基于網絡藥理學與分子對接技術探討寧脂膠囊治療高脂血癥的作用機制

謝 昊，李耀洋，趙 彬，楊 丹，吳群勵*

中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院 1. 藥劑科；2. 中醫科，北京 100730

高脂血癥,又稱血脂異常,通常指血清中膽固醇(cholesterol, CH)、三酰甘油(triglyceride, TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)水平升高,高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)水平降低。臨床上將高脂血癥分為高CH血癥、高TG血癥、混合型高脂血癥和低HDL-C血癥。2018年全中國調查結果顯示,≥18歲成人血脂異?？偦疾÷蕿?5.6%[1]。高脂血癥是冠心病等動脈粥樣硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease, ASCVD)重要且獨立的危險因素,在中國超過一半的心血管疾病負擔由動脈粥樣硬化所致[2]。面對ASCVD疾病負擔不斷上升的趨勢,血脂管理刻不容緩[3]。

寧脂膠囊(原為降脂中藥片),是北京協和醫院中醫科梁曉春根據其多年臨證經驗而研創的院內制劑,主要由何首烏、荷葉、姜黃、決明子、蒲黃、太子參、郁金、澤瀉組成[4]。臨床研究與動物實驗均證實寧脂膠囊具有良好的降血脂作用[4-6]。然而,寧脂膠囊的關鍵藥物、關鍵成分、關鍵靶點及信號通路尚不明確。中藥成分復雜,傳統的“一個藥物、一個靶點、一種疾病”的藥理學思路不符合中藥作用機理。網絡藥理學是融合系統生物學、生物信息學、網絡科學等的交叉學科,從系統層次和生物網絡的整體角度,解析藥物與疾病之間的分子關聯,可解釋中藥多成分、多靶點的協同作用,其研究理念與中醫藥學整體論思想相符。此外,分子對接是研究小分子與靶點間相互作用的模擬計算方法,通過結合能及氫鍵數量可進一步驗證中藥小分子與靶點的結合活性。本文利用網絡藥理學與分子對接技術,分析寧脂膠囊的關鍵藥物及其關鍵成分,探索其治療高脂血癥的潛在藥理靶點,旨在為該方的臨床應用及后續深入基礎研究提供依據。

1 資料與方法

1.1 藥物成分靶點庫建立

使用以下檢索詞,檢索BATMAN-TCM數據庫(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.

php/),獲取寧脂膠囊組成藥物的成分及預測靶點:“HE SHOU WU” “HE YE” “JIANG HUANG” “JUE MING ZI” “PU HUANG” “TAI ZI SHEN” “YU JIN” “ZE XIE”。篩選相似性模型閾值score cutoff≥20的預測靶點并整理,建立藥物成分靶點庫。

1.2 高脂血癥靶點庫建立

以“hyperlipidemia”為關鍵詞,檢索DisGeNET數據庫(https://www.disgenet.org)與GeneCards數據庫(https://www.genecards.org),獲取高脂血癥相關靶點。DisGeNET數據庫中以“score_gda”,GeneCards數據庫中以“relevance score”作為靶點與疾病的相關性評分。篩選兩個數據庫中相對分≥0.10的靶點,合并、去重并整理(白蛋白除外),建立高脂血癥靶點庫(score_gda相對分=score_gda/score_gda最高值;relevance score相對分=relevance score/relevance score最高值)。

1.3 潛在藥理靶點獲取

使用Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)工具,獲取藥物成分靶點庫與高脂血癥靶點庫的共同靶點,并構建韋恩圖。共同靶點即為寧脂膠囊降脂的潛在藥理靶點,相關成分即為潛在藥理成分。選取“score_gda相對分”與“relevance score相對分”兩者中的高值,作為潛在藥理靶點的相對分。

1.4 蛋白質-蛋白質互作

將潛在藥理靶點輸入STRING數據庫(https://cn.string-db.org/cgi/input.pl),物種選擇為人類(homo sapiens),最低相互作用閾值為0.70(高置信度),獲取蛋白質-蛋白質互作(protein-protein interaction,PPI)分析結果。

1.5 基因本體論及通路富集分析

將潛在藥理靶點輸入DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov),物種選擇為人類,靶點名稱為官方基因名稱(official_gene_symbol),獲取基因本體論(gene ontology,GO)與京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析結果,P<0.05作為篩選標準?；虮倔w論分析包括:生物學過程(biological process,BP)、細胞組分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)。

1.6 分子對接驗證

從PDB蛋白質結構數據庫(https://www. rcsb.org)獲取靶點的3D結構.pdb格式文件(選擇分辨率更高的結構),使用PyMOL2.5.5去除其中的配體(如果含有)及非蛋白質分子(如水分子)。使用ZINC數據庫(https://zinc.docking.org)獲取藥物成分的ZINC編碼。將.pdb格式文件上傳SwissDock在線分子對接網站(http://swissdock.ch)作為受體,并輸入成分的ZINC編碼作為配體,進行分子對接,獲取結合能(blinding energy)數據。一般認為結合能<-4.25 kcal/mol表示配體小分子與受體蛋白之間有一定的結合活性;結合能<-5.00 kcal/mol表明二者之間有較好的結合活性;結合能<-7.00 kcal/mol表明配體與受體具有強烈的結合活性。

2 結果

2.1 潛在藥理靶點

從BATMAN-TCM數據庫獲得寧脂膠囊組成藥物的185個結構已知的成分,靶點預測獲得1 432個score cutoff≥20的靶點。從DisGeNET數據庫檢索得471個高脂血癥相關靶點(hyperlipidemia,C0020473),以score_gda相對分≥0.10標準篩選最終獲得72個靶點。從GeneCards數據庫檢索得2 105個高脂血癥(hyperlipidemia)相關靶點,以relevance score相對分≥0.10標準篩選最終獲得28個靶點。將藥物預測靶點與高脂血癥相關靶點進行交叉映射,最終獲得32個共同靶點,作為潛在藥理靶點(圖1,表1)。其中,載脂蛋白E(apolipoprotein E,APOE)、一氧化氮合酶3(nitric oxide synthase 3,NOS3)、過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxi-some proliferator activated receptor alpha,PPARA)高脂血癥相關性評分最高。

表1 寧脂膠囊組成藥物的靶點數量Table 1 Number of targets of the drugs in Ningzhi capsule

圖1 藥物預測靶點-高脂血癥相關靶點韋恩圖Fig 1 The Venn diagram of the predicted targets of drugs and hyperlipidemia related targets

2.2 藥物-成分-靶點

藥物的成分、預測靶點、潛在藥理靶點、潛在藥理成分數量見表1。郁金、姜黃、蒲黃擁有最多的潛在藥理靶點,分別為17、14、14個;決明子、姜黃、郁金擁有最多的潛在藥理成分,分別為16、15、11個?；ㄉ南┧?arachidonic acid)-蒲黃,具有最多的潛在藥理靶點,為8個。其次,谷氨酸(glutamic acid)-太子參,間羥基苯甲酸(M-hydroxybenzoic acid)-蒲黃,姜黃酮(turmerone)-姜黃、郁金,具有7個潛在藥理靶點。腎上腺素受體β2(adrenoceptor beta 2,ADRB2)與6種藥物存在關系,此外,APOE作為與高脂血癥的相關性評分最高的靶點,是郁金5種成分的預測靶點。

2.3 PPI分析

通過STRING數據庫,在最低相互作用閾值為0.70的標準下,獲得32個靶點76條相互作用數據(6個靶點無相互作用),PPI富集P值小于1.0×10-16,平均度值為4.75(度值表示與某靶點相互作用的其他靶點數量)。該結果表明這些蛋白質,作為整體,至少是部分地生物學上相連接。APOE的度值最高,與其相互作用的其他靶點數量最多,為15個,此外APOE與高脂血癥的相關性評分也最高,提示APOE-郁金可能是重要靶點。胰島素(insulin,INS)、白介素6(interleukin 6,IL6)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、瘦素(leptin,LEP)、過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARA)的度值大于9,分別為14、12、12、10、10。

2.4 GO與KEGG通路富集分析

通過GO與KEGG通路富集分析,獲得顯著富集的181個BPs、19個CCs、25個MFs、23個KEGG通路(P<0.05)。RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正向調控(positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)與基因表達的正向調控(positive regulation of gene expression)是涉及靶點數最多的BP,提示寧脂膠囊可能通過調節DNA轉錄,影響基因表達從而發揮作用。此外,也可能與調節對糖皮質激素的反應(response to glucocorticoid)、對胰島素刺激的細胞反應(cellular response to insulin stimulus)、膽固醇穩態(cholesterol homeostasis)、對乙醇的反應(response to ethanol)、葡萄糖穩態(glucose homeostasis)、MAPK級聯的正向調控(positive regulation of MAPK cascade)、對低氧的反應(response to hypoxia)有關。富集的KEGG通路中,許多通路與高脂血癥有關,如:非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease)、胰島素抵抗(insulin resistance)、脂質和動脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)、膽固醇代謝(cholesterol metabolism)、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)。APOE、NOS3、PPARA分別是膽固醇代謝、cGMP-PKG、PPAR信號通路的關鍵蛋白質。此外,ATP結合盒亞家族A成員1(ATP binding cassette subfamily A member 1,ABCA1)-蒲黃、載脂蛋白C2(apolipoprotein C2,APOC2)-蒲黃、載脂蛋白A2(apolipoprotein A2,APOA2)-何首烏、決明子、蒲黃、前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, PCSK9)-姜黃、 決明子與APOE共同富集在膽固醇代謝信號通路;腎上腺素受體β3(adrenoceptor beta 3,ADRB3)-何首烏、姜黃、蒲黃、郁金、腎上腺素受體β2(ADRB2)-何首烏、荷葉、姜黃、蒲黃、太子參、郁金、胰島素(INS)-何首烏、姜黃、蒲黃、郁金、澤瀉與NOS3共同富集在cGMP-PKG信號通路;脂聯素(adiponectin, C1Q and collagen domain containing,ADIPOQ)-蒲黃、載脂蛋白A2(APOA2)-何首烏、決明子、蒲黃、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activa-ted receptor gamma,PPARG)-何首烏、姜黃、決明子、蒲黃與PPARA共同富集在PPAR信號通路。

2.5 分子對接

APOE、NOS3、PPARA為高脂血癥相關性評分最高的3個靶點,其3D結構.pdb格式文件上傳至SwissDock在線分子對接網站,同時輸入藥物成分ZINC編碼,進行分子對接,獲得結合能數據,結果顯示靶點與相應藥物成分具有較好的結合活性(<-5.00 kcal/mol)。此外,精氨酸(arginine)-太子參、谷氨酸(glutamic acid)-太子參、四羥基紫杉二烯(tetrahydroxytaxadiene)-何首烏與NOS3,花生四烯酸(arachidonic acid)-蒲黃與PPARA,結合能絕對值較低且有氫健形成。

3 討論

臨床研究顯示,寧脂膠囊治療高脂血癥患者總膽固醇(total cholesterol, TC)的總有效率為68.8%,TG的總有效率為83.9%,可升高HDL-C,降低動脈硬化指數,改善血液流變性[5]。動物實驗研究亦證實寧脂膠囊可顯著改善大鼠的血脂譜,且與血脂康相比差異無統計學意義[6]。雖然寧脂膠囊的降脂效果已被證明,但其作用機制尚不明確。本研究結果顯示,寧脂膠囊的潛在藥理成分較多(如:花生四烯酸、間羥基苯甲酸),它們可能通過影響多個核心靶點(如ADIPOQ, APOA2, PPARG, PPARA),作用于血脂相關信號通路(如PPAR信號通路),發揮降脂作用。

寧脂膠囊藥味組成中,姜黃和郁金降脂的潛在藥理成分和靶點較多。姜黃屬(CurcumalongaL.)植物的根莖是“姜黃”來源,塊根是“郁金”來源,二者相似。研究發現,姜黃可以顯著降低血漿中TC,TG,LDL-C濃度,升高HDL-C/LDL-C比值,預防高脂飲食小鼠血漿內鞘脂類化合物的異常升高[7]?；ㄉ南┧峋哂凶疃嗟臐撛谒幚戆悬c?；ㄉ南┧崤c糖脂代謝密切相關,可通過調節肝臟中與脂質代謝相關的基因來改善脂質代謝[8]。

APOE、NOS3、PPARA作為高脂血癥相關性評分最高的3個靶點,蛋白質互作較多,可能是寧脂膠囊發揮降脂作用的關鍵靶點,在未來中藥降脂相關基礎研究中,其可作為優先探索的對象。APOE,介導脂蛋白與特定細胞表面受體結合,在調節脂蛋白從血漿清除方面發揮關鍵作用[9]。分子對接結果提示郁金可能通過作用于APOE,增強血脂的清除,KEGG通路富集結果顯示,何首烏、姜黃、決明子、蒲黃可能與郁金共同作用膽固醇代謝信號通路,降低血CH水平。NOS3,產生一氧化氮,可能通過cGMP-PKG信號通路在高脂血癥個體中上調LDL受體,控制血脂水平[10]。太子參、何首烏可能作用于NOS3發揮作用,荷葉、姜黃、蒲黃、郁金、澤瀉可能與其共同作用cGMP-PKG通路發揮,加強降脂效果。PPARA,參與調節各種外周組織的脂肪酸氧化[11]。PPARA激動劑在人體中有穩定的降脂效果,目前臨床應用的許多降脂藥物為PPARA的激動劑:非諾貝特(fenofibrate)、苯扎貝特(bezafibrate)、氯貝丁酯(clofibrate)、吉非羅齊(gemfibrozil)。蒲黃可能通過激動PPARA,增強脂肪酸氧化,何首烏、姜黃、決明子可能與其共同作用PPAR通路,降低TG水平。

綜上所述,本研究通過網絡藥理學與分子對接技術揭示了郁金、姜黃、蒲黃、決明子是寧脂膠囊降脂的關鍵藥物,APOE、NOS3、PPARA可能是其降脂的關鍵靶點,寧脂膠囊可能通過調節膽固醇代謝、cGMP-PKG、PPAR等信號通路,促進血脂的清除,發揮降血脂作用。本研究是基于網絡藥理學與分子對接技術的初步機制研究,未考慮藥物成分含量高低,所篩選出的靶點需進一步實驗驗證,后續課題組將以此為基礎開展深入研究。