CeO2納米酶對環磷酰胺所致斑禿小鼠毛發生長的影響

彭欣欣,張 瑩,潘昱帆,劉慧慧,王思宇,韓齊心,牛旭平(山西醫科大學第九臨床醫學院皮膚科,太原 03000;山西醫科大學附屬太原市中心醫院皮膚科;通訊作者,E-mail:nnxxpp978@sina.com)

斑禿(alopecia areata,AA)是一種常見的慢性自身免疫性疾病,可導致非瘢痕性脫發,臨床特征為突發的局限性斑塊狀脫發,可以發生在身體的任何部位。AA持續發展可導致毛發全部脫落,稱為全禿,嚴重者頭皮、眉毛、腋毛、陰毛及全身毳毛脫落,稱為普禿[1]。AA終生發病風險為2%,給患者的心理和生活造成十分嚴重的影響[2]。斑禿的發病機制尚未明確,主要與遺傳、環境、免疫、氧化應激和情緒因素有關[3,4],其中,毛囊免疫豁免權喪失是導致斑禿的關鍵因素[5]。目前,斑禿的治療包括皮質類固醇、外用米諾地爾、蒽林、環孢素、光化學療法、接觸性免疫療法和靶向免疫治療[6]。然而,實現完全緩解而不復發仍然具有挑戰性。所以,尋找AA有效的治療靶點和新的治療方案是目前研究的重要方向。

CeO2納米酶可以模擬一些天然酶的催化活性,如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶、氧化酶、磷酸酶等[7]。CeO2納米酶可利用其SOD酶活性清除細胞內ROS,從而防止細胞受到氧化應激損傷[8]。目前,CeO2納米酶在雄激素性脫發、銀屑病、視網膜變性、神經系統疾病、缺血、心臟疾病、糖尿病、胃腸道炎、肝臟疾病和癌癥等疾病中都展現了較好的治療效果[9,10]。目前,斑禿還沒有能實現完全緩解而不復發的治療方法,因此,本課題組采用單次腹腔內注射環磷酰胺構建AA小鼠模型[11],探討CeO2納米酶對AA小鼠的作用及其效果。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

7周齡雌性C57BL/6J小鼠30只,SPF級,體質量(20±2)g,購于山西醫科大學實驗動物中心,實驗動物生產許可證號SCXK(晉)2019-0004。

1.2 主要試劑與儀器

環磷酰胺注射液購自德國Baxter Oncology GabH;異氟烷購自河北一品制藥股份有限公司;ICAM-1及ELAM-1試劑盒購自睿信生物科技;MDA及SOD試劑盒購自南京建成生物工程研究所;DNM-9602酶標儀為北京普朗新技術有限公司產品;Optima XE超速離心機購于美國Beckman公司。透射電子顯微鏡購于美國FEI公司。

1.3 CeO2納米酶制備方法

將108.6 mg硝酸鈰[0.25 mmol的Ce(NO3)3·6H2O]溶解在10 mL的去離子水中,得到硝酸鈰水溶液。同時,131.2 mg 6-氨基己酸(1 mmol,AHA)和5 μL鹽酸(37%)在磁性攪拌下溶于1 mL去離子水中。然后,將硝酸鈰的水溶液迅速在空氣中加熱到95 ℃,加入已配制完成的AHA和鹽酸混合溶液。反應持續6 h,將所得的溶液降至室溫,用丙酮清洗3次,除去過量的反應物,即可獲得CeO2納米酶。為了研究CeO2納米酶結構,將樣品溶在水中滴在超薄碳網上并烘干,進行透射電子顯微鏡的測試。

1.4 模型制備及分組

7周齡C57BL/6J小鼠隨機分為3組,分別為空白組、模型組和CeO2納米酶組,每組10只。吸入適量異氟烷后,使用動物專用刮毛刀將背部毛發剃除2 cm×3 cm區域,隨后剃毛區域涂抹適量脫毛膏。此時,小鼠背部毛發呈粉紅色,從而誘導小鼠背部毛囊從休止期進入生長期。剃毛后第9天,空白組小鼠給予腹腔內單次注射等劑量的生理鹽水,模型組和CeO2納米酶組小鼠均單次腹腔內注射環磷酰胺注射液[11]。定時拍照觀察毛發生長及脫落情況,對新生毛發狀況進行打分。評分標準:無毛生長為0分;淺毛生長滿脫毛區為1分;新生毛長度及密度約為未脫毛區的一半為2分;新生毛長與未脫毛區無差別為3分[12]。

1.5 HE染色觀察小鼠斑禿處毛發組織病理改變

實驗完成后,通過頸椎脫臼處死所有小鼠,用剃毛刀將小鼠背部毛發脫干凈,取小鼠背部治療后的皮膚組織進行包埋、脫水及HE染色,觀察鏡檢下組織病理學特點及顯微鏡下每個視野的毛囊計數。

1.6 ELISA檢測小鼠血清ICAM-1及ELAM-1含量

實驗第28天,通過尾靜脈取血,6 000g離心10 min,取血清,使用ELISA法檢測小鼠血清中ICAM-1及ELAM-1含量水平,均嚴格按照相應試劑盒說明操作,最后使用酶標儀測定450 nm處吸光度值,并根據繪制的標準曲線計算各樣品中待測指標含量水平。

1.7 小鼠皮膚組織中MDA及SOD含量檢測

取小鼠背部治療后的皮膚組織,用玻璃研磨機和PBS徹底研磨得到勻漿,6 000g離心10 min,取上清,按照試劑盒說明書檢測禿發區皮膚組織中MDA及SOD含量。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 CeO2納米酶表征

透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy, TEM)下觀察CeO2納米酶形態,結果觀察到制備所得的CeO2納米酶形貌規整、分散均勻、尺寸均一(見圖1)。

圖1 CeO2納米酶表征Figure 1 Characterization of CeO2 nanoenzymes

2.2 小鼠禿發區毛發生長情況及評分

模型組背部禿毛區毛發很短,顏色灰白;空白組背部剃毛區毛發較模型組長,毛發致密,CeO2納米酶組背部禿發區毛發致密,毛色烏黑光澤(見圖2)。模型組小鼠禿發區毛發生長評分明顯低于空白組(P<0.05);CeO2納米酶組小鼠禿發區域毛發生長評分均明顯高于模型組(P<0.05,見圖3)。

圖2 小鼠禿發區毛發生長情況Figure 2 Hair growth in the bald area of mice

注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。圖3 各組小鼠禿發區毛發評分Figure 3 Hair scores in the bald area of mice in each group

2.3 小鼠禿發區病理組織學改變

鏡檢可見模型組表皮增厚,毛囊數量減少;空白組表皮較薄,毛囊處于生長期;CeO2納米酶組毛囊數量明顯增加且處于生長期(見圖4)。模型組小鼠背部皮膚組織HE單位視野下的毛囊數量低于空白組(P<0.05);CeO2納米酶組單位視野毛囊數量顯著高于模型組(P<0.05,見圖5)。

圖4 禿發區皮膚組織病理學 (×10)Figure 4 Skin histopathology in bald area (×10)

2.4 小鼠血清ICAM-1及ELAM-1水平

模型組血清中ICAM-1水平較空白組升高(P<0.05),CeO2納米酶組血清中水平低于模型組(P<0.05,見圖6)。模型組血清中ELIAM1水平較空白組升高(P<0.05),CeO2納米酶組血清中水平低于模型組(P<0.05,見圖6)。

注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。圖6 CeO2納米酶小鼠血清中ICAM-1和ELAM-1含量的影響Figure 6 Effect of CeO2 nanoenzyme on serum contents of ICAM-1 and ELAM-1 in mice

2.5 小鼠禿發區皮膚組織中MDA及SOD含量

模型組皮膚組織中MDA含量較空白組升高(P<0.05),CeO2納米酶組MDA含量較模型組降低(P<0.05,見圖7)。模型組皮膚組織中SOD含量較空白組降低(P<0.05),CeO2納米酶組SOD含量較模型組升高(P<0.05,見圖7)。

注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。圖7 CeO2納米酶對小鼠皮膚組織中MDA和SOD含量的影響Figure 7 Effect of CeO2 nanoenzyme on MDA and SOD contents in mouse skin

3 討論

AA作為一種自身免疫性炎癥性脫發,嚴重影響了患者的生活治療,目前缺乏有效預防及治愈AA的方法,多種針對免疫細胞的療法用于治療AA,但是效果具有個體差異[3,13]。氧化應激作為AA發病機制之一,為AA的治療提供新的治療靶點。

CeO2納米酶具有SOD樣活性,可保護細胞免受氧化應激的損傷,擁有強大的抗氧化能力,這種抗氧化能力源于CeO2納米酶表面的雙氧化態Ce3+和Ce4+,其中Ce3+負責消除O2·和·OH,而Ce4+根除H2O2[14,15]。由于CeO2納米酶良好的抗氧化還原和儲氧能力,CeO2納米酶被廣泛應用于各種與氧化應激相關的疾病。但是目前在皮膚相關疾病中應用較少。Yuan等[10]的實驗結果表明,氧化鈰納米酶外用于雄激素脫發小鼠模型可以通過有效地改善毛囊周圍環境氧化應激水平,對毛囊周圍微血管系統的新生也有較好促進作用,從而加速毛囊由休止期進入生長期,快速誘導毛發生長,且比傳統治療藥物米諾地爾效果顯著。故本研究將CeO2納米酶應用于斑禿小鼠模型,觀察其治療效果。結果發現,與空白組相比,模型組皮膚組織中MDA含量升高及SOD含量下降,經過CeO2納米酶治療后,CeO2納米酶組皮膚組織中MDA含量降低及SOD含量升高。提示,CeO2納米酶可以通過清除過量的活性氧積累,有效地調控皮膚中氧化應激,減輕氧化損傷,從而促進毛發生長,與上述文獻研究結論一致。

綜上所述,本研究表明CeO2納米酶可以通過抗氧化應激清除活性氧從而促進AA小鼠模型毛發生長,達到治療的目的,CeO2納米酶可能成為治療AA的新型藥物的研究方向。但本研究存在以下局限性:首先,本研究通過腹腔內注射環磷酰胺構建斑禿小鼠模型,其發病機制與人類斑禿并非完全吻合;其次,本研究僅在動物模型層面考察了CeO2納米酶治療AA的可能作用,并未在細胞層面進一步研究深入揭示CeO2納米酶發揮作用的具體分子機制。因此,在后續研究中,需要進一步構建更符合人類斑禿的動物模型并在細胞和分子層面論證CeO2納米酶治療AA的具體機制,并深入探究CeO2納米酶治療AA的優勢和不足。