C12ORF66對MYCN擴增的高危神經母細胞瘤細胞的活性調控

賈安娜，戰世佳，張 璇，郭金鑫，于永波，郭永麗，常 艷

國家兒童醫學中心 首都醫科大學附屬北京兒童醫院 兒科重大疾病研究教育部重點實驗室 北京市兒科研究所兒童耳鼻咽喉頭頸外科疾病北京市重點實驗室，北京 100045

神經母細胞瘤(neuroblastoma,NB)是一種最常見的兒童顱外惡性實體瘤,診斷年齡多在5歲前,確診平均年齡約2歲[1]。NB約占兒童惡性腫瘤的7% ～ 8%,病死率占所有兒童腫瘤的15%左右[2]。MYCN擴增NB是一種高度侵襲性NB亞型,在NB的發病機制中,MYCN擴增產生的N-Myc蛋白發揮關鍵作用[3]。然而,由于N-Myc蛋白結構中無藥物“結合口袋”,被認為是無藥可靶向的蛋白質。因此,解析MYCN擴增高危NB中其他高表達基因,探究間接靶向MYCN的新策略具有重要的臨床意義。

12號染色體開放閱讀框66(chromosome 12 open reading frame 66,C12ORF66)作為KICSTOR四元蛋白復合體的一部分,在TORC1信號通路的氨基酸敏感分支中發揮作用[4]。KICSTOR(a four-numbered protein complex composed of the KPTN, IIFG2 C12ORF66,SZT2)是一種溶酶體相關因子,在氨基酸缺乏情況下,對細胞增殖和代謝的中央調節因子雷帕霉素復合物1激酶(rapamycin complex 1 kinase,mTORC1)進行負調控[5-6]。有研究表明,微陣列數據鑒定顯示C12ORF66能夠顯著預測結直腸癌患者的生存[7],揭示C12ORF66在腫瘤進展中可能發揮重要作用,然而C12ORF66對神經母細胞瘤的作用和調控機制還未見報道,亟待進一步的實驗探究。

本研究擬分析MYCN擴增和非擴增NB臨床樣本和細胞系中C12ORF66的表達水平,以及C12ORF66的表達量與患兒預后的相關性。進一步構建C12ORF66敲低MYCN擴增NB細胞株,通過集落形成、Ki67免疫熒光染色、實時無標記細胞分析系統(real time xCELLigence analysis system,RTCA)比較對照組和敲低組細胞活性變化,為MYCN擴增NB的靶向治療提供實驗室依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系:人胚肺成纖維細胞系IMR-90、人永生化視網膜上皮細胞系hTERT RPE-1、MYCN非擴增神經母細胞瘤細胞系CHLA-255 和SH-SY5Y、MYCN擴增神經母細胞瘤細胞系BE(2)-C和SK-N-BE(2)[美國細胞培養物收藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)或國家實驗細胞資源共享服務平臺(National Infrastructure of Cell-line Resource,NICR)]。

1.1.2 試劑(盒):DMEM,MEM,MEM/F-12,Iscove′s DMEM,DMEM/F-12培養基及胎牛血清(Corning公司);青鏈霉素雙抗(北京中科邁晨科技有限公司);胰蛋白酶(江蘇凱基生物技術股份有限公司);實時熒光定量PCR引物(北京六合華大基因科技有限公司);Lipofectamine RNAi MAX 轉染試劑(Invitrogen公司);結晶紫溶液(上海碧云天生物技術有限公司);反轉錄試劑盒(TaKaRa公司);小鼠抗人Ki-67單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:IMR-90細胞置于MEM培養基,hTERT RPE-1細胞置于DMEM/F-12培養基,BE(2)-C細胞置于MEM/F-12培養基,CHLA-255細胞置于Iscove′s DMEM培養基,SK-N-BE(2),SH-SY5Y置于DMEM培養基中培養。培養基中含有10% FBS和1%青鏈霉素雙抗。細胞接種于培養皿中,置于5% CO2,37 ℃培養箱中持續培養,細胞匯合度至80%以上將細胞傳代,0.25%胰蛋白酶消化細胞,800 r/min離心3 min收集細胞,將細胞傳代至新的培養皿中。

1.2.2 R2數據庫分析C12ORF66在NB中的表達:利用R2數據庫(http://r2.amc.nl)GSE16476和GSE49710數據集分析MYCN擴增和非擴增NB患兒中C12ORF66的表達情況,以及C12ORF66的表達與患兒預后生存狀態的關系。

1.2.3 構建瞬時敲低C12ORF66SK-N-BE(2)細胞:將 SK-N-BE(2)細胞接種于含有培養基的6孔板中,細胞匯合度達到30%時,使用Lipofectamine RNAi MAX試劑盒進行siRNA轉染。設置siCtrl對照組和siC12ORF66-1#和siC12ORF66-2#實驗組,siRNA轉染終濃度為60 nmol/L,轉染時間為72 h。靶向序列為GGACCAGTATCCAGCTGTA和GGCC CAATGTCATCATGAT。

1.2.4 構建穩定敲低C12ORF66SK-N-BE(2)細胞株:選擇與siRNA相同的靶序列,構建靶向敲低C12ORF66的慢病毒短發夾RNA(shRNA),shC12ORF66-1#和shC12ORF66-2#。構建C12ORF66敲低質粒,對質粒進行提取純化。培養細胞,當細胞匯合度達到30%時將病毒液和新鮮細胞培養基混勻,加入到目的細胞中。感染24 h后更換新鮮培養基,感染72 h后對感染效果和敲低效果進行測定。

1.2.5 RT-qPCR檢測C12ORF66mRNA表達:采用Frizol法細胞中加入Trizol,再依次加入三氯甲烷、異丙醇、乙醇提取RNA。Nano drop 2000測定RNA濃度和純度。使用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。反轉錄體系為1 μg RNA,5×reverse transcription PCR Mix 2 μL,無RNA酶H2O補足10 μL。以GAPDH為內參,2-ΔΔCt法計算基因在mRNA水平的表達情況。

1.2.6 平板集落形成實驗檢測細胞增殖:將慢病毒感染的細胞以600個/孔(6孔板)的密度接種,5% CO2,37 ℃細胞培養箱中培養,觀察細胞增殖狀態并每隔3 d更換1次培養基。14 d后,顯微鏡觀察細胞團直徑大于1 mm時終止培養。4%多聚甲醛固定細胞并對細胞進行結晶紫染色,顯微鏡下拍照并利用AlphaView SA軟件對細胞集落進行計數。

1.2.7 實時無標記動態細胞分析監測細胞增殖:將5×103細胞接種到E-plate 16孔板中,5% CO2,37 ℃細胞培養箱中培養,通過RTCA細胞功能分析儀對細胞進行實時檢測,100 h后,對結果進行分析并繪制細胞增殖曲線。

1.2.8 免疫熒光檢測細胞Ki67陽性率:將siCtrl對照組和siC12ORF66-1#,siC12ORF66-2#實驗組細胞以3×104接種在預先鋪好玻片的24孔板中,培養48 h后,4%多聚甲醛固定細胞10 min,用PBS沖洗干凈,0.3% Triton X-100冰上打孔,3% BSA室溫封閉1 h。Ki67一抗4 ℃孵育過夜后,加入帶有熒光的二抗孵育1 h。加入Hoechst 33342對細胞核進行染色,染色完成后封片,并置于掃描共聚焦顯微鏡下觀察和圖像采集。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 C12ORF66在MYCN擴增NB樣本中高表達,且與患兒總生存率負相關

與MYCN非擴增的NB樣本相比,C12ORF66在MYCN擴增NB樣本中表達量顯著較高(圖1A, C)。C12ORF66高表達患者的生存率顯著低于C12ORF66低表達患者(圖1B, E)。此外,GSE49710數據集顯示C12ORF66在高危NB中的表達顯著高于非高危NB(圖1D)。

A, C.expression level of C12ORF66 in MYCN amplified(MYCN-amp) or MYCN-non-amp clinical patient samples; B, E.overall survival rate; D.C12ORF66 expression in high-risk and non-high-risk clinical samples; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with the indicated group.

2.2 C12ORF66在MYCN擴增NB細胞中表達量高于MYCN非擴增細胞和正常組織永生化細胞

C12ORF66在MYCN擴增細胞BE(2)-C、SK-N-BE(2)中的表達量顯著高于MYCN非擴增NB 細胞CHLA-255、SH-SY5Y和正常組織永生化細胞IMR-90、hTERT RPE-1(圖2)。

amp.amplified; C12ORF66 mRNA levels in different NB cell lines; *P<0.001 compared with hTERT RPE-1 or IMR-90 group;#P<0.001 compared with CHLA-25 or SH-SY5Y group.

A, B.representative images and statistical plots of Ki67 immunofluorescence staining; *P<0.05, **P<0.001 compared with the siCtrl group (scale bar=20 μm).

A.mRNA expression level of C12ORF66 in SK-N-BE(2) cells was detected by RT-qRCR; B, C.representative photos and statistical plots of SK-N-BE(2) cells colony formation; *P<0.000 1 compared with the shCtrl group.

2.3 瞬時敲低C12ORF66抑制MYCN擴增NB細胞增殖

敲低C12ORF66后,C12ORF66的mRNA表達量顯著降低(圖3A)。與siCtrl組相比, siC12ORF66-1#組和siC12ORF66-2#組結晶紫染色相對面積減小(圖3B, C),伴隨時間進展,C12ORF66敲低組細胞指數顯著降低,細胞增殖能力下降(圖3D)。

2.4 瞬時敲低C12ORF66降低MYCN擴增NB細胞Ki67陽性率

對SK-N-BE(2)細胞進行Ki67免疫熒光染色,與siCtrl組相比,siC12ORF66-1#組和siC12ORF66-2#組Ki67陽性細胞比例均顯著降低(圖 4A, B)。

2.5 穩定敲低C12ORF66抑制MYCN擴增細胞增殖

與shCtrl對照組相比,穩定敲低shC12ORF66-1#組和shC12ORF66-2#組SK-N-BE(2)細胞C12ORF66mRNA表達水平降低(圖5A),集落形成能力降低(圖5B, C)。

3 討論

NB起源于交感神經系統細胞,尤其是腎上腺祖細胞分化的腎上腺嗜鉻細胞和交感神經節細胞[8]。NB患兒的臨床表現、診療、預后等都存在巨大差異,NB可能出現自發消退或者廣泛腫瘤轉移。根據患兒的死亡風險,可以將患兒分為極低危,低危,中危和高危。中低?；純航涍^手術切除、化學治療(化療)甚至自發腫瘤消退,生存率超過90%。然而,高?；純涸诮涍^誘導化療、大劑量化療聯合自體干細胞移植和放療,以及抗雙唾液酸神經節苷脂(disialoganglioside,GD2)和細胞因子的維持治療后,5年生存率仍低于50%[9]。MYCN擴增是神經母細胞瘤不良預后的強指標。在發育分化過程中,MYCN的短暫低表達可以促進神經嵴細胞遷移和神經元命運決定。然而,MYCN在交感腎上腺譜系中持續高表達會導致交感母細胞增生甚至神經母細胞瘤形成。神經母細胞瘤風險組分期系統(International Neuroblastoma Risk Group Staging System,INRGSS)顯示,NB細胞中一旦檢測到MYCN擴增,就會被劃分為高危[10-11]。本研究旨在分析MYCN擴增高危NB與非擴增NB的差異表達基因,并通過細胞水平功能實驗探究,為MYCN擴增NB的治療提供實驗依據。

本研究通過對臨床數據庫分析,發現C12ORF66在MYCN擴增高危NB中高表達,并且MYCN擴增與患者的不良預后相關。NB細胞結果顯示,C12ORF66在MYCN擴增NB細胞中的表達顯著高于MYCN非擴增NB細胞和正常組織永生化人源細胞。MYCN擴增NB細胞SK-N-BE(2)的集落形成、RTCA、Ki67免疫熒光染色結果表明,敲低C12ORF66顯著抑制MYCN擴增NB細胞活性,提示C12ORF66在MYCN擴增NB發生發展中發揮重要作用,C12ORF66與MYCN擴增NB腫瘤進程負向相關。C12ORF66作為KICSTOR的成分,定位于溶酶體,與mTORC1負向調控子GATOR1(GTPase activating protein for RasA)復合體結合并將其招募到溶酶體膜表面,影響細胞的增殖、自噬。研究表明,KICSTOR復合體的另一成分SZT2(seizure threshold 2)缺乏,會影響包括腦部神經在內幾個組織中mTOR信號的激活[12]。KICSTOR復合體及其成分C12ORF66在腫瘤發生發展中的作用均鮮有報道,本研究重點關注C12ORF66調控NB細胞活性的研究,為靶向C12ORF66的腫瘤治療提供了理論基礎。

綜上,本研究結合臨床數據庫和功能實驗,發現C12ORF66在MYCN擴增NB中高表達,且與患兒的較差生存率密切相關;細胞水平的功能實驗表明,敲低C12ORF66抑制MYCN擴增NB細胞活性,C12ORF66有望成為NB進展的標志分子和潛在治療靶點。