慢性萎縮性胃炎及癌前病變復合造模法評價

劉雨溪,王 璐,龍凱花,劉 洋,靳景瑞,張 紅,(陜西省中醫藥研究院中藥研究所,西安 7000;陜西中醫藥大學藥學院;中國醫科大學臨床二系;通訊作者,E-mail:zhanghong9999@6.com)

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)是一種消化系統常見疾病,其特征是胃黏膜因潰瘍、糜爛和慢性炎癥而失去正常的腺上皮,導致黏膜損傷和功能障礙[1]。在臨床上,CAG患者常表現為上腹部隱痛、脹滿、噯氣和食欲不振等消化系統癥狀。此外,一些患者還會出現胃食管反流和膽汁反流等問題,這些問題對生活質量產生了嚴重的影響[2]。1975年,Correa[3]提出了一個漸進演變模式:正常胃黏膜—淺表性胃炎—萎縮性胃炎—腸上皮化生—異型增生—胃癌。而后1978年世界衛生組織將CAG列入癌前狀態,受到了醫學界的普遍重視[4]。胃癌是一種常見的惡性腫瘤,胃癌位居2022年中國癌癥發病率和死亡率的前三位,并且發病率均位居世界前列,造成沉重的疾病負擔[5]。目前胃癌尚無滿意的治療方法且發病機制不完全清楚,但眾所周知,CAG是胃癌發生發展的主要因素之一[6]。因此,成功治療CAG可能有助于預防胃癌的發生。若能逆轉CAG,則可成為防治胃癌前病變(precancerous lesions,PLGC)及降低胃癌發生率的重要措施。為了實現對CAG及胃癌的逆轉和預防,需要建立動物模型并進行實驗研究以深入探究其發病機制和治療方法。目前對CAG或PLGC動物模型的建立包括單化學因素或多化學因素造模法、物理刺激法、免疫造模法、幽門螺桿菌感染法、手術造模法以及中醫證候模型復制法[7]。無論采用何種方法,結果都與理想的動物模型存在一定程度的差異。由于對于藥物作用時間、劑量、成模穩定性等方面在建模期間缺乏統一的標準。因此找到穩定、可靠的動物模型復制方法成為臨床研究的重要基礎。N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)是最公認的CAG造模試劑之一,具有致癌性;脫氧膽酸鈉可中和胃酸,造成胃黏膜病變且模擬膽汁反流對胃黏膜的侵害;水楊酸鈉屬于非甾體抗炎藥,可釋放大量促炎因子從而加速黏膜炎癥;飲食不規律會造成胃酸分泌紊亂,從而對胃黏膜產生刺激,進而引發胃炎[8-10]。人體是復雜機體,病變發作往往非單一因素所致,故常采取多化學因素聯合的方式進行造模,多因素模型相對穩定可靠,可縮短造模時間,提高成模率[11]。目前雖然已有多因素造模法,但其造模效率和可復制性仍需提高[12,13]。本研究采用MNNG聯合脫氧膽酸鈉、水楊酸鈉和不定期禁食的4種因素綜合造模方法構建CAG及PLGC動物模型,以期為后續CAG及PLGC藥物開發提供符合臨床特點的動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 60只2月齡雄性SPF級SD大鼠購自西安交通大學實驗動物中心[生產許可證:SCXK(陜)2020-005],所有實驗在陜西省中醫藥研究院倫理委員會許可下進行[(2023)動物倫審第(10)號]。實驗按照3R原則進行。

1.1.2 試劑 MNNG、水楊酸鈉及脫氧膽酸鈉均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將大鼠按照體質量隨機分為對照組(n=10)和模型組(n=50)。對照組正常喂養,模型組采用MNNG(200 μg/mL)自由飲用+2%(m/V)水楊酸鈉隔日灌胃+脫氧膽酸鈉(20 mmol/L)隔日灌胃復合造模法,每周間隔禁食3 d,造模6個月。

1.2.2 檢測指標與方法 每日觀察大鼠狀態,包括毛發、糞便及活動,并監測大鼠體質量。于造模第3,4,5個月分別通過過量CO2吸入法處死送病理學診斷大鼠各3只,第6個月處死10只,處死大鼠后取胃組織進行HE染色,觀察病理變化。于造模結束后采用混合純氧進行麻醉,通過氧氣氣流使異氟烷揮發,異氟烷濃度2%～3%,麻醉5 min。通過眼眶取血采對照組和模型組大鼠血液,采用ELISA法檢測每只大鼠血清中胃蛋白酶原Ⅰ(PG Ⅰ)、胃蛋白酶原Ⅱ(PG Ⅱ)及胃泌素17(G-17)含量。

1.3 統計學方法

采用Graphpad Prism 8.0軟件進行統計分析。兩組動物生存曲線采用Kaplan-Meier法進行統計。兩組PG Ⅰ、PG Ⅰ與PG Ⅱ比值(PG R)、G-17數據經檢驗符合正態分布且方差齊,使用獨立樣本t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠臨床體征

對照組大鼠體形肥胖,毛色光亮,反應靈敏,飲食、飲水量正常,大便成形,視力正常。模型組大鼠自第3個月開始體形均明顯較對照組瘦小,皮毛發黃,喜蜷臥扎堆,反應遲鈍,部分大鼠大便質稀、視力不佳。

2.2 各組大鼠死亡情況

模型組大鼠于第3個月開始出現死亡,至第6個月模型成功。除第3,4,5個月分別常規處死送病理學診斷大鼠各3只,及第6個月處死10只外,異常死亡6只,死亡率12%,異常死亡大鼠經解剖發現5只出現嚴重胃腸脹氣,1只為灌胃嗆咳窒息。對照組大鼠無死亡。造模過程中,大鼠生存曲線見圖1。

圖1 對照組和模型組造模過程中大鼠生存曲線Figure 1 Survival rate of control and model rats during the modeling

2.3 各組大鼠體質量比較

與對照組相比,模型組大鼠于第1個月開始明顯降低(P<0.05);第2～6個月模型組大鼠體質量較穩定,有輕微下降趨勢,對照組大鼠體質量隨時間穩步增長(見圖2)。

注:與同時點對照組比較,**P<0.05。圖2 對照組和模型組造模過程中大鼠體質量變化Figure 2 Changes of body weight during the modeling in control group and model group

2.4 各組大鼠胃黏膜病理組織學比較

HE染色結果顯示:對照組大鼠胃組織黏膜無異常,胃腺細胞形態結構正常,未見炎癥(見圖3A);大鼠造模3個月,胃組織黏膜層可見少量上皮細胞與較多胃腺細胞脫落,固有層可見多處輕度出血,局部可見少量胃腺細胞壞死,黏膜下層可見水腫,結締組織排列疏松(見圖3B);大鼠造模4個月,大量胃腺細胞壞死脫落,核固縮深染或碎裂,黏膜腺體減少,有明顯間質纖維增生(見圖3C);大鼠造模5個月,胃黏膜層變薄,黏膜腺體減少,間質纖維增生并伴隨少量炎細胞浸潤(見圖3D);大鼠造模6個月,可見慢性萎縮性胃炎的典型病理特征,胃組織可見大量胃腺擴張,小面積潰瘍,多量黏膜上皮細胞壞死脫落,固有層胃腺壞死,結構消失,結締組織增生,伴少量淋巴細胞浸潤,多量胃腺腔內可見少量粒細胞,大面積黏膜層與肌層分離(見圖3E)。造模6個月,部分大鼠胃部形成隆起型腫瘤,呈不規則狀,血管豐富;組織可見廣泛性全層壞死,黏膜上皮及大量胃腺結構消失,伴有較多的粒細胞、淋巴細胞及巨噬細胞浸潤,結締組織增生修復,腔內多見壞死細胞碎片,腫瘤細胞浸潤至固有層,此為胃癌的病理特征(見圖3F)。

注:A.對照組;B.模型組3個月;C.模型組4個月;D.模型組5個月;E.模型組6個月出現胃黏膜萎縮;F.模型組6個月出現胃癌。圖3 大鼠胃黏膜病理變化Figure 3 Pathological changes of gastric mucosa in rats

造模結束后,對照組大鼠胃組織無病變,模型組10只大鼠全部出現胃黏膜萎縮,4只出現不同程度的異型,2只出現腸上皮化生,1只出現胃癌(見表1,2)。

表1 各組大鼠造模6個月后胃黏膜病理改變 例(%)Table 1 Pathological changes of gastric mucosa in rats in each group after 6-month modeling cases(%)

表2 各組大鼠造模6個月后胃黏膜病變程度比較 例(%)Table 2 Comparison of the degree of gastric mucosal lesion of rats between two groups after 6-month modeling cases(%)

2.5 各組大鼠血清PG Ⅰ、PG R、G-17比較

造模結束后采集大鼠血清,檢測結果顯示,與對照組比較,模型組PG Ⅰ升高,PG R降低,G-17降低(均P<0.05,見圖4)。PG Ⅰ偏高代表胃酸分泌增加,PG R降低與腺體萎縮、上皮化生及異型增生相關,G-17偏低提示可能出現胃黏膜萎縮、胃潰瘍或胃癌等器質性胃部疾病。以上結果均能證明模型組大鼠已出現CAG相關癥狀。

注:與對照組比較,**P<0.05。圖4 對照組和模型組大鼠血清PG Ⅰ、PG R、G-17比較Figure 4 Comparison of PG Ⅰ, PG R, and G-17 in rat serum between control group and model group

3 討論

本研究采用復合造模法成功構建了大鼠CAG癌前病變模型。隨著對CAG的發病機制及治療藥物研究的深入,出現多種多樣的動物實驗造模方法。目前,常用造模方法包括化學造模法、物理刺激法、免疫造模法、幽門螺桿菌感染法、手術造模法以及中醫證候模型復制法等。其中化學造模法雖然實驗周期較長、操作次數多,但成模率相對較高、穩定性好、操作也較為簡單。但運用化學法造模時,若只使用單因素,成功率低,因此,復合造模法應用更為廣泛。

在復合造模法中,MNNG起主要作用,MNNG作為一種化學誘癌劑,主要模擬不當攝入硝酸鹽后在胃內轉化為亞硝酸胺等致癌物質,從而導致CAG、PLGC甚至胃癌的發生。CAG造模的研究中,MNNG自由飲用或定量灌胃法均有使用。有研究觀察了不同給藥劑量及給藥途徑的MNNG對大鼠胃黏膜組織病理學的影響,發現MNNG自由飲用聯合灌胃、雷尼替丁飼料、饑飽失常、燙熱高鹽飲食能成功誘導大鼠PLGC模型;但大劑量MNNG灌胃使PLGC誘變率降低,死亡率上升,并出現明顯前胃鱗狀上皮病變[12]。因此本研究在既往研究的基礎上進行優化,采用MNNG自由飲用法,聯合其他因素進行造模,從而提高造模的成功率和穩定性,并降低死亡率。

MNNG不依賴于酶的代謝作用,而是直接作用于胃黏膜上皮,使原有DNA鏈上的堿基發生突變,誘導胃炎、癌前病變或胃癌的發生。大鼠的胃、肝、腎都有將MNNG轉化為MNG從而導致MNNG失活的能力,但胃的轉化能力最差,并且MNNG更易滲透胃幽門部和胃底部黏膜,所以通常選用MNNG誘導CAG或PLGC[13]。但人類CAG和PLGC通常是多因素共同作用的結果,目前也普遍認為聯合應用一些刺激因素造成胃黏膜非特異性損傷可提高CAG及PLGC的誘發率。飲食不規律會造成胃酸分泌紊亂,從而對胃黏膜產生刺激,進而引發胃炎;脫氧膽酸鈉可誘導膽汁酸代謝紊亂和胃部菌群失調,造成胃黏膜病變且模擬膽汁反流對胃黏膜的侵害;水楊酸鈉對胃黏膜的損傷表現在對局部的直接刺激作用引起胃黏膜炎性反應,胃黏膜細胞剝脫,并抑制胃黏膜的生長。本研究使用的MNNG+水楊酸鈉+脫氧膽酸鈉配合不定期禁食的復合造模法,相比其他以MNNG為主的造模方法[12,13],動物死亡率更低,穩定性更高,能夠成功且穩定地構建CAG及PLGC模型,但由于動物個體差異,造模進程難以完全統一,檢測標準以PG Ⅰ、PG R、G-17及病理切片結果為主,所以CAG和PLGC模型之間的差異難以明確鑒別。造模6個月發現有個別大鼠已出現癌變,這也提示該造模方法能夠造成胃癌模型,但造模成功率及穩定性有待進一步驗證。

CAG是臨床常見慢性病,然而目前針對CAG的治療方法都不盡如人意,新型有效的治療方案亟待開發。構建成熟可復制的CAG動物模型,并從細胞和分子層面了解CAG病變的發病機制及演變過程,為研發防治CAG藥物提供基礎。本研究提供了一種行之有效的CAG大鼠造模方法,未來將在此方法的基礎上繼續完善,希望找到更加高效的造模方法,并能找到CAG與PLGC模型間的差別,為制定成功率高且簡單易行的造模方法提供參考,為后續CAG及PLGC藥物開發提供符合臨床特點的動物模型。