沉默lncRNA XIST對阿霉素誘導的擴張型心肌病的影響及其機制

薛松妍,薛 強,王方圓,周 倩,姜 銘,馬 靜(空軍軍醫大學第一附屬醫院中醫科,西安 7003;空軍軍醫大學第一附屬醫院心內科;通訊作者,E-mail:jingma@fmmu.edu.cn)

擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)是一種非缺血性心肌病,具有結構性和功能性心肌異常,主要特征表現為心臟左心室擴張,并伴有左心室或雙心室收縮功能障礙,而由于心肌功能紊亂,DCM也是導致心臟衰竭或猝死的主要誘因之一[1,2],DCM預后較差,5年存活率約為50%,10年存活率為25%[3]。數十年的研究結果揭示了DCM的發病存在多種因素,主要包括基因突變、感染、炎癥、自身免疫疾病、接觸毒素和內分泌紊亂等[4]。在DCM的病理發展過程中,心肌細胞逐漸發生各種變化,導致心肌功能和形態受損,進而導致心室擴張時收縮性能下降[5]。心肌細胞凋亡和纖維化是導致DCM發展的兩個主要過程,而膠原蛋白和其他細胞外基質(extracellular matrices,ECM)蛋白在ECM中的積累,以及心肌細胞的凋亡導致了心肌纖維化,這些過程導致了左心室擴張和僵硬,心室被拉伸,最終誘發心臟功能障礙[6]。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)是指一類長度大于200個核苷酸的RNA,研究表明lncRNA MALAT1[7]、lncRNA CARL[8]和lncRNA H19[9]等lncRNAs與DCM的心肌纖維化和心肌細胞凋亡過程有關。X-無活性特異性轉錄物(X-inactive specific transcript,XIST)是一種與癌細胞凋亡和肺等組織纖維化密切相關的lncRNA[10],有研究發現XIST促進心肌肥厚的病理發展[11]以及心肌缺血再灌注后心肌細胞的凋亡進程[12]。目前,大鼠腹腔注射阿霉素是DCM動物研究層面主流的造模方法,研究顯示,阿霉素誘導后大鼠出現明顯的心肌肥大、纖維增生和細胞凋亡等心肌損傷癥狀[13,14]。本研究旨在探究XIST對阿霉素誘導的DCM大鼠心肌纖維化和心肌細胞凋亡的影響,以及其涉及的調控機制,以期為DCM的臨床檢驗和治療提供新的靶標。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑和儀器 蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(C0105S)和TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(綠色熒光,C1086)購自上海碧云天生物技術有限公司,改良Masson三色染色試劑盒(G1346)購自北京索萊寶科技有限公司。LipofectamineTM2000轉染試劑(11668030)和LipofectamineTM3000轉染試劑(L3000001)均購自美國Invitrogen公司。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(E1910)購自美國Promega公司。一抗PDGFC(ab93899)、α-SMA(ab5694)、collagen Ⅰ(ab138492)、TGF-β1(ab215715)和GAPDH(ab8245)均購自美國Abcam公司。VividE9彩色超聲影像系統購自美國GE公司。

1.1.2 實驗細胞和動物 大鼠心肌細胞(H9c2細胞系,GNR 5)和DMEM完全培養液(含10% FBS,MD02)均購自中國科學院細胞庫。7～8周齡SPF級雄性SD大鼠(260～320 g)購自陜西中醫藥大學[生產許可證:SCXK(陜)2021-001],大鼠屏障環境飼養條件:溫度24～26 ℃,濕度50%～60%,12 h循環照明。

1.2 方法

1.2.1 DCM大鼠建模和分組轉染處理 參考文獻[15]所述方法建立阿霉素誘導的擴張型心肌病大鼠模型,采用0.9%氯化鈉配制1 mg/mL的阿霉素溶液,大鼠腹腔注射劑量為2.5 mg/kg的阿霉素溶液,每周1次,共注射6周。末次注射阿霉素溶液2周后對造模大鼠行超聲檢查,以左室射血分數(left ventricular ejection fraction,LVEF)<30%判定造模成功[14]。本研究中共有37只大鼠DCM建模成功,隨機選擇30只分為模型組、sh-NC組和sh-XIST組,每組10只;另取10只健康SD大鼠為對照組。建模成功后,sh-NC組和sh-XIST組大鼠分別給予尾靜脈注射sh-NC和sh-XIST,每周1次,共持續4周;對照組和模型組大鼠同期給予尾靜脈注射等量0.9%氯化鈉溶液。末次處理48 h后,采集樣本進行各項指標檢測。

1.2.2 大鼠心臟功能指數檢測 末次處理48 h后,采用VividE9彩色超聲影像系統(探頭6S-D,2.7～8.0 MHz)檢測各組大鼠心臟功能指數左室收縮末期內徑(left ventricular end systolic diameter,LVESD)、左室舒張末期內徑(left ventricular end diastolic diameter,LVEDD)和LVEF。

1.2.3 HE染色檢測大鼠心肌組織病理學變化 各組大鼠采用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后處死,開腔取心臟組織,生理鹽水沖洗干凈后,部分-80 ℃凍存待測,另一部分采用4%多聚甲醛固定處理,采用常規方法制作4 μm石蠟切片染色備用。按照HE染色試劑盒所述染色方法,切片經過二甲苯脫蠟和無水乙醇分級水化處理,加入蘇木素染色液染色10 min,蒸餾水洗片后再加入伊紅染色液染色1 min,乙醇分級脫水后用二甲苯透明處理,然后中性樹膠封片,顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 Masson三色染色檢測大鼠心肌組織病理學變化 取各組大鼠制備好的石蠟切片,按照改良Masson三色染色試劑盒所述染色方法,切片經過媒染液浸染,然后依次天青石藍染液、蘇木素染液、分化液、麗春紅品紅染液、磷鉬酸以及苯胺藍染液染色處理后,無水乙醇脫水和二甲苯透明,然后中性樹膠封片,顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 DCM細胞模型構建和分組轉染處理 參考文獻[16]所述,采用大鼠心肌細胞H9c2細胞系構建DCM細胞模型。H9c2細胞采用DMEM培養基(含10% FBS,青霉素100 U/mL,鏈霉素100 U/mL)培養,5% CO2和37 ℃培養箱中培養。H9c2細胞常規培養,取對數期細胞轉接至6孔板,加入阿霉素溶液(終濃度3 μmol/L)處理24 h后進行轉染。按照實驗設計,取未經阿霉素處理的H9c2細胞作為對照組,而將阿霉素處理后的H9c2細胞分為模型組、sh-NC組、sh-XIST組、sh-XIST+miR-NC組和sh-XIST+miR-149-5p inhibitor組,其中sh-NC組和sh-XIST組細胞采用LipofectamineTM2000分別轉染sh-NC和sh-XIST,sh-XIST+miR-NC組細胞共轉染sh-XIST和miR-NC,sh-XIST+miR-149-5p inhibitor組細胞共轉染sh-XIST和miR-149-5p inhibitor。轉染完成后,繼續常規培養,48 h后收集各組細胞待測。

1.2.6 雙熒光素酶報告試驗分析XIST、miR-149-5p和PDGFC的靶向關系 采用ENCORI/starBase軟件分析XIST與miR-149-5p結合位點情況,TargetScanHuman軟件分析miR-149-5p和PDGFC結合位點情況。構建野生型WT-XIST、突變型MUT-XIST、野生型WT-PDGFC 3′UTR和突變型MUT-PDGFC 3′UTR具有miR-149-5p結合位點的熒光素酶報告質粒。采用LipofectamineTM3000轉染試劑將WT-XIST、MUT-XIST、WT-PDGFC 3′UTR和MUT-PDGFC 3′UTR與mimics-NC或miR-149-5p mimics共轉染至靶細胞,轉染48 h后,按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明方法檢測熒光素酶活性。

1.2.7 TUNEL和流式細胞術檢測大鼠心肌細胞凋亡水平 采用TUNEL染色法檢測大鼠心肌組織心肌細胞凋亡水平。取各組大鼠制備好的石蠟切片,按照一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒所述檢測方法,切片經過二甲苯脫蠟和梯度濃度乙醇分級水化后,滴加20 μg/mL不含DNase的蛋白酶K作用20 min,PBS洗片,再加入50 μL的TUNEL檢測液,于37 ℃避光孵育1 h,PBS洗片后采用抗熒光淬滅封片液封片,于熒光顯微鏡下觀察,并使用Image J軟件進行定量分析。

采用流式細胞術檢測大鼠心肌細胞H9c2細胞凋亡水平。轉染完成培養48 h后,3 000 r/min離心5 min收集H9c2細胞,預冷的PBS溶液重懸細胞,3 000 r/min離心5 min,去除上清,加入195 μL結合液輕柔重懸細胞,再依次加入5 μL的Annexin Ⅴ-FITC和10 μL的PI染液,輕柔混勻室溫下避光孵育15 min,然后流式細胞儀上機檢測細胞凋亡率。

1.2.8 RT-qPCR分析XIST、miR-149-5p和PDGFC表達水平 分別取各組大鼠于-80 ℃凍存的心肌組織,剪成小塊于冰上充分勻漿,另收集各組H9c2細胞,采用TRIzol試劑分離提取心肌組織和H9c2細胞的總RNA。以總RNA為模板反轉錄獲得cDNA,然后再進行RT-qPCR反應,程序為:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,40個循環。采用2-ΔΔCt分析基因相對表達量,GAPDH作為XIST和PDGFC內部對照,U6作為miR-149-5p的內部對照。XIST引物序列,F:5′-CGGGTCTCTTCAAGGACATTTAGCC-3′,R:5′-GCACCAATACAGAGGAATGGAGGG-3′;miR-149-5p引物序列,F:5′-GGCTCTGGCTCCGTGTCTT-3′,R:5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′;PDGFC引物序列,F:5′-GCCAA-AGAACGGGGACTCG-3′,R:5′-AGTGACAACTCT-CTCATGCCG-3′。

1.2.9 Western blot分析PDGFC、α-SMA、collagen Ⅰ和TGF-β1蛋白表達水平 分別取各組大鼠于-80 ℃凍存的心肌組織,剪成小塊于冰上充分勻漿,另收集各組H9c2細胞,分別加入RIPA裂解液充分反應后離心收集提取總蛋白,BCA法進行定量分析。采用12% SDS-PAGE電泳分離蛋白,然后轉移至PVDF膜,再經5%脫脂牛奶封閉處理2 h。TBST溶液洗膜,加入一抗PDGFC(1∶1 000)、α-SMA(1∶1 000)、collagen Ⅰ(1∶1 000)、TGF-β1(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000),4 ℃下過夜孵育。再加入二抗辣根過氧化物酶標記的IgG(1∶1000),室溫下孵育處理2 h,TBST溶液洗膜,ECL超敏發光液處理,曝光后凝膠系統成像拍照,采用Image J軟件進行蛋白條帶灰度值分析,GAPDH作為內部對照。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 DCM大鼠心臟功能指標和病理學變化

與對照組比較,模型組大鼠LVESD和LVEDD指標均升高(P<0.05),LVEF指標降低(P<0.05,見表1和圖1);心肌細胞排列紊亂,出現細胞壞死和肥大,細胞間質增寬,出現大量膠原沉積和纖維組織增生(見圖2)。與sh-NC組比較,sh-XIST組大鼠LVESD和LVEDD指標均降低(P<0.05),LVEF指標升高(P<0.05,見表1和圖1);心肌細胞排列恢復有序,無明顯壞死細胞,膠原沉積和纖維化明顯減少(見圖2)。

圖1 各組大鼠心臟功能超聲檢測圖Figure 1 The cardiac function of rats in each group detected by ultrasound

表1 各組大鼠心功能指標比較結果Table 1 Comparison of cardiac function indexes between groups

2.2 DCM大鼠心肌組織纖維化和心肌細胞凋亡變化

與對照組比較,模型組大鼠心肌組織中α-SMA、collagen Ⅰ和TGF-β1蛋白表達水平以及TUNEL陽性細胞率均升高(P<0.05);與sh-NC組比較,sh-XIST組大鼠心肌組織中α-SMA、collagen Ⅰ和TGF-β1蛋白表達水平以及TUNEL陽性細胞率均降低(P<0.05,見圖3,4)。

圖3 DCM大鼠心肌組織心肌細胞凋亡水平變化Figure 3 Changes of apoptosis of cardiomyocytes in myocardium of DCM rats

2.3 沉默XIST表達對DCM大鼠心肌組織中XIST、miR-149-5p和PDGFC水平的影響

與對照組比較,模型組大鼠心肌組織中XIST表達水平及PDGFC的mRNA和蛋白表達水平均升高(P<0.01),miR-149-5p表達水平降低(P<0.01,見圖5)。與sh-NC組比較,sh-XIST組大鼠心肌組織中XIST表達水平及PDGFC的mRNA和蛋白表達水平均降低(P<0.01),miR-149-5p表達水平升高(P<0.01,見圖5)。

注:與對照組比較,**P<0.01;與sh-NC組比較,##P<0.01。圖5 沉默XIST表達對DCM大鼠心肌組織XIST、miR-149-5p和PDGFC水平的影響Figure 5 Effects of silencing XIST expression on levels of XIST, miR-149-5p and PDGFC in myocardial tissue of DCM rats

2.4 XIST、miR-149-5p和PDGFC之間的靶向關系

ENCORI/starBase軟件和TargetScanHuman軟件分析結果顯示,miR-149-5p與XIST和PDGFC之間均存在結合位點(見圖6A)。雙熒光素酶報告實驗結果顯示,與mimics-NC比較,轉染miR-149-5p mimics的WT-XIST或WT-PDGFC 3′UTR熒光素酶活性降低(P<0.05,見圖6B),進一步驗證了miR-149-5p與XIST或PDGFC之間的靶向關系。

注:與mimics-NC比較,*P<0.05。B.雙熒光素酶報告試驗分析XIST、miR-149-5p和PDGFC之間的靶向關系圖6 XIST、miR-149-5p和PDGFC之間的靶向關系分析Figure 6 Targeting relationship analysis between XIST, miR-149-5p and PDGFC

2.5 沉默XIST表達對心肌細胞凋亡的影響

與對照組比較,模型組H9c2細胞凋亡率升高(P<0.05);與sh-NC組比較,sh-XIST組H9c2細胞凋亡率降低(P<0.05);與sh-XIST+miR-NC組比較,sh-XIST+miR-149-5p inhibitor組H9c2細胞凋亡率升高(P<0.05,見圖7)。

圖7 流式細胞術檢測沉默XIST表達對H9c2細胞凋亡的影響Figure 7 Effect of silencing XIST on apoptosis of H9c2 cells detected by flow cytometry

2.6 沉默XIST表達和抑制miR-149-5p表達對心肌細胞纖維化蛋白標志物和PDGFC表達水平的影響

轉染后,與對照組比較,模型組H9c2細胞中XIST、PDGFC mRNA和蛋白以及α-SMA、collagen Ⅰ和TGF-β1蛋白表達水平均升高(P<0.05,見圖8,9),miR-149-5p表達水平降低(P<0.05,見圖9)。與sh-NC組比較,sh-XIST組H9c2細胞中XIST、PDGFC mRNA和蛋白以及α-SMA、collagen Ⅰ和TGF-β1蛋白表達水平均降低(P<0.05,見圖8,9),miR-149-5p表達水平升高(P<0.05,見圖9)。與sh-XIST+miR-NC組比較,sh-XIST+miR-149-5p inhibitor組H9c2細胞中PDGFC mRNA和蛋白以及α-SMA、collagen Ⅰ和TGF-β1蛋白表達水平均升高(P<0.05,見圖8,9),miR-149-5p表達水平降低(P<0.05,見圖9)。

注:與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與sh-NC組比較,#P<0.05,##P<0.01;與sh-XIST+miR-NC組比較,&P<0.05,&&P<0.01。圖8 沉默XIST和抑制miR-149-5p對H9c2細胞中α-SMA、collagen Ⅰ和TGF-β1蛋白表達的影響Figure 8 Effects of silencing XIST and inhibiting miR-149-5p on protein expressions of α-SMA, collagen Ⅰ and TGF-β1 in H9c2 cells

3 討論

擴張型心肌病(DCM)是指心肌在沒有如高血壓和瓣膜疾病等異常負荷的情況下,以左心室擴張和收縮功能障礙為主要特征的一類非缺血性心肌病[17]。DCM的發病率和死亡率都很高,可能導致心臟停止跳動和持續性心力衰竭[18]。臨床上通常采用超聲心動圖檢測結果對DCM做最初的判定,一般同時識別心室擴張和收縮功能障礙[19]。本研究通過阿霉素誘導構建DCM大鼠模型,結果顯示DCM大鼠心臟功能指標LVESD和LVEDD水平均升高,LVEF水平降低,表明DCM大鼠模型構建成功。

近年來,越來越多的研究表明,lncRNAs與心血管疾病的發生和調控密切相關,主要涉及對心肌細胞肥大、凋亡、自噬和再生,以及心肌組織纖維化和重構等生理功能的調控[20]。DCM的主要病理特征為心肌細胞肥大和凋亡、心肌纖維化、損傷以及產生的心室重構。由于心臟受到超負荷壓力,導致心臟成纖維細胞異常增殖,細胞外基質蛋白大量分泌和沉積,最終導致心肌組織彈性變差以及心室病理性重塑,發生心室擴張和收縮功能障礙。Cui等[21]研究發現,lncRNA CFRL通過調節miR-3113-5p/CTGF和miR-3473d/FN1軸加重心臟纖維化;Tao等[22]發現在心臟成纖維細胞中外源性過表達lncRNA GAS5,導致心臟成纖維細胞的增殖受到抑制;Chen等[23]研究顯示,lncRNA XIST通過miR-330-3p/S100B通路抑制小鼠心肌肥厚過程中的纖維化反應。本研究從動物和細胞水平探究XIST對DCM中纖維化的影響,結果顯示DCM大鼠心臟組織和H9c2細胞中XIST高表達,沉默XIST表達后,DCM大鼠心臟組織纖維化程度降低,細胞外基質膠原沉積減少,且心臟組織和H9c2細胞中α-SMA、collagen Ⅰ和TGF-β1蛋白水平也均顯著下降。而α-SMA、collagen Ⅰ和TGF-β1作為心血管疾病中組織纖維化的生物標志物已被廣泛證明[24]。因此,推測沉默XIST可能有助于緩解DCM大鼠心肌組織纖維化發展。

心肌細胞凋亡與心臟發育及其相關疾病的發生密切相關[25]。DCM發生中,由于心肌損傷產生的炎癥因子和氧自由基積累,導致機體內心肌細胞凋亡機制啟動,通過一系列調控反應誘導心肌細胞凋亡,最終導致心肌收縮功能障礙[26]?，F有的研究已發現部分lncRNA在誘導/抑制心肌凋亡中發揮作用,Chen等[27]發現H9c2細胞中lncRNA MIAT通過激活NF-κB信號通路促進心肌細胞凋亡;Zhou等[28]研究發現XIST在心肌梗死后細胞中高表達,過表達XIST可抑制心肌梗死小鼠心臟細胞增殖,并促進細胞凋亡;Xiao等[29]研究結果顯示,XIST通過miR-101/TLR2軸調控苯腎上腺素誘導的心肌細胞肥厚,過表達XIST可以促進心肌細胞凋亡引發心衰。本研究中,無論是在大鼠心肌組織還是心肌細胞系H9c2細胞中,沉默表達XIST后,心肌細胞凋亡水平均降低,這表明XIST是促進細胞凋亡的功能角色,這與目前所報道的XIST在心肌細胞凋亡中的功能一致。

本研究中,通過靶向關系分析發現miR-149-5p與lncRNA XIST和血小板源性生長因子C(platelet-derived growth factor C,PDGFC)均存在結合位點,預示三者間存在某種調控關系。Liu等[30]研究發現敲低XIST可通過促進miR-149-5p表達而降低DNMT3A表達水平,進而抑制軟骨細胞凋亡和細胞外基質蛋白降解;研究發現肝纖維化模型小鼠的肝臟中miR-149-5p低表達,而過表達miR-149-5p可以有效抑制肝纖維化[31]。PDGFC可以通過自分泌的方式刺激成纖維細胞的增殖,在纖維化、新生血管、動脈粥樣硬化和再狹窄中具有重要意義[32]。本研究發現DCM大鼠心肌組織或阿霉素誘導的H9c2細胞中XIST和PDGFC高表達,而miR-149-5p低表達;沉默XIST表達后,miR-149-5p表達水平升高,而PDGFC表達水平降低,同時心肌細胞凋亡和心肌組織纖維化水平均降低,結合生信分析結果,可以預測XIST是否是通過調控miR-149-5p和PDGFC的表達而對DCM大鼠心肌組織纖維化和心肌細胞凋亡產生影響。

綜上所述,DCM大鼠心肌組織或阿霉素誘導的H9c2細胞中XIST和PDGFC高表達,miR-149-5p低表達;沉默XIST表達后,DCM大鼠心肌組織纖維化水平和心肌細胞凋亡水平均降低。表明,沉默XIST可能通過上調miR-149-5p表達和抑制PDGFC表達,進而抑制阿霉素誘導的DCM大鼠心肌纖維化和心肌細胞凋亡水平,從而改善DCM的發展。