑制AT Ⅱ間質轉化、改善肺纖維化的作用。這有待我們在下一步研究中,驗證LXA4穩定類似物在肺纖維化動物模型中的作用及分子機制;并進一步探索是否存在其他潛在作用機制及其之間的相互關系。